自體外周血干細(xì)胞與骨基質(zhì)明膠復(fù)合移植治療骨缺損

張小舟,鄒三明,馮華明,黃篤,康照利

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬孝感醫(yī)院,湖北孝感 432000)

節(jié)段性骨缺損的治療在臨床骨科領(lǐng)域存在很大的困難。我們采用自體外周血干細(xì)胞(autologous peripheral blood stem cell,APBSC)與表面脫鈣骨基質(zhì)明膠 (bone matrix gelatin,BMG)共移植修復(fù)節(jié)段性骨缺損進(jìn)行了臨床研究,在課題研究中進(jìn)行了X線檢查,效果理想,達(dá)到了預(yù)期目的,在臨床有廣闊的應(yīng)用前景,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2003年 12月至 2007年 12月我課題組共收治節(jié)段性骨缺損病例 36例(骨缺損長(zhǎng)度選定為 6～12cm),男24例,女12例;平均年齡39歲(20～65歲)。其中,骨盆骨缺損3例,肱骨骨缺損9例,尺橈骨骨缺損 5例,股骨骨缺損 12例,脛腓骨骨缺損7例。骨腫瘤25例,骨折后骨不連 11例。

依據(jù)同種病情、患者自愿的原則,采用納入法將 36例患者隨機(jī)分為兩組(即 A組和 B組)。

1.2 APBSC的采集[1]及手術(shù)方法 患者入院后在常規(guī)術(shù)前檢查和治療原發(fā)病的基礎(chǔ)上,手術(shù)前6d給予分泌型重組人粒細(xì)胞刺激因子,600 μg/d皮下注射,連用5 d。手術(shù)當(dāng)日經(jīng)美國(guó)Baxter公司生產(chǎn)的 CS3000PLUS血細(xì)胞分離機(jī),分離出外周血干細(xì)胞懸液 50mL,采集后干細(xì)胞不做任何處理留置備用(外周血干細(xì)胞采集工作在孝感市中心血站實(shí)驗(yàn)室完成)。

根據(jù)患者骨缺損病變部位,采用相應(yīng)的手術(shù)麻醉和手術(shù)切口,充分顯露骨缺損部位,徹底清理骨缺損部位的軟組織和病變骨組織。疏通上下髓腔,將骨斷端修理成梯形以便充分嵌合,清洗術(shù)野。

根據(jù)骨缺損長(zhǎng)度制備相應(yīng)的 BM G(課題組所用 BM G均由醫(yī)院指定的山西組織骨庫(kù)制備、提供),將外周血干細(xì)胞懸液種入制備好的BMG中。A組患者將APBSC/BM G復(fù)合體充分嵌合于骨斷端,B組患者僅使用 BMG嵌合于骨斷端,根據(jù)骨缺損部位選擇相應(yīng)的鋼板、螺釘或交鎖髓內(nèi)釘進(jìn)行牢固內(nèi)固定。

術(shù)野放置引流管,依次縫合各層組織,術(shù)畢。術(shù)后24h拔引流管,抗生素術(shù)后使用1周,術(shù)后 2周切口拆線。

2 結(jié) 果

2.1 影像學(xué)觀察 術(shù)后1個(gè)月復(fù)查X線片顯示：A組患者骨折端有骨痂形成;B組患者骨折端骨痂形成不明顯,兩組患者骨折處皆有壓痛。2個(gè)月復(fù)查X線片顯示：A組患者可見(jiàn)骨折端有大量骨痂形成,骨折處壓痛不明顯,此時(shí)開(kāi)始功能鍛煉;B組患者骨折端有骨痂形成,骨折處壓痛較前減輕。3個(gè)月復(fù)查 X線片顯示：A組患者可見(jiàn)骨折端有連續(xù)骨痂形成,骨折處無(wú)壓痛;B組患者骨折端有大量骨痂形成,骨折處有輕微壓痛。

