非小細(xì)胞肺癌患者瘦素、OB-Rb、VEGF的表達(dá)及其臨床意義

孫雷雷，車淑玉，于洪升，蔣捍東

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東青島266003)

瘦素是肥胖基因編碼的蛋白產(chǎn)物，其可通過特異性激活瘦素受體(OB-Rb)，參與調(diào)節(jié)能量平衡、生殖、免疫及代謝等多種生理過程。近年研究表明，瘦素和OB-Rb(b型)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其可能參與腫瘤血管生成。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)作為重要的正向調(diào)節(jié)因子參與微血管生成。為探討非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者瘦素、OBRb、VEGF表達(dá)及其臨床意義，我們進(jìn)行了相關(guān)研究?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2004年4月～2005年7月在我院胸外科經(jīng)手術(shù)和病理證實(shí)的NSCLC患者30例，男17例、女13例，年齡47～73歲、中位年齡59歲。其中鱗癌13例，腺癌17例;肺癌TNM分期Ⅰ期12例，Ⅱ期8例，Ⅲ期10例;有、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者分別為11、19例。均無糖尿病及其他代謝性疾病，未行放、化療。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法 將患者手術(shù)切除的石蠟切片標(biāo)本常規(guī)脫蠟、水化后，置枸櫞酸緩沖液中經(jīng)微波修復(fù)抗原，采用PV-6000二步法、免疫組化染色試劑盒說明書檢測NSCLC組織及其癌旁正常組織的瘦素、OB-Rb和VEGF。以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照，脂肪組織的染色結(jié)果為陽性對(duì)照。瘦素兔抗人多克隆抗體、OB-Rb羊抗人多克隆抗體(工作濃度1∶50)購自北京中杉金橋生物公司。

1.2.2 瘦素、OB-Rb和VEGF表達(dá)判定 每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，取其平均值作為陽性表達(dá)數(shù)。陽性細(xì)胞染色以細(xì)胞質(zhì)為主，可見棕黃色顆粒。參照文獻(xiàn)［1］制定免疫組化半定量標(biāo)準(zhǔn)，先對(duì)染色強(qiáng)度記分:0分為無色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色;再對(duì)陽性細(xì)胞所占百分比記分:0分為無著色細(xì)胞，1分為陽性細(xì)胞＜10%，2分為陽性細(xì)胞10% ～50%，3分為陽性細(xì)胞51% ～75%，4分為陽性細(xì)胞＞75%。染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比乘積＞3分為免疫反應(yīng)陽性，≤3分為陰性。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，瘦素、OB-Rb、VEGF表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系用χ2檢驗(yàn)、Fisher精確檢驗(yàn)，相關(guān)分析用 Spearman相關(guān)性分析;用Cox回歸模型進(jìn)行多因素預(yù)后分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 瘦素、OB-Rb、VEGF 在 NSCLC、癌旁正常組織中的表達(dá) 在NSCLC、癌旁正常組織中，瘦素陽性表達(dá)位于細(xì)胞質(zhì)，可見棕黃(褐)色染色，瘦素陽性者分別為21(70.0%)、6 例(20.0%)，兩者陽性率比較P＜0.05;OB-Rb陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)，部分表達(dá)在細(xì)胞膜，可見棕黃(褐)色染色，OB-Rb陽性者分別為22(73.3%)、13 例(43.3%)，兩者陽性率比較P＜0.05;VEGF陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞膜呈彌散或局灶分布，可見棕黃(褐)色染色，VEGF 陽性者分別為28(93.3%)、8 例(26.7%)，兩者陽性率比較P＜0.05。

2.2 瘦素、OB-Rb、VEGF表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系 Fisher精確檢驗(yàn)顯示，在NSCLC組織中，瘦素、OB-Rb、VEGF表達(dá)與其病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期均無相關(guān)性(P均＞0.05)。

2.3 相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)性分析顯示，NSCLC組織中的瘦素與OB-Rb、OB-Rb及VEGF表達(dá)均呈正相關(guān)(r分別為 0.428、0.443，P 均 ＜0.05)。

