牛乳乳清蛋白過(guò)敏性研究進(jìn)展

李 慧，劉小翠

（大同大學(xué)農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山西大同 037009）

食物過(guò)敏是世界各地普遍存在的一個(gè)嚴(yán)重問(wèn)題。近年來(lái)，食物過(guò)敏的發(fā)病率逐年增加，食物過(guò)敏這一食源性疾病已引起廣大食品消費(fèi)者、生產(chǎn)者和研究者普遍關(guān)注。Helm等[1]指出，有1%～2%的成年人和高達(dá)8%的嬰兒都產(chǎn)生過(guò)食物過(guò)敏。據(jù)報(bào)道，有8類食物經(jīng)常引起過(guò)敏反應(yīng)，占總過(guò)敏案例90%以上，它們分別為蛋、牛奶、魚(yú)類、甲殼類動(dòng)物、花生、大豆、核果類食物及小麥[2]。研究表明，食物過(guò)敏輕者可引起皮膚、胃腸道過(guò)敏癥狀，重者可致哮喘發(fā)作、休克甚至死亡[3]。

牛奶是優(yōu)質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)食品，但同時(shí)也可能會(huì)產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)，其過(guò)敏原主要是牛奶蛋白質(zhì)。牛奶中含有多種蛋白質(zhì)，其中，乳清蛋白中的β-乳球蛋白是引起牛乳過(guò)敏的主要成分，其次為α-乳白蛋白，此外，牛血清白蛋白也能夠引起食物過(guò)敏[4-5]。牛奶過(guò)敏會(huì)影響蛋白質(zhì)的正常消化吸收，嚴(yán)重影響嬰幼兒的健康成長(zhǎng)。

1 乳清蛋白的組成

乳清蛋白（Whey protein）是牛奶中的一種主要蛋白質(zhì)，其含量?jī)H次于酪蛋白，占牛奶中蛋白質(zhì)含量的18%～20%。乳清蛋白包括β-乳球蛋白（β-Lactoglobulin，β-Lg）、α- 乳白蛋白（α-Lactalbumin，α-La）、血清白蛋白（BSA）、免疫球蛋白（IgG）、乳鐵蛋白、糖基肽及一些生長(zhǎng)因子[6]。其中，β-Lg和α-La是乳清蛋白的主要成分。乳清蛋白中的組分基本為球狀蛋白質(zhì)，其組分的一級(jí)結(jié)構(gòu)、部分二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)已經(jīng)研究清楚。

2 乳清蛋白的過(guò)敏性

2.1 α-乳白蛋白與食物過(guò)敏

α-La在所有哺乳動(dòng)物乳中均存在，在牛乳清蛋白中的含量為19.7%，在人乳中含量較高。牛乳中的α-La是由123個(gè)氨基酸殘基組成的結(jié)構(gòu)緊密的單體球蛋白。盡管牛的α-La與人乳中74%的氨基酸序列完全相同，6%的化學(xué)性質(zhì)相同[7]，但是仍然被認(rèn)為是牛奶中主要的過(guò)敏原[8]。α-La中的60-80，91-96片段通過(guò)二硫鍵連接形成環(huán)狀。動(dòng)物試驗(yàn)表明，這部分是最容易引起過(guò)敏的結(jié)構(gòu)[9]。然而，用胰蛋白酶水解的α-La片段對(duì)19個(gè)過(guò)敏患者進(jìn)行試驗(yàn)表明，60-80，91-96這2部分肽段對(duì)于人免疫球蛋白E（IgE）并不是最主要的過(guò)敏原[10]。未改性的α-La和大量肽段容易與IgE結(jié)合，說(shuō)明其具有重要的抗原決定部位構(gòu)象。但對(duì)59-94部位的肽段降解后發(fā)現(xiàn)，其與IgE結(jié)合的能力比未改性的片段更高，這是由于抗原決定部位在蛋白質(zhì)改性的過(guò)程中暴露而引起的[7]。此外，與IgE結(jié)合的部位主要位于α-La的疏水區(qū)域（如99-108）和分子內(nèi)部（如17-58 和 109-123）。其中，17-58，109-123 片段與人的α-La有非常相似的序列，分別占α-La的 81%和 87%[11]。