2.2 愈合時(shí)間比較 平均愈合時(shí)間 A組為 5個(gè)月,B組為 8個(gè)月,兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在治療期間,患者未見(jiàn)感染及其他并發(fā)癥,隨訪12個(gè)月均未發(fā)生再骨折。

2.3 功能評(píng)估 術(shù)后結(jié)果評(píng)定根據(jù)國(guó)際保肢學(xué)會(huì)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[2]評(píng)定 ,術(shù)后依疼痛程度、功能活動(dòng)、心理接受程度、是否用外部支持、行走能力和步態(tài)6個(gè)指標(biāo)評(píng)價(jià)效果。每個(gè)指標(biāo)分0、1、2、3、4、5分,共6級(jí)。總分30分,大于 24分為優(yōu),18～24分為良,小于15分為差。A組優(yōu) 16例,良 2例;B組優(yōu)14例,良4例,兩組間差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討 論

3.1 APBSC/BM G移植理論基礎(chǔ) 骨組織的再生要求有 3個(gè)基本的生物學(xué)因素參與,即細(xì)胞,生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子,細(xì)胞外支架材料。種子細(xì)胞(成骨細(xì)胞)：理想的骨組織工程種子細(xì)胞應(yīng)具備下列特點(diǎn),即取材容易,對(duì)機(jī)體損傷小;在體外培養(yǎng)中易定向分化為成骨細(xì)胞和具有較強(qiáng)的傳代繁殖能力;植入機(jī)體后能適應(yīng)受區(qū)的環(huán)境并保持成骨的活性。目前發(fā)現(xiàn)種子細(xì)胞有以下幾種來(lái)源,即胚胎骨、骨外膜、骨髓、骨外組織(包括外周血干細(xì)胞)。其中,外周血干細(xì)胞具有很強(qiáng)的傳代繁殖和定向分化為成骨細(xì)胞的能力,植入機(jī)體后能適應(yīng)受區(qū)的環(huán)境,保持成骨活性。生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子：主要是生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子,在組織工程中,某些種子細(xì)胞在體外傳代培養(yǎng)后,經(jīng)過(guò)一段時(shí)間細(xì)胞極易衰老,而生長(zhǎng)因子能調(diào)節(jié)種子細(xì)胞的增殖和分化。對(duì)成骨細(xì)胞起著重要調(diào)節(jié)作用的生長(zhǎng)因子有轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、胰島素樣生長(zhǎng)因子、骨形成蛋白、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子及血小板衍生生長(zhǎng)因子等。細(xì)胞外支架材料：理想的組織細(xì)胞外基質(zhì)材料必須具有如下特征,即良好的生物相容性,良好的生物降解性,具有三維立體多孔結(jié)構(gòu),良好的可塑性和一定的機(jī)械強(qiáng)度,良好的材料-細(xì)胞界面,材料須易于消毒。用于組織工程的支架材料有天然和人工合成兩類,目前用于細(xì)胞支架材料的主要有聚乳酸、聚羥基乙酸及表面脫鈣骨基質(zhì)明膠。它們突出的優(yōu)點(diǎn)是：生物相容性良好,降解速度可調(diào),降解產(chǎn)物易于代謝和排除,以及材料易于消毒等。