2.4 瘦素、OB-Rb表達(dá)與NSCLC預(yù)后的關(guān)系 術(shù)后隨訪6～60個(gè)月，NSCLC患者的5 a生存率為43.3%，其中瘦素陰性、陽性患者分別為77.8%、33.3%，瘦素陽性患者的生存率明顯低于陰性患者(P＜0.05);OB-Rb陰性、陽性患者分別為62.5%、40.9%，OB-Rb陽性患者的生存率低于陰性患者(P＜0.05)。多因素Cox回歸分析顯示，TNM分期、瘦素是影響NSCLC預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素(P＜0.05)，OB-Rb、VEGF表達(dá)與其預(yù)后無相關(guān)性(P＞0.05)。

3 討論

1994年，Zhang等［2］成功克隆了小鼠的肥胖基因及人類同源序列，闡明了肥胖基因蛋白產(chǎn)物瘦素的分子結(jié)構(gòu)和生理作用。Stavros等［3］研究發(fā)現(xiàn)，瘦素在體內(nèi)有促血管形成作用;瘦素與瘦素中和抗體結(jié)合后，其促血管生成作用消失。Ponnandai等［4］提出，瘦素還有促腫瘤生長的作用。瘦素發(fā)揮作用需通過OB-Rb，OB-Rb屬Ⅰ類細(xì)胞因子家族，廣泛分布于中樞和外周組織。1999年，Takahumi等［5］采用RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)肺組織中存在OB-Rb b型。OBRb不含內(nèi)源性酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，其通過JAK/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子(STAT)途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮作用［6］。JAK/STAT途徑是多種細(xì)胞因子和生長因子與其相應(yīng)受體結(jié)合后，激活JAK等酪氨酸激酶，使STAT磷酸化;然后形成二聚體轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核中，與DNA上的靶基因結(jié)合，激活靶基因轉(zhuǎn)錄。Hakansson-Ovesjo等［7］研究發(fā)現(xiàn)，瘦素缺陷小鼠的STAT蛋白表達(dá)下調(diào)。近年研究證明［8］，瘦素和OB-Rb在宮頸癌、結(jié)直腸癌、NSCLC等惡性腫瘤組織中表達(dá)，提示二者與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。另有研究證實(shí)，血管生成在腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移中起重要作用，誘導(dǎo)血管生成可促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，當(dāng)腫瘤生長至2 mm3時(shí)，如缺乏新生血管提供營養(yǎng)，則腫瘤細(xì)胞停止增殖。Enzo等［9］提出，VEGF作為重要的正向調(diào)節(jié)因子，參與NSCLC的微血管生成，在其發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起重要作用。Niu等［10］用染色質(zhì)免疫沉淀法發(fā)現(xiàn)，STAT3蛋白在體內(nèi)結(jié)合于VEGF啟動(dòng)子后，VEGF啟動(dòng)子上的STAT3蛋白結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變，可致后者介導(dǎo)的VEGF活性消失;體內(nèi)STAT3蛋白活性增強(qiáng)可上調(diào)VEGF表達(dá)，促進(jìn)血管生成;反之，可阻斷STAT3蛋白信號(hào)傳導(dǎo)，下調(diào)VEGF表達(dá)。胥文春等通過免疫組化檢測證實(shí)，NSCLC組織中的STAT3蛋白與VEGF陽性表達(dá)呈顯著正相關(guān)。由此推斷，瘦素通過JAK/STAT途徑上調(diào)VEGF表達(dá)，后者促進(jìn)腫瘤血管生成，在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC組織中瘦素、OB-Rb、VEGF的陽性表達(dá)率顯著高于癌旁正常組織，提示三者在NSCLC組織中呈異質(zhì)性高表達(dá)，且在肺癌發(fā)生過程中有活躍的血管增殖;并發(fā)現(xiàn)瘦素與OB-Rb、OB-Rb與VEGF有相關(guān)性，證實(shí)瘦素與OB-Rb結(jié)合后可能通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)上調(diào)VEGF表達(dá)，通過VEGF高表達(dá)促進(jìn)NSCLC組織中的血管生成。本研究還顯示，NSCLC組織中的瘦素、OB-Rb、VEGF表達(dá)與患者的性別、病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期均無明顯關(guān)系，提示檢測NSCLC組織中的瘦素、OB-Rb表達(dá)對(duì)判斷其惡性程度及病情轉(zhuǎn)歸無明顯價(jià)值。本研究隨訪顯示，NSCLC患者的5 a生存率為43.3%，TNM分期和瘦素陽性是影響其預(yù)后的獨(dú)立因素，提示對(duì)NSCLC患者行瘦素檢測有助于評(píng)估其預(yù)后。

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