2.2 β-乳球蛋白與食物過(guò)敏

β-Lg是牛乳清中的主要蛋白質(zhì)，其單體是由162個(gè)氨基酸殘基折疊成的緊密球狀結(jié)構(gòu)，約占乳清蛋白的43.6%，人乳中不含有。有資料表明，β-Lg是牛奶中最容易引起過(guò)敏的蛋白質(zhì)。Hattori等[12]研究表明，乳蛋白過(guò)敏的人中有82%的人對(duì) β-Lg過(guò)敏。Selo等[13]指出，β-Lg分子上分布有許多抗原決定部位。其中，一些是直鏈的氨基酸序列，而另一些引起免疫反應(yīng)的結(jié)構(gòu)是非常大的片段，可能包括抗原決定簇的構(gòu)象或部分抗原決定簇。β-Lg中最容易引起過(guò)敏的片段是41-60，102-124和149-162的氨基酸序列，90%以上的病人都會(huì)對(duì)這些片段產(chǎn)生過(guò)敏，它們占到乳球蛋白與IgE總反應(yīng)的10%～15%。149-162的碳端肽段形成彎狀結(jié)構(gòu)，這部分主要包括一些短的α-螺旋結(jié)構(gòu)，晶體結(jié)構(gòu)很容易發(fā)生變化。而102-124及41-60的片段則在氫鍵和二硫鍵的作用下形成穩(wěn)定的環(huán)狀，分布在分子表面，很容易和抗體結(jié)合[14]。此外，還有一些肽段也容易引起過(guò)敏，但其過(guò)敏性比上述肽段低。1-8，25-40及92-100的肽段會(huì)使52%～65%的病人血清產(chǎn)生過(guò)敏；40%患者的血清對(duì)9-14，84-91的肽段產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)；72-83，125-135的肽段會(huì)引起少數(shù)人過(guò)敏。值得注意的是，氨基酸序列124-134是β-Lg親水部位，位于分子表面且具有很強(qiáng)的免疫反應(yīng)性[15]。Ball等[16]研究表明，84-91 的肽段并不在β-乳球蛋白分子的表面，但是仍有大約40%的人對(duì)其過(guò)敏。其他的2個(gè)肽段9-14及92-100沒(méi)有暴露在分子表面，而且不容易被酶解，因此，它們的免疫活性較小[13]。用溴化氫將8-24的肽段降解，發(fā)現(xiàn)9-14序列與IgE結(jié)合的特異性顯著降低，表明15-24是引起過(guò)敏的主要片段。用溴化氫將25-107的序列降解成小肽 25-40，41-60，78-83，84-91 和 91-100，發(fā)現(xiàn)66%的血清中并未降低其與IgE結(jié)合的能力。這表明在這段序列上至少有5個(gè)不同的抗原決定部位[7]。

3 乳清蛋白的改性

清除或降低乳中過(guò)敏原最有效的方法是將過(guò)敏原物質(zhì)完全分離去除。將β-Lg去除后可以模擬人乳，并且這種方法可以用于生產(chǎn)嬰兒配方牛奶，但是這種方法費(fèi)用很大，實(shí)際生產(chǎn)中很難實(shí)施[17]。因此，目前主要通過(guò)蛋白質(zhì)改性的方法來(lái)控制和消除乳清蛋白中的過(guò)敏原。蛋白質(zhì)的改性方法主要是利用物理因素（如熱、射線、機(jī)械振蕩等）、化學(xué)因素（如化學(xué)試劑等）或酶制劑使蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)破壞，多肽鏈及氨基酸殘基發(fā)生某種變化。目前，常見(jiàn)的乳清蛋白改性方法主要有加熱處理、糖基化反應(yīng)、發(fā)酵及酶解等。

