分子標(biāo)記技術(shù)在棉花育種中的應(yīng)用

趙興華，渠云芳，黃晉玲

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801）

與其他農(nóng)作物相比，棉花的基因組學(xué)及利用分子標(biāo)記技術(shù)進行棉花育種改良等方面的研究比較落后。近30 a來，隨著分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的迅速發(fā)展，使得建立在DNA水平上的、以揭示棉花遺傳的分子標(biāo)記技術(shù)研究成為可能。

分子標(biāo)記是以DNA分子堿基序列的變異為基礎(chǔ)，所揭示的多態(tài)性直接反映基因組DNA間的差異。與形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細胞學(xué)標(biāo)記和生化標(biāo)記相比，分子標(biāo)記具有準(zhǔn)確度高、數(shù)量多、多態(tài)性高、共顯性好、對表型無影響、檢測手段簡單快捷以及開發(fā)和使用成本低等優(yōu)越性。因此，分子標(biāo)記技術(shù)以其自身的優(yōu)越性在棉花遺傳圖譜構(gòu)建、分子標(biāo)記輔助選擇育種、重要農(nóng)藝性狀基因的標(biāo)記定位、種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析和純度鑒定等方面具有重要的應(yīng)用價值[1]。

本文對棉花上應(yīng)用的幾種分子標(biāo)記技術(shù)以及它們在棉花育種中的應(yīng)用與展望進行了闡述。

1 分子標(biāo)記的類型

分子標(biāo)記根據(jù)其產(chǎn)生的特點，大致可分為4類[2]：第一類，以DNA—DNA雜交技術(shù)為基礎(chǔ)，如限制性片段長度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP），數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性（Variable Numberof Tandem Repeat，VNTR）。第二類，以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，如隨機擴增片段長度多態(tài)性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD），簡單重復(fù)序列（Simple Sequence Repeat，SSR），序列特異性擴增片段（Sequence-Characterized Amplified Region，SCAR），相關(guān)序列擴增多態(tài)性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP），靶位區(qū)域擴增多態(tài)性（target region amplified polymorphism，TRAP），擴增片段長度多態(tài)性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）。第三類，以DNA單鏈、單核苷酸多態(tài)性為基礎(chǔ)，如單鏈物質(zhì)多態(tài)性（Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP）、單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP），衍生的酶切擴增多態(tài)性（derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequence，dCAPS）。第四類，原位雜交技術(shù)（In Situ Hybridization，ISH），包括熒光原位雜交（Fluorecence In Situ Hybridization，F(xiàn)ISH）和基因組原位雜交（Genome In Situ Hybridization，GISH）等。

2 幾種分子標(biāo)記的原理及特點

2.1 簡單重復(fù)序列（SSR）

簡單重復(fù)序列也稱微衛(wèi)星DNA，其串聯(lián)重復(fù)的核心序列為1～6 bp。其中，在農(nóng)作物中最常見的二核苷酸重復(fù)單位是（AC）n和（GA）n，每個微衛(wèi)星DNA的核心序列結(jié)構(gòu)相同，重復(fù)單位數(shù)目10～60個，其高度多態(tài)性主要來源于串聯(lián)數(shù)目的不同。SSR標(biāo)記的基本原理：根據(jù)微衛(wèi)星序列兩端互補序列設(shè)計引物，通過PCR反應(yīng)擴增微衛(wèi)星片段，由于核心序列串聯(lián)重復(fù)數(shù)目不同，因而能夠用PCR的方法擴增出不同長度的PCR產(chǎn)物，將擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳分析核心序列的長度多態(tài)性。

與其他分子標(biāo)記相比，SSR標(biāo)記具有的優(yōu)點[3-4]為：（1）所需 DNA 量少；（2）覆蓋整個基因組，多態(tài)性高；（3）具有多等位基因的特性；（4）呈共顯性遺傳。缺點是：在采用SSR技術(shù)分析微衛(wèi)星DNA多態(tài)性時，必須知道重復(fù)序列兩端的DNA序列的信息，如不能直接從DNA數(shù)據(jù)庫查尋獲得，則首先必須對其進行測序。

2.2 相關(guān)序列擴增多態(tài)性（SRAP）和靶位區(qū)域擴增多態(tài)性（TRAP）

相關(guān)序列擴增多態(tài)性和靶位區(qū)域擴增多態(tài)性是基于PCR標(biāo)記最近發(fā)展起來的新型分子標(biāo)記系統(tǒng)。其中，SRAP由Li等[5]于2001年提出，又叫基于序列擴增多態(tài)性（sequence-based amplified polymorphism，SBAP）[6]。該標(biāo)記通過獨特的雙引物設(shè)計，對基因的 ORFs（Open reading frames）的特定區(qū)域進行擴增，上游引物對外顯子區(qū)域進行特異擴增，下游引物對內(nèi)含子區(qū)域、啟動子區(qū)域進行特異擴增，因不同個體以及物種的內(nèi)含子、啟動子與間隔區(qū)長度不同而產(chǎn)生多態(tài)性。

