土壤微生物群落表征中磷脂脂肪酸（PLFA）方法研究進展

張瑞娟 ，李 華 ，林勤保 ，張 強 ，郜春花

（1.山西大學環(huán)境與資源學院，山西太原030006；2.山西大學應用化學研究所，山西太原030006；3.山西省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)環(huán)境與資源研究所，山西太原030006）

土壤微生物（edaphon）是整個微生物界的重要成員。土壤具備微生物生存的基本條件，即營養(yǎng)物質(zhì)（有機質(zhì)、無機鹽、水分等）、自然環(huán)境（溫度恒定，中性環(huán)境）、生存空間（有氧或無氧），這些使得土壤成為微生物活動最適宜的場所，所以土壤素有微生物的“天然培養(yǎng)基”之稱。土壤中的微生物較水體和大氣中的數(shù)量要大，種類要多，因而土壤被稱為“微生物的大本營”[1]。

土壤微生物是土壤的重要組成部分，它對土壤肥力的形成和轉(zhuǎn)化起著積極作用[2-5]。土壤微生物群落是土壤生物區(qū)系中最重要的功能成分，土壤微生物本身不僅是土壤養(yǎng)分重要的來源，支撐著土壤肥力，還對其所生存的微環(huán)境十分敏感，能對土壤生態(tài)機制變化和環(huán)境脅迫做出反應，導致群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。所以，土壤微生物群落被認為是土壤生態(tài)系統(tǒng)變化的預警及敏感指標，指示土壤質(zhì)量變化。

土壤微生物生態(tài)學研究的蓬勃發(fā)展很大程度上歸功于其研究方法的改進[6]。隨著分子生物學的發(fā)展，用于評價土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的新方法主要有Biolog法、磷脂脂肪酸（Phospholipid Fatty Acid，PLFA）法、DGGE（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis）法等。鄭華等[7]對 Biolog法在土壤微生物群落功能多樣性研究中的應用進行了綜述。Xue等[8]用 Biolog，DGGE，PLFA 方法對不同利用方式（荒地、森林、茶園）的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)做了對比研究。Zaady等[9]結(jié)合PLFA，DGGE，物理及生物生理的方法對3種干旱水平（半干旱、干旱、過度干旱）的生物土壤結(jié)皮結(jié)構(gòu)的微生物量及多樣性進行調(diào)查研究，結(jié)果表明，半干旱地區(qū)革蘭氏陽性（G+）和革蘭氏陰性（G-）的生物標記物明顯高于過度干旱地區(qū)，不同干旱水平下生物土壤結(jié)皮的不同可以作為評價全球氣候變化的依據(jù)。王曙光等[10]對Biolog法、PLFA法、DGGE法進行了闡述和比較，認為這3種方法均能針對土壤微生物特性、微生物群落結(jié)構(gòu)和功能變化及差異進行獨立分析。

本文重點對PLFA法研究進展作一介紹。

1 土壤中磷脂脂肪酸（PLFA）簡介

磷脂幾乎是所有微生物細胞膜的重要組成成分，含量在自然生理條件下相對穩(wěn)定，約占細胞干質(zhì)量的5%，只存在于活體細胞膜中，一旦生物細胞死亡，磷脂類化合物會迅速降解[11]。由于不同種類微生物體內(nèi)含有的磷脂脂肪酸（PLFA）的組成及含量差異顯著，一些脂肪酸可能只存在于某類微生物的細胞膜中，如：脂肪酸15∶0，i15∶0，a15∶0，17∶0，18∶1ω7 等用來表征細菌[11-12]；cy17∶0，cy19∶0 指示厭氧菌[11，13]；16∶0，18∶2ω6 等用來指示真菌；15∶0，a15∶0，i15∶0，10Me18∶0 等用來指示放線菌[11]；10Me16∶0，i15∶0，a15∶0，i16∶0，i17∶0，a17∶0 等表征革蘭氏陽性菌 （G+）；16∶1ω5c，16∶1ω7t，16∶1ω9c，18∶1ω5c，18∶1ω7c，cy17∶0，cy19∶0等可指示革蘭氏陰性菌（G-）[12]。所以，PLFA可以作為微生物生物量和群落結(jié)構(gòu)變化的特征微生物標記物[13]，且適合于微生物群落的動態(tài)監(jiān)測[14]。