3.1 加熱處理（Heat treatment）

加熱處理主要是使蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生變化，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)展開(kāi)，二硫鍵斷裂。對(duì)β-Lg加熱改性的研究表明，改性后的β-Lg在前腸黏膜的反應(yīng)加強(qiáng)，從而改變了β-Lg的免疫學(xué)性質(zhì)[18]。Kleber等[19]通過(guò)90℃熱處理β-Lg，證明了在熱處理β-Lg變性聚膠同時(shí)，β-Lg的抗原決定簇的活性被明顯掩蓋，從而使β-Lg的致敏性明顯降低，這種方法可以在一定程度上減少β-Lg的致敏性。但由于加熱過(guò)程中蛋白質(zhì)與乳糖形成復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，將會(huì)增加賴氨酸的損失，降低蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[20]，而且加熱后使牛奶產(chǎn)生一定的蒸煮味，從而影響感觀特性。同時(shí)，對(duì)牛乳進(jìn)行加熱處理也會(huì)使一些具有生物活性的免疫因子如免疫球蛋白等受到破壞。

3.2 糖基化改性（Glycosylation）

糖基化作用就是將碳水化合物以共價(jià)鍵與蛋白質(zhì)分子上的α或ε-氨基相連接而形成糖基化蛋白的化學(xué)反應(yīng)。研究表明，通過(guò)糖基化改性的β-Lg，其過(guò)敏性有效降低，而且提高了其熱穩(wěn)定性和乳化特性。Makoto等[21]以葡聚糖、葡萄糖胺、殼戊糖和殼聚糖為糖基供體，通過(guò)美拉德反應(yīng)對(duì)β-Lg的糖基化改性進(jìn)行了研究，ELISA免疫試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以殼聚糖和葡聚糖為糖基供體的糖基化反應(yīng)能明顯降低β-Lg的過(guò)敏性，而且糖基化的β-Lg乳化特性比原β-Lg有明顯提高。Tomomi等[22]通過(guò)將β-Lg與殼聚糖（Chitosan）按1∶1或1∶2的比例結(jié)合，經(jīng)過(guò)分析可以在一定程度上降低β-Lg的致敏性，并且基本上保留了β-Lg的生物活性，其中，第2種比例比第1種效果好。但Leonil等[23]研究發(fā)現(xiàn)，糖基化的β-Lg的46-61的肽段是抗原決定部位。而且糖基化改性會(huì)影響蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值甚至安全性[24]。糖基化會(huì)破壞必需氨基酸，尤其是造成賴氨酸的較大損失，而且小腸對(duì)改性蛋白的消化吸收降低也造成營(yíng)養(yǎng)價(jià)值損失。關(guān)于糖基化蛋白的許多毒理學(xué)資料是以體外試驗(yàn)為基礎(chǔ)，而體外試驗(yàn)的資料與體內(nèi)試驗(yàn)影響相關(guān)性研究不多，因此，糖基化蛋白的安全性還不能得到證實(shí)[25]。

3.3 發(fā)酵（Fermentation）

Jedrychowski等[26]研究表明，牛奶經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后乳清蛋白的過(guò)敏性比原來(lái)降低了99%，但β-Lg和α-La的過(guò)敏性并沒(méi)有消除，只是減弱了。而且牛乳發(fā)酵后呈酸味，不宜加熱，嬰幼兒不容易接受。