TRAP由Hu等[7]于2003年提出，其技術(shù)是從SRAP技術(shù)改進而來的。SRAP使用2個任意引物；而TRAP是使用長度為16～20 bp核苷的固定引物與任意引物，固定引物以公用數(shù)據(jù)庫中的靶EST序列設(shè)計而來，任意引物與SRAP所用的一樣，為一段以富含AT或GC為核心、可與內(nèi)含子或外顯子區(qū)域配對的隨機序列[8]。SRAP和TRAP分子標(biāo)記都可檢測基因的可譯框（ORFs）區(qū)域，但引物設(shè)計是SRAP與TRAP分析的關(guān)鍵，SRAP標(biāo)記技術(shù)無須任何序列信息，而TRAP技術(shù)需要基于已知cDNA或EST序列信息設(shè)計固定引物才可進行PCR擴增。

2.3 擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）

擴增片段長度多態(tài)性是1993年荷蘭科學(xué)家Zebeau Mare等[9-10]發(fā)展起來的一種新的分子標(biāo)記技術(shù)。AFLP是RFLP與PCR相結(jié)合的產(chǎn)物，其基本原理是：先利用限制性內(nèi)切酶水解基因組DNA產(chǎn)生不同大小的DNA片段；再使雙鏈人工接頭的酶切片段相連接，作為擴增反應(yīng)的模板DNA；然后以人工接頭的互補鏈為引物進行預(yù)擴增；最后在接頭互補鏈的基礎(chǔ)上添加1～3個選擇性核苷酸作引物，對模板DNA基因再進行選擇性擴增，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離DNA擴增片段，根據(jù)擴增片段長度的不同檢測多態(tài)性。

AFLP結(jié)合了RFLP和RAPD這2種技術(shù)的優(yōu)點，分辨率高、穩(wěn)定性好、效率高。但它的技術(shù)費用昂貴，對DNA的純度和內(nèi)切酶的質(zhì)量要求較高，并且AFLP分析需要同位素或非同位素標(biāo)記引物，在具有放射性同位素操作過程中，必須具備特殊的防護措施以及配套的儀器設(shè)備。

2.4 單核苷酸多態(tài)性（SNP）

單核苷酸多態(tài)性是指同一位點的不同等位基因之間僅有個別核苷酸的差異或只有小的插入、缺失等，是近年來提出的第3代DNA分子標(biāo)記。SNP的最佳檢測方法是DNA芯片技術(shù)，隨著DNA芯片技術(shù)的發(fā)展，其有望成為最重要、最有效的分子標(biāo)記技術(shù)。

3 分子標(biāo)記技術(shù)在棉花育種中的應(yīng)用

3.1 群體結(jié)構(gòu)、親緣關(guān)系分析及分類學(xué)研究

棉花在長期的自然選擇和人工選擇過程中，形成了不同的種群和品系，基因頻率也發(fā)生了不同程度的分化，有時根據(jù)表型差異很難區(qū)分它們之間的親緣關(guān)系。而DNA分子標(biāo)記技術(shù)可作為測定基因頻率變化的有效手段，主要通過DNA的擴增條帶計算遺傳相似程度，進而研究棉花的種群親緣關(guān)系。聶以春等[11]選用80個隨機引物，對栽培種陸地棉、野生種雷蒙德氏棉以及它們的雜種1代和回交后代中選育得到的9個種質(zhì)系進行了RAPD遺傳相似性研究，認為29個隨機引物擴增的條帶具多態(tài)性，并能將2個不同棉種、F1和種質(zhì)系相互間加以區(qū)別。朱美霞等[12]應(yīng)用RAPD-PCR技術(shù)分析了棉花種質(zhì)的親緣關(guān)系，結(jié)果表明，海島棉與草棉的A染色體組比較接近，而陸地棉與中棉的A染色體組相近，反映了異源四倍體與二倍體A基因組的進化關(guān)系。凌磊等[13]利用SRAP標(biāo)記分析了彩色棉與白色棉的遺傳差異，研究結(jié)果表明，SRAP標(biāo)記可以判明彩色棉和白色棉的遺傳差異，為彩色棉育種的親本選擇在分子水平上提供了一定的參考依據(jù)。棉花種群親緣關(guān)系的確定與分類研究，對于種質(zhì)資源保護和新品種選育具有十分重要的戰(zhàn)略與現(xiàn)實意義。

