氯沙坦對(duì)自發(fā)性2型糖尿病KKAy小鼠腎臟損害的保護(hù)作用

劉曉丹，范秋靈，王力寧，楊 剛，姚 麗，馬健飛(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，沈陽(yáng)110001)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病最常見(jiàn)的并發(fā)癥，是導(dǎo)致終末期腎病的主要病因之一。血管緊張素受體拮抗劑(ARB)氯沙坦能夠阻斷腎素—血管緊張素系統(tǒng)(RAS)，延緩DN的進(jìn)程。由于動(dòng)物模型的限制，氯沙坦對(duì)于DN早期損害的研究鮮有報(bào)道。自發(fā)性2型糖尿病KKAy小鼠是研究糖尿病早期腎臟損害的理想動(dòng)物模型。2009年11月～2010年6月，本研究通過(guò)觀察氯沙坦對(duì)KKAy小鼠尿白蛋白排泄量及腎臟病理改變的影響，明確氯沙坦在糖尿病早期腎損害中的治療作用，為DN發(fā)病機(jī)制的研究及臨床治療提供實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 SPF級(jí)雄性8周齡KKAy小鼠20只和雄性8周齡C57BL/6小鼠10只，分別購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所和中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部。飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部SPF級(jí)動(dòng)物房，單籠飼養(yǎng)，溫度(23±3)℃，濕度50% ±20%，每12 h交替照明。將20只KKAy小鼠隨機(jī)分為治療組(n=10)和非治療組(n=10)，均給予高脂飲食喂養(yǎng)，其中治療組從8周齡始予以氯沙坦(氯沙坦原藥粉末由默沙東公司提供)10 mg/(kg·d)飲水喂入，監(jiān)測(cè)小鼠體質(zhì)量及飲水量變化情況，動(dòng)態(tài)調(diào)整氯沙坦給藥濃度，非治療組予以普通飲水。C57BL/6小鼠作為正常對(duì)照組，給予普通飼料及飲水。所有小鼠自由進(jìn)食、飲水。

1.2 檢測(cè)方法 ①體質(zhì)量測(cè)定:定期應(yīng)用電子臺(tái)秤測(cè)定小鼠體質(zhì)量;②隨機(jī)血糖檢測(cè):于20周齡尾靜脈取血測(cè)血糖(德國(guó)羅氏樂(lè)康全血糖儀及試紙)。隨機(jī)血糖≥13.9 mmol/L確定為糖尿病小鼠。③尿微量白蛋白、尿肌酐檢測(cè):于20周齡采用提尾反射法收集各組小鼠隨機(jī)尿液，采用ELASA試劑盒(購(gòu)于美國(guó)RB公司)檢測(cè)尿微量白蛋白和尿肌酐，計(jì)算尿微量白蛋白/肌酐比率。④腎臟形態(tài)學(xué)觀察:于20周齡處死小鼠后，立即留取腎臟皮質(zhì)，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，行HE染色，PAS染色，普通光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟病理變化。同時(shí)留取腎臟標(biāo)本，快速于2.5%戊二醛中固定，透射電鏡下觀察腎臟超微結(jié)構(gòu)的變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS15.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以±s表示，組間比較采用方差分析。P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量與血糖 隨著周齡的增長(zhǎng)，KKAy小鼠和對(duì)照組C57BL/6小鼠的體質(zhì)量均逐漸增加，各周齡KKAy小鼠的體質(zhì)量均高于對(duì)照組(P＜0.05)，KKAy非治療組與治療組的體質(zhì)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。20周齡隨機(jī)血糖測(cè)定，KKAy治療組為(30.41±3.83)mmol/L，KKAy非治療組為(29.62±3.99)mmol/L，對(duì)照組為(11.07 ±1.26)mmol/L，KKAy治療組和非治療組的隨機(jī)血糖水平均高于對(duì)照組(P＜0.05)，而KKAy治療組與非治療組的血糖水平之間則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.2 尿白蛋白/肌酐比率 20周齡KKAy治療組、KKAy非治療組、對(duì)照組尿蛋白/肌酐比率分別為539.71±100.23、728±177.19和 49.37±18.77，KKAy小鼠的尿白蛋白/肌酐比率高于對(duì)照組(P＜0.05)，氯沙坦治療后減少了KKAy小鼠的尿白蛋白/肌酐比率(P＜0.05)。

2.3 腎臟病理改變 20周齡KKAy小鼠治療組與非治療組，腎臟體積均增大，表面尚光滑，均可見(jiàn)腎盂擴(kuò)張，但治療組小鼠腎盂擴(kuò)張程度輕于非治療組;20周齡對(duì)照組C57BL/6小鼠腎臟紅潤(rùn)光滑，無(wú)腎盂擴(kuò)張。光鏡下可見(jiàn)20周齡KKAy小鼠腎小球面積，治療組與非治療組均明顯大于對(duì)照組，治療組平均腎小球面積小于非治療組。非治療組KKAy小鼠腎小球基底膜明顯增厚，系膜基質(zhì)廣泛增生，可見(jiàn)硬化結(jié)節(jié)，腎小管基底膜增厚。20周齡氯沙坦治療組KKAy小鼠腎小球基底膜的增厚程度和系膜基質(zhì)的增生程度均輕于非治療組。電鏡下可見(jiàn)20周齡非治療組KKAy小鼠腎小球基底膜增厚，足突部分扁平、融合，而治療組腎小球結(jié)構(gòu)基本正常。