2 PLFA方法介紹

2.1 土壤的預處理

Stenberg等[15]比較了土樣在（2±2）℃和（-20±2）℃下保存 1，3，6，13 個月對土壤微生物量的影響，研究結(jié)果顯示，土樣在-20℃下保存13個月的測定結(jié)果與鮮土的分析結(jié)果幾乎相同。該結(jié)果為我們在野外進行大批量采樣而無法及時完成分析測試工作，需經(jīng)過冷凍保存過程提供了理論依據(jù)。

吳愉萍等[16-17]研究了不同土壤質(zhì)量、土壤含水量、保存條件（鮮土和-70℃下冷凍干燥1 a的土壤）及提取方法（單個提取和連續(xù)提?。LFA方法的影響，結(jié)果表明，隨著土壤質(zhì)量的增加，檢測到的PLFA越多，這就要求對于同一組試驗要保持土壤質(zhì)量的恒定；調(diào)節(jié)土壤含水量沒有對PLFA的譜圖產(chǎn)生顯著影響；自制柱與商品柱（SPE柱）得到的結(jié)果幾乎相同；經(jīng)冷凍干燥保存的土壤PLFA總量顯著下降，PLFA譜圖也發(fā)生了變化，因此，最好盡早對采集到的土樣進行PLFA分析。

劉岳燕[18]研究了淹育水稻土壤預處理與保存方法（淹育、淹育晾干、淹育冷凍、淹育晾干冷凍、淹育晾干冷藏）對土壤微生物多樣性的影響，結(jié)果證實，淹育水稻土的預處理和不同保存方法影響微生物群落結(jié)構(gòu)，通過進一步分析發(fā)現(xiàn)，淹育冷凍處理的土壤微生物多樣性與淹育對照處理的結(jié)果更接近，表明淹育冷凍處理對淹育土壤微生物結(jié)構(gòu)多樣性的影響較小。

?ernohlávková 等[19]研究了不同的保存溫度（4℃冷藏、-20℃冷凍、自然風干）和保存時間（2，4，8，16，32 周） 對土壤微生物生物量碳的影響，結(jié)果表明，保存時間超過4周，微生物生物量碳會發(fā)生顯著變化；-20℃冷凍保存8～16周，微生物生物量碳含量顯著降低；自然風干保存8周之后微生物量碳也顯著降低；4℃冷藏保存產(chǎn)生的影響最小，但并未對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化作出評價。

劉艷青等[20]研究了新鮮和凍干土樣對河濱緩沖帶土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明，用凍干土測定的微生物群落結(jié)構(gòu)分布與用新鮮土測定的結(jié)果密切相關(guān)（r＝0.972，P＜0.000 1），但凍干土測定的PLFA總量的變異系數(shù)小于新鮮土樣，且用凍干土測得的PLFA總量、種類和樣品分析過程中加入的內(nèi)標回收率均大于新鮮土樣，最終得出利用PLFA法分析土壤微生物群落結(jié)構(gòu)時采用凍干土樣更加適合。

有很多學者對土樣的保存條件做了研究，但其結(jié)果不統(tǒng)一，甚至相反。Stenberg等[15]對造成這種結(jié)果的原因進行了探討，得出3個主要原因：一是微生物對特定的環(huán)境有適應能力，而自然條件不恒定；二是采樣時微生物的生長狀態(tài)不一，生長旺盛的細胞對冷凍或冷藏更為敏感；三是外界條件與微生物自身生長環(huán)境的差異幅度大小可能對微生物量產(chǎn)生影響。

