紡錘體毒物檢測新方法的建立和應(yīng)用

鄭 璐，王 瓊

紡錘體毒物（SP）是一種非遺傳毒物，其作用終點并不是遺傳物質(zhì)本身，而是細(xì)胞分裂中的紡錘體[1]。因而SP不能被現(xiàn)行的基因突變、染色體畸變試驗檢出，但SP與一般誘變劑的效應(yīng)是相同的，最終會引發(fā)癌變等嚴(yán)重后果。由此，筆者根據(jù)SP的作用終點及其誘變效應(yīng)，經(jīng)過反復(fù)優(yōu)化，建立了檢測SP的不同實驗方法。根據(jù)國內(nèi)外文獻報道，選擇了偏二甲基肼、雌二醇、利血平、糖精、石棉、秋水仙堿為被檢物，它們均有確定的致癌性，但它們的短期致突變試驗均未獲得滿意的結(jié)果[2-4]。應(yīng)用新建立的方法對其誘變活性進行了檢測，證明該方法靈敏可靠，從而為防止SP漏檢提供了實用、有效的檢測手段?，F(xiàn)將檢測工作報告如下。

1 紡錘體形態(tài)損傷的直接觀察

首先，借鑒國外先進的經(jīng)驗摸索建立了分化染色技術(shù)[5，6]。該技術(shù)方法的創(chuàng)新點是用番紅和燦爛藍(lán)復(fù)合染液將有絲分裂細(xì)胞的染色體、細(xì)胞質(zhì)、紡錘絲染成不同顏色，這樣在一個完整的細(xì)胞中同時顯示紡錘體和與之相連的染色體。用這種方法能較容易地分析大量的有絲分裂細(xì)胞，使得直接觀察紡錘體形態(tài)及損傷成為可能。應(yīng)用該技術(shù)方法對所選擇的6種被檢物進行了檢測，隨著培養(yǎng)液中濃度的增加，各種形態(tài)異常的紡錘體明顯增加，呈現(xiàn)良好的劑量效應(yīng)關(guān)系。高染毒量完全破壞了紡錘體結(jié)構(gòu)。

2 誘發(fā)非整倍體的檢測

紡錘體損傷必然導(dǎo)致整條染色體丟失或增加，即誘發(fā)非整倍體。筆者用3種實驗方法對其進行了檢測。

2.1 完整中期細(xì)胞染色體計數(shù)法 這是根據(jù)非整倍體的定義而設(shè)計的。該方法的創(chuàng)新點之一：檢測目的性十分明確，通過直接計數(shù)染色體數(shù)目的變化來反映SP誘發(fā)非整倍體的活性。創(chuàng)新點之二：常規(guī)中期相標(biāo)本制備中，低滲處理較強，破壞了細(xì)胞膜，造成染色體人為丟失。為了避免這種人為誤差，筆者采用了減弱低滲處理的實驗條件。對低滲濃度和處理時間進行了反復(fù)摸索，最終確定以0.094M（0.7%）KCL溶液低滲處理2～3 min的最佳實驗條件。獲得了細(xì)胞膜完整、細(xì)胞質(zhì)背景清楚、染色體分散良好的中期相。保證了染色體計數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性。應(yīng)用該方法對6種被檢物進行了檢測，觀察到CHL細(xì)胞染色體數(shù)目發(fā)生了明顯的變化，染色體數(shù)目增加和減少的發(fā)生概率相近，而且所形成的非整倍體多為增加或減少1條染色體。

2.2 胞質(zhì)分裂阻滯微核（CBMN）試驗 紡錘體損傷誘發(fā)非整倍體的效應(yīng)可用微核試驗來驗證。該技術(shù)方法的創(chuàng)新點在于使用了CBMN法：CHL培養(yǎng)物染毒的同時加入Cyt-B阻斷胞質(zhì)分裂，第一次分裂細(xì)胞均形成雙核細(xì)胞，在分析時很容易識別，只計數(shù)雙核細(xì)胞的微核率，提高了試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。CBMN試驗結(jié)果表明6種被檢物均誘導(dǎo)細(xì)胞微核率明顯增加。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)測量 染色體數(shù)目的變化必然使細(xì)胞內(nèi)DNA含量改變。用流式細(xì)胞術(shù)測定每個細(xì)胞的DNA含量，給出細(xì)胞周期各期所占比例 （G0/G1）和DNA信號的分散度（CV），從分子水平檢測到SP誘發(fā)非整倍體效應(yīng)。

美、日、歐共體及我國現(xiàn)行的新藥臨床前致突變試驗組合中，仍沒有一項專門檢測SP的試驗。SP損傷紡錘體后會出現(xiàn)嚴(yán)重的遺傳效應(yīng)，使染色體丟失，造成子細(xì)胞染色體數(shù)目的改變，產(chǎn)生非整倍體，使基因產(chǎn)物不平衡，引發(fā)癌癥等嚴(yán)重后果。建立有效的檢測SP試驗方法勢在必行。

3 結(jié) 論

應(yīng)用分化染色技術(shù)方法直接觀察紡錘體形態(tài)損傷，雖然能檢測出秋水仙堿、糖精、雌二醇、石棉、硝酸鉛、偏二甲基肼的初始誘變作用，但這種實驗技術(shù)方法復(fù)雜，難度也較大[7]。CBMN試驗也獲得陽性結(jié)果，流式細(xì)胞術(shù)雖然也能檢出非整倍體的發(fā)生，但靈敏性不夠高[8]。完整中期細(xì)胞染色體計數(shù)可以直觀、準(zhǔn)確地檢查出它們誘發(fā)染色體數(shù)目異常。且該實驗方法很簡便，在一般實驗室均可進行，因此筆者建議，將此方法推薦為篩檢SP的試驗方法。

[1]樓鐵拄，王 瓊，高沛永.偏二甲基肼誘發(fā)中國倉鼠肺細(xì)胞非整倍體[J].中國藥理與毒理學(xué)雜志，1997，11(4):304.

[2]高沛永，王 瓊，張學(xué)中，等.雌二醇誘發(fā)中國倉鼠肺細(xì)胞有絲分裂紡錘體損傷[J].中國藥理與毒理學(xué)雜志，1994，8(4):301-304.

[3]王 瓊 高沛永.偏二甲基肼誘發(fā)中國倉鼠肺細(xì)胞有絲分裂紡錘體損傷[J].中國藥理與毒理學(xué)雜志，1998，12(3)：239-240.

[4]Cliet I.Fournier E.Melcion C.Cordier A.In vivo micronucleus test using mouse hepatocytes[J].Mntat Res,1989,216(6):321-326.

[5]Salassidis K,Bauchingerg M.Mitotic spindle damage induced by 3,4-dichloroaniline in V97 Chinese hamster cell examined by differential staining of the spindle apparatus and chromosomes[J].Mutagenesis,1990,5(4):367-370.

[6]高沛永.在致突變試驗中應(yīng)重視對紡錘體毒物的檢測[J].遺傳，1993，15(6):38-39.

[7]高沛永，王 瓊.硝酸鉛對CHL有絲分裂細(xì)胞紡錘體的損傷作用[J].衛(wèi)生毒理雜志，1995，9(4):228-2230.

[8]高沛永，王 瓊.秋水仙堿引起CHL細(xì)胞有絲分裂紡錘體損傷的觀察[J].軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，1993，17(4):259-261.