3 討論

氯沙坦高度選擇性地作用于血管緊張素Ⅱ1型受體［1］。目前研究表明，氯沙坦通過(guò)降低系統(tǒng)高血壓而間接降低腎小球內(nèi)“三高”，擴(kuò)張出球小動(dòng)脈強(qiáng)于擴(kuò)張入球小動(dòng)脈而直接降低腎小球內(nèi)“三高”，同時(shí)改善腎小球?yàn)V過(guò)膜的通透性及減少細(xì)胞外基質(zhì)蓄積等對(duì)腎臟起到保護(hù)作用［2］。

目前國(guó)內(nèi)學(xué)者多以鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病大鼠為研究模型，探討氯沙坦對(duì) DN的保護(hù)機(jī)制［3～6］。但是，造模方法的不一致性，使研究結(jié)果的相互關(guān)聯(lián)性及可重復(fù)性受到一定的影響，且由于動(dòng)物模型的限制，對(duì)DN早期腎損害的研究鮮有報(bào)道。自發(fā)性2型糖尿病KKAy小鼠，因其病理改變與人類DN早期病變一致，且以其個(gè)體差異小、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好等特點(diǎn)日益引起研究者的關(guān)注［7～9］。本研究觀察到，氯沙坦治療組KKAy小鼠的尿白蛋白/肌酐比率(可反映24 h尿白蛋白排泄水平)顯著低于非治療組KKAy小鼠，與本課題組既往關(guān)于ARB類藥物對(duì)KK系小鼠的腎臟保護(hù)作用的研究中所得結(jié)果相似［10］。組織學(xué)觀察證實(shí)10 mg/(kg·d)的氯沙坦治療能夠抑制腎小球系膜細(xì)胞增殖和伴滲出性病變的腎小球硬化。超微結(jié)構(gòu)示氯沙坦治療組KKAy小鼠腎腎小球基底膜增厚及足突不規(guī)則改變的程度減輕，明顯優(yōu)于非治療組。此結(jié)果與Sasaki等［11］觀察到的結(jié)果一致。

綜上所述，氯沙坦能夠減少自發(fā)性2型糖尿病KKAy小鼠尿白蛋白的排泄量，減輕腎臟病理改變，在糖尿病早期腎臟損害中起到保護(hù)作用。對(duì)其進(jìn)一步的深入研究，將有利于揭示DN的早期發(fā)病機(jī)制，為DN的早期防治提供理論依據(jù)。

［1］呂卓人，梁磊，艾文婷.血管緊張素Ⅱ1型受體拮抗劑研究進(jìn)展［J］.中華心血管病雜志，2004，32(11):1054－1056.

［2］蘇宏業(yè).糖尿病腎病治療研究［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2008，14(9):1376－1378.

［3］劉欣穎，毛佩菊，顧勇，等.氯沙坦對(duì)梗阻性腎病大鼠腎間質(zhì)固有細(xì)胞的作用［J］.中國(guó)血液凈化，2005，4(11):618－621.

［4］王嵐，李英，程萬(wàn)里，等.氯沙坦對(duì)糖尿病大鼠腎小管間質(zhì)p38MAPK和 TGF－β1 表達(dá)的影響［J］.中國(guó)病理生理雜志，2008，24(3):607－609.

［5］覃喬靜，鄧華聰.氯沙坦對(duì)糖尿病大鼠腎臟抗氧化能力的影響［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2004，33(5):739－740.

［6］劉倫志，寧建平，汪蓮開(kāi)，等.氯沙坦對(duì)糖尿病大鼠腎小管上皮細(xì)胞TGF－β1、p38MAPK 表達(dá)的影響［J］.湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，23(1):23－26.

［7］Brosius FC 3rd，Alpers CE，Bottinger EP，et al.Mouse models of diabetic nephropathy［J］.J Am Soc Nephrol，2009，20(12):2503－2512.

［8］Chatzigeorgiou A，Halapas A，Kalafatakis K，et al.The use of animal models in the study of diabetes mellitus［J］.In Vivo，2009，23(2):245－258.

［9］王謙，賈德賢，婁金麗，等.2型糖尿病動(dòng)物模型KKAy小鼠肝、腎的病變［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2008，16(4):241－243.

［10］ Fan Q，Liao J，Kobayashi M，et al.Candesartan reduced advanced glycation end－products accumulation and diminished nitrooxidative stress in type 2 diabetic KK/Ta mice［J］.Nephrol Dial Transplant，2004，19(12):3012－3020.

［11］Sasaki M，Uehara S，Ohta H，et al.Losartan ameliorates progression of glomerular structural changes in diabetic KKAy mice［J］.Life Sci，2004，75(7):869－880.