3.2 遺傳多樣性研究和種質(zhì)鑒定與評價

利用分子標(biāo)記對棉花資源進行遺傳多樣性分析，可從表觀遺傳學(xué)深入到分子水平對它們進行研究和鑒定，以避免同種異名或同名異種的麻煩，發(fā)現(xiàn)新種質(zhì)，保護瀕危種質(zhì)，擴大基因資源庫，豐富育成品種的遺傳背景。陳光等[14]對不同親本來源、不同選育時期、不同種植生態(tài)區(qū)的43份陸地棉基礎(chǔ)種質(zhì)進行了遺傳多樣性的SSR分子標(biāo)記分析，研究結(jié)果顯示，與早期基礎(chǔ)種質(zhì)資源相比，現(xiàn)代我國棉花基礎(chǔ)種質(zhì)資源的遺傳多樣性呈下降趨勢，其中，黃河、長江主產(chǎn)棉區(qū)基礎(chǔ)種質(zhì)的遺傳多樣性還沒有超過國外基礎(chǔ)種質(zhì)，且品種間的遺傳背景較為狹窄。苗培明等[15]應(yīng)用TRAP分子標(biāo)記方法對65份棉花種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析，所獲得的聚類結(jié)果與種質(zhì)資源的地域來源和形態(tài)特征有一定的相關(guān)性，說明TRAP分子標(biāo)記方法在棉花種質(zhì)資源鑒定、分類等方面的研究上具有良好的應(yīng)用前景。

因此，必須采用多種途徑來豐富我國棉花種質(zhì)資源的遺傳多樣性，而通過遠緣雜交導(dǎo)入外源遺傳物質(zhì)，是改良棉花遺傳基礎(chǔ)狹窄的一條重要途徑。但在引入外源染色體的同時，既有對作物改良有利的基因，也存在著大量的對作物改良不利的基因，這就需要一種準(zhǔn)確、有效的分子標(biāo)記技術(shù)（如 RFLP，RAPD，AFLP和 SSR 等）對其進行種質(zhì)鑒定。賀道華等[16]用均勻分布于棉花全基因組的132個SSR標(biāo)記，對精選的92個棉花品種（系）進行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，此自然群體的遺傳基礎(chǔ)較為寬泛，聚類分析和系譜追溯的結(jié)果顯示，該群體中品種的選育過程復(fù)雜，血統(tǒng)來源多樣，存在較高程度的遺傳多樣性。郭寶生等[17]利用9對引物對46個品種或品系的DNA進行擴增，結(jié)果表明，漸滲系主要遺傳背景為陸地棉，個別性狀來源于海島棉，由于漸滲位點和基因不同，從而造成一定的差異，被聚類到不同小組。

3.3 遺傳圖譜的構(gòu)建

遺傳連鎖圖譜是指通過遺傳重組分析得到的基因在染色體上的線形排列圖。高密度分子標(biāo)記遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建，可為基因定位、物理圖譜構(gòu)建和以圖譜為基礎(chǔ)的目的基因克隆奠定基礎(chǔ)。到目前為止，在以RFLP，RAPD，SSR為主要分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建的多張棉花遺傳連鎖圖譜的基礎(chǔ)上，林忠旭等[18]應(yīng)用SRAP標(biāo)記構(gòu)建了棉花分子遺傳連鎖圖，作圖群體為邯鄲208與Pima90雜交產(chǎn)生的129個F2單株，篩選出多態(tài)性較好的76個引物組合進行檢測、構(gòu)建連鎖群。近年來，還有人運用SSR，TRAP，SRAP和AFLP標(biāo)記對四倍體栽培棉進行了高密度的遺傳圖譜構(gòu)建和纖維品質(zhì)性狀QTL定位，為大幅度增加棉花分子遺傳連鎖圖的密度提供了理論基礎(chǔ)。

3.4 QTLs的定位

目標(biāo)基因是指在遺傳上真實存在的特殊性狀基因，如抗蟲、抗病、高產(chǎn)、優(yōu)良品質(zhì)性狀等基因。定位就是要把某一目標(biāo)基因、質(zhì)量性狀和數(shù)量性狀基因精確定位到染色體的具體位置上。汪保華等[19]通過對中棉所12與8891的雜交及多代自交，獲得180個家系構(gòu)成的重組自交系F8和F9群體，采用SSR為主的分子標(biāo)記構(gòu)建了遺傳連鎖圖，并對株型性狀進行了單位點和雙位點水平的QTL定位。宋振云等[20]以亞紅株突變體PD-17與GK19配置的BC1群體為作圖群體，選用覆蓋棉花所有已鑒定染色體及大多數(shù)連鎖群的419對SSR引物，利用BSA（bulked segregation analysis）法篩選多態(tài)性差異引物，結(jié)果顯示，位于第7條染色體上的5個分子標(biāo)記與Rs基因相連鎖，SSR標(biāo)記BNL2634與Rs基因的遺傳距離較小，約為10.3 cM，SSR標(biāo)記CIR393位于Rs基因另一側(cè)，與Rs基因的遺傳距離約為29.1 cM，由此將Rs基因定位于第7染色體上。董承光等[21]對無腺體突變基因G進行了精細定位，結(jié)合棉花海陸種間遺傳連鎖圖譜，利用SSR標(biāo)記將G基因定位于 CIR362和 NAU2251b，NAU3860b，STV033之間，G基因與GIR362遺傳距離為9.27 cM，與 NAU2251b，NAU3860b，STV033 的距離為0.96 cM。