2.2 PLFA的提取方法

常用的PLFA提取方法有2種[21]，一種是PLFA（Phospholipid Fatty Acid）法，另一種叫 EL提取法（Ester-Linked Extraction Method），也叫TSFAME（TotalSoilFattyAcidMethylEsters）法。2 種方法的主要區(qū)別[22]：前者分析的PLFA僅來自活體細胞膜，可了解土壤微生物群落的即時狀態(tài)；后者分析的PLFA部分來自土壤穩(wěn)定有機質(zhì)（土壤腐殖質(zhì)、根系），反映土壤微生物代謝史。MIDI法是21世紀初新興起的一種直接提取脂肪酸的方法，最先應用于細菌純培養(yǎng)的分離鑒定，后推廣到土壤領(lǐng)域。

2.2.1 Phospholipid Fatty Acid（PLFA）法 此方法由Bligh等[23]于1959年創(chuàng)建，采用提取劑氯仿∶甲醇∶水，提取凍魚中的脂質(zhì)物質(zhì)，方法簡便、快速，但此方法當時僅限于食品，特別是魚類的磷脂提取。隨著現(xiàn)代研究領(lǐng)域的拓寬，該方法也被用于諸如土壤等其他方面，但前提是必須保證氯仿∶甲醇∶水的體積比為1∶2∶0.8。20世紀70年代末，White等[24]將提取劑改為氯仿∶甲醇∶磷酸鹽緩沖液（體積比為1∶2∶0.8），對江河、海洋沉積物中的微生物區(qū)系進行分析研究，并指出氯仿∶甲醇∶水的體積可以改變，只要滿足在單一相萃取中體積比為1∶2∶0.8，在第2階段分離時維持在1∶1∶0.9即可。20世紀90年代初，F(xiàn)rosteg?rd 等[25]認為，用酸性檸檬酸代替中性磷酸鹽緩沖液提取酸性高的有機質(zhì)土壤，可提高磷脂回收率且避免無機磷污染。

PLFA法通用的步驟概括為 3步[26-28]：（1）提?。ㄌ崛槁确隆眉状肌脵幟仕峋彌_液＝1∶2∶0.8，取上清液，提取2次，合并上清液，加檸檬酸緩沖液和氯仿，使氯仿∶甲醇∶檸檬酸緩沖液＝1∶1∶0.9，下層液（氯仿相）中包含磷脂）；（2）分離（固相萃取柱，洗脫劑為氯仿、丙酮、甲醇，收集甲醇相）；（3）甲酯化（甲醇∶甲苯混合液（體積比為1∶1），KOH甲醇溶液（新鮮配制），水?。?。

2.2.2 EL提取法 該方法由 Schutter等[29]于2000年提出，也叫溫和堿性甲酯化法。具體步驟為：將15 mL的0.2 mol/L的KOH甲醇溶液和3 g的新鮮土樣加到35 mL的玻璃離心管中，混合均勻，在37℃下溫育1 h（脂肪酸釋放，并甲酯化，樣品10 min渦旋1次）。培養(yǎng)結(jié)束后，加入3 mL 1.0 mol/L的醋酸溶液中和pH值，充分搖勻。隨后加入10 mL正己烷，480 r/min離心10 min，使磷脂脂肪酸（PLFA）轉(zhuǎn)移到有機相中，將上層正己烷轉(zhuǎn)至干凈試管中，在氮氣流下吹干溶劑。將磷脂脂肪酸（PLFA）溶解在0.5 mL體積比為1∶1的正己烷∶甲基丁基醚溶液中。

2.2.3 MIDI提取法（MIDI Extraction Method）[29-30]

該方法操作簡單，提取的脂肪酸來自土壤微生物、土壤腐殖質(zhì)和植物根系。該方法分4步進行：（1）皂化（NaOH 甲醇溶液，水?。唬?）甲酯化（HCl∶甲醇（1∶0.85），水?。?；（3）提?。w積比為1∶1的正己烷∶甲基丁基醚溶液）；（4）洗滌（NaOH溶液）。與EL提取法相比，該方法多了洗滌步驟。