3.4 酶解（Proteolysis）

蛋白酶催化乳清蛋白水解是降低過(guò)敏反應(yīng)的一種有效方法。蛋白酶通過(guò)水解乳清蛋白的抗原決定部位，可以消除或降低其抗原性，降低牛乳過(guò)敏反應(yīng)。不同的蛋白酶具有不同的特異性，因此，隨著所采用酶的不同及酶解條件的不同，酶解產(chǎn)物及抗原性的降低也有所不同。常用于乳清蛋白酶解的酶制劑主要有：胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶，此外還有關(guān)于Corolase、陰離子蛋白酶等酶解乳清蛋白的報(bào)道。隨著使用酶的種類不同，酶解位點(diǎn)、酶解率及酶解產(chǎn)物也有較大的差異。乳清蛋白由于具有二硫鍵，不易被消化酶即胃蛋白酶和胰蛋白酶水解，乳清蛋白的不易消化性是造成其容易引起過(guò)敏的原因[27]。

Ena等[4]研究表明，用胃蛋白酶和Corolase PP結(jié)合水解能夠徹底去除乳球蛋白和牛血清白蛋白的抗原決定部位，而用Corolase 7092酶解則幾乎對(duì)其抗原部位沒(méi)有影響。Penas等[28-30]通過(guò)酶水解與高壓相結(jié)合處理乳清蛋白溶液，以降低β-Lg的致敏性，試驗(yàn)選用了4種酶（Alcalase，Neutrase，Corolase 7089 和 Corolase PN-L）并最終確定最佳結(jié)果的2種酶和相應(yīng)條件（Corolase P N-L，40 ℃，15 min，300 MPa；Neutrase，50 ℃，15 min，300 MPa），通過(guò) ELISA 檢測(cè)，試驗(yàn)降低了β-Lg的大部分致敏性。Bonomi等[31]通過(guò)酶水解與高壓結(jié)合處理乳清蛋白溶液，試驗(yàn)選用了菠蘿蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、胰島素和胰凝乳蛋白酶，最終確定胰島素和胰凝乳蛋白酶有較高的抗壓活性，可在合適的高壓處理下同時(shí)使用（600 MPa，10 min，pH 值為 6.8，酶解溫度為 30，37，44 ℃），對(duì)于β-Lg致敏性消除效果很好。對(duì)酶解產(chǎn)物分析發(fā)現(xiàn)，乳清蛋白的過(guò)敏性與酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量有關(guān)。Van Berestijn等[32]研究表明，引起I型過(guò)敏反應(yīng)片段的最小分子質(zhì)量為3 000～5 000 Da。Ena等[4]報(bào)道指出，分子質(zhì)量小于3 400 Da的肽段不會(huì)引發(fā)IgE介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)。Van Hoeyveld等[33]指出，分子質(zhì)量大于2 600 Da的肽段會(huì)引發(fā)皮膚的過(guò)敏反應(yīng)，而小于1 400 Da的肽段則不會(huì)，體外試驗(yàn)中能與IgE結(jié)合的最小分子質(zhì)量范圍為970～1 400 Da。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

乳清蛋白由于具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及功能特性[34]，一直以來(lái)被廣泛的應(yīng)用于食品工業(yè)。但乳清蛋白又是一種常見(jiàn)的過(guò)敏原，為了建立低過(guò)敏的水解模式，需要了解乳清蛋白的結(jié)構(gòu)與免疫反應(yīng)的關(guān)系、引起過(guò)敏的抗原決定部位的特點(diǎn)及其與IgE結(jié)合的部位。通過(guò)蛋白質(zhì)改性的方法可以控制和消除乳清蛋白的過(guò)敏性，而且蛋白質(zhì)改性能夠使其功能特性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值也得到改善。

乳清蛋白的酶法改性是降低過(guò)敏反應(yīng)最有效的方法，因此，酶水解將會(huì)是今后研究的重點(diǎn)。目前，針對(duì)乳清蛋白過(guò)敏患者，通過(guò)蛋白質(zhì)改性的方法開(kāi)發(fā)低過(guò)敏或無(wú)過(guò)敏的乳制品將會(huì)被更多的應(yīng)用于商業(yè)生產(chǎn)中，具有廣闊的前景。

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