人肥大細(xì)胞羧肽酶真核表達(dá)重組質(zhì)粒DNA的免疫原性觀察

(廣東醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，廣東東莞 523808)

肥大細(xì)胞(MC)是一類(lèi)重要的免疫細(xì)胞，在超敏反應(yīng)、腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展中通過(guò)活化MC產(chǎn)生并釋放炎癥介質(zhì)而發(fā)揮重要作用［1］。MC羧肽酶(MC-CP)是MC特異性蛋白酶，是過(guò)敏反應(yīng)性疾病的生物標(biāo)志物［2，3］。天然MC-CP的純化極為困難，我們?cè)迷吮磉_(dá)技術(shù)制備了重組人MC-CP(hMCCP)及其抗體，通過(guò)原核表達(dá)獲取的hMC-CP重組蛋白不具天然構(gòu)象，獲取的hMC-CP抗體所針對(duì)的表位為線性表位［4］;而構(gòu)象表位通常是優(yōu)勢(shì)表位，針對(duì)構(gòu)象表位的抗體才具有更高的檢測(cè)靈敏度。DNA免疫作為一種以核酸為基礎(chǔ)的全新免疫接種技術(shù)，外源基因在小鼠體內(nèi)表達(dá)出具有天然構(gòu)象的蛋白，激發(fā)機(jī)體發(fā)生免疫應(yīng)答，并可用于抗體的制備。基于難于獲取具有天然結(jié)構(gòu)的hMC-CP，為進(jìn)一步獲取針對(duì)構(gòu)象表位的hMC-CP抗體，2010年8月～2011年3月，我們進(jìn)行了hMC-CP真核表達(dá)重組質(zhì)粒DNA的免疫原性研究?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 pcDNA3.1載體、大腸桿菌DH5α，純化的重組hMC-CP蛋白［5］以及分泌型hMC-CP真核表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1/S-CP)［6］由本室制備并保存;pGEM-T載體，DNA 凝膠回收試劑盒與質(zhì)粒抽提試劑盒，KpnⅠ、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶，無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒，DAB，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，常規(guī)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。PCR引物合成及DNA序列測(cè)定委托上海生物工程公司完成。BALB/c小鼠，雌性，6周齡。

1.2 方法

1.2.1 hMC-CP編碼區(qū)基因片段的擴(kuò)增 以含hMC-CP基因的質(zhì)粒［5］為模板，用以下引物做PCR擴(kuò)增，P1:5'-GGTACCGCCGCCGCCATGAACTCATCCTGCCTGTGGG-3'(有下劃線者為 KpnⅠ酶切位點(diǎn))，P2:5'-CTCGAGTTAGGAAGTATGCTTGAGGATATAC-3'(有下劃線為XhoⅠ酶切位點(diǎn))。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，出現(xiàn)1條長(zhǎng)約1 300 bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。DNA測(cè)序結(jié)果表明，片段為1 269 bp的hMC-CP編碼區(qū)基因與GenBank中公布的DNA序列完全一致?；厥占兓疨CR產(chǎn)物，與pGEM-T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，轉(zhuǎn)化菌液涂布于含 100 g/ml Amp和IPTG-Xgal的LB平板上37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單個(gè)白色菌落進(jìn)行培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒，以 KpnⅠ 和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定;并選取陽(yáng)性克隆行DNA測(cè)序，用Blast軟件進(jìn)行DNA序列同源性分析，陽(yáng)性克隆命名為pGEM-T/CP。

1.2.2 非分泌性真核表達(dá)載體的構(gòu)建 將質(zhì)粒pGEM-T/CP和pcDNA3.1分別用KpnⅠ和XhoⅠ行雙酶切，分別純化、回收?；厥债a(chǎn)物經(jīng)T4 DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α。挑取白色菌落進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定后，陽(yáng)性克隆行DNA測(cè)序鑒定，陽(yáng)性克隆命名為pcDNA3.1/CP，約為1 300 kb的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果相符;DNA測(cè)序結(jié)果表明，目的片段正確插入表達(dá)載體pcDNA3.1;Blast同源性分析顯示，目的基因編碼序列正確，閱讀框正確，可用于進(jìn)一步的重組表達(dá)。

1.2.3 免疫試驗(yàn)分組與處理 將40只BALB/c小鼠隨機(jī)分為8組，各5只。其中4組采用肌注，另外4組則采用皮下注射。肌注:后肢脛前肌注射質(zhì)粒100 μg/只(每條腿 50 μg)，4 組注射物分別為分泌性表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3.1/S-CP、非分泌性表達(dá)重組質(zhì)粒組 pcDNA3.1/CP、pcDNA3.1 空白質(zhì)粒、相同劑量NS。皮下注射:背部皮下多點(diǎn)注射，注射物分組同上。間隔免疫時(shí)間2周，共免疫3次。末次免疫后第7天摘眼球取血，分離血清，凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 免疫原性觀察 用純化的重組hMC-CP蛋白包被酶標(biāo)板，采用間接ELISA法檢測(cè)免疫血清的效價(jià)。反應(yīng)完畢后，用酶標(biāo)儀測(cè)波長(zhǎng)450 nm處的OD值。以待檢血清OD值＞陰性血清OD值2倍以上者的最大稀釋倍數(shù)確定為其效價(jià)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)比較進(jìn)行兩組獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)表意義。