2.3 PLFA的鑒定方法

2.3.1 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（High Performance Liquid Chromatography-MassSpectrometry，HPLCMS）[22，31-33]HPLC-MS可分析完整磷脂種類（極性頭部）與脂肪酸側(cè)鏈（非極性尾部），能展示最初活體細胞膜磷脂分子所承載的全部信息。液質(zhì)聯(lián)用的缺陷是一般沒有商品化的譜庫對比查詢，只能自己建庫或自己分析譜圖。目前，HPLC-MS在環(huán)境領(lǐng)域主要應用于有標準物質(zhì)參照下的定性分析。該方法多用于食品方面，土壤方面應用較少。

2.3.2 Sherlock MIS4.5系統(tǒng)（Sherlock Microbial Identification System）[34-38]美國MIDI公司開發(fā)的基于細菌細胞脂肪酸成分鑒定的Sherlock MIS4.5系統(tǒng)，含有碳原子數(shù)在8～20（C8-C20）的116種脂肪酸譜圖庫。MIDI公司已經(jīng)將PLFA技術(shù)商品化，常見的微生物PLFA譜圖基本上都包括在其數(shù)據(jù)庫內(nèi)，儀器要求也由GC-MS降低為GC[39]。

2.3.3 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）[9，40-43]GC-MS以氣相色譜作為進樣系統(tǒng)，質(zhì)譜為檢測器，靈敏度較高，且可獲得更低的檢出限，分析效率也高，可同時做到定性與定量分析。不僅可識別那些不包括在MIDI系統(tǒng)中的脂肪酸，還可排除被MIDI系統(tǒng)錯誤識別的非酯成分；不僅可分析C8-C20的脂肪酸，并且可檢測到大于C30的脂肪酸。

目前，GC-MS和Sherlock MIS4.5系統(tǒng)在土壤微生物群落研究中被廣泛應用[44]。

3 PLFA方法的優(yōu)缺點

與傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)基的微生物分離技術(shù)及生理學、分析生物學方法相比，PLFA方法具有一定的優(yōu)越性[44-47]，具體表現(xiàn)在：（1）不需要分離和培養(yǎng)技術(shù)，即可獲得微生物群落信息，適合微生物群落的動態(tài)追蹤；（2）減少分離和培養(yǎng)過程中的人為誤差，更為快速、簡便、精確；（3）試驗條件要求較低，結(jié)果較為客觀、可靠；（4）能定量描述環(huán)境樣品中的微生物群體；（5）最適合用作微生物群落的總體分析，而不是專一的微生物種類的研究。

雖然PLFA方法在分析土壤微生物群落結(jié)構(gòu)方面有許多優(yōu)勢，但也存在不足之處[22，48-50]：（1）因目前并沒有搞清楚土壤中所有微生物的特征脂肪酸，因此，土壤中存在的某些脂肪酸無法與土壤中特定的微生物對應；（2）不同種類微生物的特征脂肪酸有可能重疊；（3）該方法很大程度上依賴特征脂肪酸來表征微生物群落結(jié)構(gòu)，故標記上的變動將導致群落估算上的誤差；（4）PLFA譜圖分析不能從菌種和菌株的水平精確描述環(huán)境中微生物的種類；（5）土壤中難免會有植物殘體存在，所以植物體內(nèi)的磷脂脂肪酸可能會對土壤微生物群落的分析產(chǎn)生一定的干擾；（6）土樣保存條件不同，得到的PLFA分析結(jié)果也不同，因而在實際研究工作中受到一定限制；（7）PLFA方法不能分析古細菌。

4 結(jié)語

PLFA方法已廣泛應用于土壤微生物群落分析中，但其方法本身仍有改進之處，如分析結(jié)構(gòu)特異性的PLFAs，以不斷完善特定脂肪酸數(shù)據(jù)庫，使PLFA方法更加精確等。隨著PLFA方法的不斷完善，其應用前景將會更加廣闊。

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