干細(xì)胞又稱為多潛能干細(xì)胞,主要來(lái)源于胚胎時(shí)期的卵黃囊,為骨髓的原始細(xì)胞。既往用于移植的干細(xì)胞主要采自骨髓,因此稱為骨髓移植。然而隨著血液學(xué)研究的進(jìn)一步深入,有研究發(fā)現(xiàn)[3]干細(xì)胞不僅存在骨髓中,同時(shí)也存在于臍帶血、胚胎肝臟及外周血中,骨髓移植這一較為片面的概念逐漸被干細(xì)胞移植所替代。APBSC來(lái)源于骨髓,與骨髓干細(xì)胞具有共同的生物學(xué)特征,既不斷地自我更新,在造血組織中維持一定數(shù)量的能力,又有分化為骨髓紅細(xì)胞系、粒細(xì)胞系、淋巴細(xì)胞系以及巨核細(xì)胞系的潛力[4]。有研究表明[5]外周血細(xì)胞的不同階段,包括干細(xì)胞、前祖細(xì)胞及晚祖細(xì)胞,均有 CD34+細(xì)胞膜分化抗原,然而定向祖細(xì)胞卻沒(méi)有這種抗原,由此外周血干細(xì)胞可以由 CD34+細(xì)胞代表。正常情況下,外周血細(xì)胞中只有(0.2±0.1)%的 CD34+細(xì)胞[6],表明外周血中干細(xì)胞數(shù)量極低,遠(yuǎn)不能滿足臨床應(yīng)用的需要。增加移植所需要外周血干細(xì)胞數(shù)的主要方法包括[1]：a)骨髓抑制性化療藥;b)造血因子：其中粒細(xì)胞集落刺激因子最常用; c)前兩種聯(lián)合應(yīng)用,以上方法可使外周血干細(xì)胞增加數(shù)十倍,甚至數(shù)百倍。本課題組根據(jù)課題研究條件選擇粒細(xì)胞集落刺激因子進(jìn)行骨髓動(dòng)員。目前從外周循環(huán)血中直接分離外周血干細(xì)胞的難度較高,本實(shí)驗(yàn)利用干細(xì)胞的大小與淋巴細(xì)胞接近的形態(tài)學(xué)特點(diǎn),用淋巴細(xì)胞分離液從外周血中分離淋巴細(xì)胞或單個(gè)核細(xì)胞,從而提取移植所需要的外周血干細(xì)胞[5,7]。

Chalmers等[8]提出骨形態(tài)蛋白、間充質(zhì)細(xì)胞、骨生長(zhǎng)環(huán)境是誘導(dǎo)成骨的三個(gè)關(guān)鍵要素,骨形態(tài)蛋白作為誘導(dǎo)刺激物作用于間充質(zhì)細(xì)胞,在有利于骨生長(zhǎng)的血液環(huán)境中,誘導(dǎo)刺激骨形成。 BM G含有骨形態(tài)蛋白,其由同種異體骨經(jīng)過(guò)脫脂、表面脫鈣、脫蛋白、脫細(xì)胞處理等處理后,去掉了除骨形態(tài)蛋白以外 95%的非膠原蛋白和具有阻滯作用的脂質(zhì)成分[9]。有實(shí)驗(yàn)研究表明[10],BM G移植在短期(6～9周 )可以產(chǎn)生較大的骨誘導(dǎo)作用。BM G[11]的特點(diǎn)：既有強(qiáng)度又有孔隙;其免疫原性低,生物相容性好;與外周血干細(xì)胞及軟骨細(xì)胞復(fù)合后具有較好的兼容性;能在體內(nèi)逐漸吸收,被新骨所替代;來(lái)源廣泛。因此,逐漸成為臨床上常用的骨移植材料[12,13]。 BM G不用與任何移植材料的空白對(duì)照組比較,其療效已被大量文獻(xiàn)報(bào)告[14-16]所肯定。

骨折愈合是建立骨的連續(xù)性和恢復(fù)骨的生物學(xué)特性。APBSC/BMG復(fù)合移植治療骨缺損,既利用了外周循環(huán)血中的多潛能干細(xì)胞,保留骨的生物學(xué)特性;又利用了 BM G中的骨形態(tài)蛋白,從而誘導(dǎo)成骨細(xì)胞形成[17,18]。APBSC在 BM G的骨形態(tài)蛋白誘導(dǎo)下具有明顯的成骨作用。與單純 BM G移植相比較,APBSC/BM G復(fù)合移植具有新骨形成時(shí)間更短、新骨形成質(zhì)量更好的優(yōu)點(diǎn)。