2 結(jié)果

以 pcDNA3.1/S-CP、pcDNA3.1/CP DNA 免疫小鼠后，均誘導(dǎo)產(chǎn)生抗hMC-CP抗體，而pcDNA 3.1空載體和NS則不能。通過(guò)肌注途徑，以pcDNA 3.1/S-CP免疫小鼠所得血清抗體效價(jià)均值為1∶6 400，以 pcDNA3.1/CP 免疫小鼠所得血清抗體效價(jià)均值為1∶3 200，兩者比較，P ＞0.05。通過(guò)皮下注射途徑，以 pcDNA3.1/S-CP、pcDNA3.1/CP DNA免疫小鼠所得的5份免疫血清抗體效價(jià)均值均為1∶3200，兩者比較，P ＞0.05。同一載體肌肉與皮下免疫，所得血清抗體效價(jià)比較，P＞0.05。

3 討論

MC-CP是MC的特異標(biāo)志物，其檢測(cè)有助于過(guò)敏性疾病的診斷，而高質(zhì)量的抗體對(duì)提高檢測(cè)的靈敏度和特異性具有重要作用。我們?cè)迷吮磉_(dá)制備了hMC-CP重組蛋白，并以之為免疫原制備其抗體，但為不具有針對(duì)抗原構(gòu)象表位的抗體［4］。其原因可能為原核表達(dá)不能對(duì)翻譯的蛋白質(zhì)進(jìn)一步修飾加工，不能進(jìn)行正確的折疊，不具有天然蛋白的結(jié)構(gòu)。此后，我們嘗試以中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)為宿主細(xì)胞進(jìn)行體外真核表達(dá)，未能獲取具有活性的重組hMC-CP，可能與該蛋白的加工成熟機(jī)制尚不清楚有關(guān)。有研究表明［7］，MC-CP的加工成熟可能還需要MC細(xì)胞內(nèi)其他酶的參與。DNA免疫將編碼抗原基因的質(zhì)粒DNA注入小鼠體內(nèi)不僅可表達(dá)相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，同時(shí)還可激發(fā)特異性免疫應(yīng)答的發(fā)生［8］。由于DNA免疫模擬了機(jī)體在自然狀態(tài)下體內(nèi)表達(dá)抗原及誘生免疫的過(guò)程，免去了繁瑣的蛋白純化步驟，只需將編碼抗原的DNA片段克隆到真核表達(dá)載體上，提取重組質(zhì)粒DNA免疫動(dòng)物，即可產(chǎn)生針對(duì)該抗原的抗體。

MC-CP基因編碼的產(chǎn)物是1個(gè)含417個(gè)氨基酸的酶原，由信號(hào)肽、活化肽和成熟酶組成，成熟MCCP才具有活性。為研究hMC-CP信號(hào)肽對(duì)其分泌表達(dá)是否有影響，我們?cè)晒?gòu)建了hMC-CP的分泌型真核表達(dá)載體［6］。本實(shí)驗(yàn)中，我們成功構(gòu)建了hMC-CP的非分泌型真核表達(dá)載體。

基因免疫常用的注射途徑有肌肉、皮內(nèi)、皮下、脾臟、靜脈、腹腔免疫等，其中以肌肉注射免疫途徑較為常用。接種方法可用基因槍免疫、裸DNA免疫、脂質(zhì)體包裹DNA免疫等，其中裸DNA免疫較為常用。本實(shí)驗(yàn)選擇了以裸質(zhì)粒DNA分別進(jìn)行肌肉免疫和皮下免疫，分別以分泌型與非分泌型hMCCP真核表達(dá)載體的裸質(zhì)粒DNA免疫小鼠，收集小鼠血清檢測(cè)到抗hMC-CP抗體，二者的效價(jià)近似(P＞0.05)，相同質(zhì)粒以肌肉和皮下途徑進(jìn)行免疫，獲取抗體效價(jià)近似(P＞0.05)。提示，hMC-CP真核表達(dá)重組質(zhì)粒DNA具有較好的免疫原性，表達(dá)質(zhì)粒是否為分泌性表達(dá)不影響其免疫原性，其免疫原性也不受質(zhì)粒DNA注射途徑的影響。

［1］Nechushtan H.The complexity of the complicity of mast cells in cancer［J］.Int J Biochem Cell Biol，2010，42(5):551-554.

［2］Pejler G，Ronnberg E，Waern I，et al.Mast cell proteases:multifaceted regulators of inflammatory disease［J］.Blood，2010，115(24):4981-4990.

［3］Sanz ML，Gamboa PM，Garcia-Figueroa BE，et al.In vitro diagnosis of anaphylaxis［J］.Chem Immunol Allergy，2010，95(1):125-140.

［4］Zhou YC，Chen ZQ，He S.Preparation，characterization and epitope mapping of McAb specific to human mast cell carboxypeptidase［J］.Scand J Immunol，2006，64(10):564-570.

［5］陳章權(quán)，何素輝，陸田田，等.兔抗人肥大細(xì)胞羧肽酶抗體的制備與鑒定［J］.細(xì)胞與分子免學(xué)雜志，2007，23(9):859-861.

［6］陸田田，陳章權(quán).人肥大細(xì)胞羧肽酶分泌型真核表達(dá)載體的構(gòu)建［J］.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2008，24(22):3346-3348.

［7］Henningsson F，Yamamoto K，Saftig P，et al.A role for cathepsin E in the processing of mast-cell carboxypeptidase A［J］.J Cell Sci，2005，118(Pt 9):2035-2042.

［8］Tang DC，DeVit M，Johnston SA.Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response［J］.Nature，1992，356(6365):152-154.