3.5 品種指紋圖譜的構(gòu)建及品種（雜種）純度的鑒定

指紋圖譜是指能夠反映生物個體間差異的電泳圖譜，具有類似于人的指紋那樣的高度個體特異性和穩(wěn)定可靠性。各種分子標(biāo)記均可用于DNA指紋圖譜分析，其中，SSR和AFLP標(biāo)記更為理想，所提供的多態(tài)性信息更為豐富，構(gòu)建的DNA指紋圖譜可以進行品種鑒定、品種真實性和純度的檢測。王俊芳[22]用SSR標(biāo)記構(gòu)建了85份棉花種質(zhì)的指紋圖譜，探討DNA指紋圖譜技術(shù)應(yīng)用于棉花品種真實性和純度檢測的可能實現(xiàn)途徑。朱云國等[23]運用AFLP同位素標(biāo)記技術(shù)，獲得了棉花細胞質(zhì)雄性不育系、保持系、恢復(fù)系及其雜種F1的DNA指紋圖譜。姜偉等[24]利用ISSR對8個新疆棉花品種（系）進行了指紋圖譜構(gòu)建，通過基因組多態(tài)性分析，從60條引物中篩選到11條擴增效果較好的引物，用其中2條引物UBC809，UBC841建立了8個品種的指紋圖譜。

3.6 分子標(biāo)記輔助育種

作物新品種的選育過程中，選擇是最重要的環(huán)節(jié)之一，所謂的選擇是指在一個育種群體中選擇符合育種目標(biāo)的基因型。傳統(tǒng)的作物育種方式是基于作物的表現(xiàn)型進行選擇的，具有很大的局限性。而分子標(biāo)記輔助選擇是在DNA水平上進行，大大縮短了育種時間，可靠而高效，加快了育種進程。柳李旺等[25]利用CMS恢復(fù)基因Rf1緊密連鎖的3個SSR標(biāo)記和Bt基因的PCR標(biāo)記開展分子標(biāo)記輔助選擇，培育聚合有Rf1和Bt的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉恢復(fù)系，共獲得54個同時具Rf1與Bt基因的聚合單株。這些聚合單株自交后，通過標(biāo)記輔助選擇，獲得10株含Bt基因且Rf1純合的單株。楊澤茂等[26]利用陸地棉栽培種CCRI221（中棉45）為受體，海島棉海1為供體，通過高代回交和分子標(biāo)記輔助選擇相結(jié)合的方法，構(gòu)建了1個由116個家系組成的染色體片段代換系群體，利用分布在棉花基因組25個連鎖群上的276個多態(tài)性標(biāo)記對BC4F1進行檢測，結(jié)果顯示，在每個家系中代換片段最多的55個，最少的為15個，平均32.92個；覆蓋了棉花基因組180.7～969.0 cM，平均覆蓋502 cM。由于分子標(biāo)記輔助育種不受棉花生長發(fā)育的時期及環(huán)境的影響，利用分子標(biāo)記輔助育種已在棉花纖維品質(zhì)育種、抗病育種等方面進行了廣泛研究[27-29]。

4 結(jié)論與展望

從分子標(biāo)記技術(shù)在棉花育種中的研究進展和優(yōu)缺點來看，DNA分子標(biāo)記技術(shù)已成為棉花分子遺傳及輔助育種研究中的重要工具[30]。但是許多標(biāo)記首先需要進行基因組克隆、測序、人工合成引物，開發(fā)費用相當(dāng)高[31]，不能夠在棉花分子育種中得到廣泛的應(yīng)用。

在未來的發(fā)展中，隨著大規(guī)模測序技術(shù)的應(yīng)用，簡單快捷、穩(wěn)定性好、成本低、更易于自動化的分子標(biāo)記及各種標(biāo)記的結(jié)合與相互轉(zhuǎn)化，必將在棉花分子遺傳育種的研究中發(fā)揮越來越重要的作用，并將極大地推動棉花育種的進程。

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