我們認(rèn)為 APBSC/BMG復(fù)合移植具有廣泛的臨床應(yīng)用前景,理由是：a)APBSC/BM G復(fù)合移植避免了傳統(tǒng)手術(shù)中自體采骨給患者帶來(lái)的痛苦以及供區(qū)新的骨缺損等一系列并發(fā)癥,對(duì)機(jī)體創(chuàng)傷減小到最低限度,移植物處理達(dá)到幾乎無(wú)創(chuàng)傷[14]。b)使骨缺損修復(fù)的手術(shù)難度降低。c)與同種異體骨或異種骨移植相比較,免疫排斥反應(yīng)極小;與人工骨比較, BMG同時(shí)具有良好的生物相容性、生物降解性能,在體內(nèi)吸收被新骨所替代[16,19]。d)BM G可塑形,APBSC/BMG復(fù)合移植不僅在骨科,還可廣泛應(yīng)用于頜面外科及整形外科。

3.2 異體骨的應(yīng)用及內(nèi)固定的選擇 自體骨移植是臨床常用的修復(fù)骨缺損的方法。自體骨移植無(wú)免疫排斥反應(yīng),骨誘導(dǎo)作用好。若受床血供良好,有健康的軟組織覆蓋,則骨愈合快,效果令人滿意。但骨源有限,并且會(huì)對(duì)供體造成新的缺損,而且人工替代物尚不適用于大段骨移植[20]。同種異體骨移植已有百年歷史,近年骨庫(kù)的發(fā)展使供體的選擇、制備、滅菌和保存方法更加規(guī)范、嚴(yán)格。異體骨植骨量充足,形態(tài)可按需選擇。另外,本組病例中我們采用了鋼板、螺釘和牢固的絞鎖髓內(nèi)釘內(nèi)固定,這些固定對(duì)于早期的異體骨愈合能起到較好作用。

3.3 骨缺損長(zhǎng)度的選擇 課題組選擇的病例骨缺損長(zhǎng)度為6～12 cm,因?yàn)楣侨睋p在6cm以下可以通過(guò)截取自體髂骨填充缺損段達(dá)到較好骨愈合;對(duì)于12cm以上的缺損,血管化植骨優(yōu)于游離植骨。所以兩組病例我們都選擇骨缺損長(zhǎng)度為 6～12 cm具有可比性[21]。

3.4 APBSC/BMG臨床應(yīng)用前景 APBSC/BM G具有諸多優(yōu)點(diǎn),如 APBSC/BM G復(fù)合移植對(duì)機(jī)體的創(chuàng)傷大大減少,避免了傳統(tǒng)手術(shù)中取自體骨給患者帶來(lái)的巨大痛苦,也可減少供區(qū)產(chǎn)生新的骨缺損等一系列并發(fā)癥;此方法使治療骨缺損的難度降低;APBSC/BM G免疫排斥反應(yīng)小,具有較好的生物相容性,可在體內(nèi)吸收被新骨所取代;與商品化的人工骨相比,APBSC/BM G所需費(fèi)用不高;另外,BMG具有可塑性,APBSC/BM G也可廣泛應(yīng)用于整形外科等領(lǐng)域。因此APBSC/BMG復(fù)合移植具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。

3.5 并發(fā)癥 a)應(yīng)用大塊同種異體骨移植后的最主要并發(fā)癥是排異反應(yīng)繼發(fā)的感染、骨不連、異體骨骨折等。本組 36例未見(jiàn)嚴(yán)重的排異反應(yīng)繼發(fā)的感染、骨不連、異體骨骨折。這種現(xiàn)象應(yīng)與良好的固定保證了移植區(qū)域的穩(wěn)定有關(guān)。b)在外周血干細(xì)胞動(dòng)員時(shí)觀察有無(wú)骨痛、乏力、皮疹、發(fā)熱、胃腸道反應(yīng)(惡心、嘔吐、便秘)。c)在外周血干細(xì)胞分離及采集過(guò)程中觀察有無(wú)低鈣性口周麻木、抽搐,迷走神經(jīng)反應(yīng)性面色蒼白,低血容量性面色蒼白、暈厥[22]。d)腫瘤患者 APBSC移植后腫瘤可能復(fù)發(fā)。

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