辛巴藍(lán)F-3GA修飾的啤酒廢酵母菌親和吸附溶菌酶

摘 要 利用三嗪染料辛巴藍(lán)F-3GA修飾經(jīng)戊二醛交聯(lián)的啤酒廢酵母菌，得到一種新型染料親和吸附劑。辛巴藍(lán)F-3GA的固載量為161.1 mg/g。以溶菌酶為研究對象，考察吸附時間、酶初始濃度、pH值、離子強(qiáng)度等因素對吸附率的影響。結(jié)果表明： 當(dāng)pH＝7.0時，其對溶菌酶有較高的吸附量（229.1 mg/g），吸附性能明顯優(yōu)于未接枝F-3GA的交聯(lián)菌。負(fù)載的溶菌酶用1.0 mol/L NaSCN溶液洗脫，洗脫率高達(dá)89.1％，酶活性保持率為91.0%。將其用于雞蛋清中溶菌酶的分離純化，酶活力收得率為73.5%，純化倍數(shù)為26.7。

關(guān)鍵詞 啤酒廢酵母菌；辛巴藍(lán)F-3GA；染料親和吸附；溶菌酶

1 引 言

溶菌酶（Lysozyme）是糖苷水解酶[1]，因其可選擇性地分解微生物的細(xì)胞壁而具有殺菌、抗病毒、抗腫瘤細(xì)胞等功效，在食品工業(yè)、醫(yī)療、生物學(xué)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[2～4]， 常用于治療慢性鼻炎、急慢性咽喉炎、口腔潰瘍、水痘等疾病[5]。

親和吸附具有高選擇性，可從復(fù)雜生物體系中高效、快速地分離出相應(yīng)的目標(biāo)產(chǎn)品，在蛋白分離純化過程中有廣闊的應(yīng)用前景。目前，染料配基由于價格低廉，性質(zhì)穩(wěn)定，與蛋白結(jié)合容量大，已被固定在葡聚糖、瓊脂糖、殼聚糖等不同基質(zhì)上，并成功用于脫氫酶、激酶、水解酶及血漿類蛋白的分離純化[6～8]。但多數(shù)基質(zhì)性質(zhì)不穩(wěn)定，機(jī)械強(qiáng)度小，價格昂貴，預(yù)處理過程繁瑣，而利用戊二醛交聯(lián)的啤酒廢酵母菌作為吸附基質(zhì)，機(jī)械強(qiáng)度高，非特性吸附較小，廉價易得，既可增大吸附劑在實際中的應(yīng)用范圍，降低染料親和吸附劑成本，還能減輕啤酒廢水的處理負(fù)荷和難度。

啤酒廢酵母菌體表面保留了與活菌體相同的可修飾功能團(tuán)，因而可實現(xiàn)戊二醛交聯(lián)菌上辛巴藍(lán)F-3GA的接枝，制得一種新型染料親和吸附劑。本實驗考察了該吸附劑對溶菌酶的吸附性能，并將其用于雞蛋清中溶菌酶的分離純化，結(jié)果滿意。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

RENISHAW in Via Raman Microscope（UK）；LAMBDAB1035紫外可見分光光度計（美國珀金-埃爾默公司）；SHZ-03恒溫水浴搖床（上?？蚌蝺x器設(shè)備有限公司）；TGL-16G臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；BX51熒光電子顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；MAXI-DRYLYO真空濃縮（凍干）系統(tǒng)（捷克HETO公司）。啤酒廢酵母菌（湖北某啤酒廠）；辛巴藍(lán)F-3GA，溶菌酶，溶壁微球菌干粉均購自Sigma公司；其它試劑均為分析純。

2.2 實驗方法

2.2.1 戊二醛交聯(lián)菌與辛巴藍(lán)F-3GA修飾菌的制備 取1.5 g干燥的啤酒廢酵母菌，加50 mL蒸餾水，振蕩1 h，加2 mL 50%戊二醛溶液，于30 ℃水浴搖床中振蕩反應(yīng)14 h后，以去離子水洗滌，冷凍干燥后得交聯(lián)菌。

在100 mL三頸瓶中加入1.0 g交聯(lián)菌，400.0 mg辛巴藍(lán)F-3GA，40 mL蒸餾水，于60 ℃水浴中攪拌反應(yīng)30 min。加入4.0 g NaCl，反應(yīng)30 min后加入0.4 gNa2CO3（調(diào)pH≈10.0）繼續(xù)反應(yīng)3 h，產(chǎn)物趁熱抽濾，用水、乙醇和丙酮反復(fù)洗滌，40 ℃真空干燥，得到藍(lán)色修飾菌。

2.2.2 吸附劑合成條件優(yōu)化 取交聯(lián)菌0.5 g，確定反應(yīng)液總體積20 mL，反應(yīng)溫度60 ℃，加入0.2 g無水Na2CO3，按2.2.1節(jié)的方法進(jìn)行三因素三水平正交實驗，反應(yīng)時間 （因素A）為 2、4和6 h；辛巴藍(lán)用量（因素B）為50.0、80.0和100.0 mg；NaCl用量（因素C）為1.0、2.0和3.0 g。

2.2.3 菌體表面形態(tài)及拉曼光譜表征 用熒光電子顯微鏡觀察交聯(lián)前后菌體表面形態(tài)變化。選擇氬離子激光器，激光波長514 nm，對修飾前后菌體進(jìn)行拉曼光譜表征，比較拉曼譜圖變化。

2.2.4 吸附與洗脫實驗 分別取25.0 mg干燥的交聯(lián)菌與修飾菌各3份，置于3個50 mL錐形瓶中，1和2號各加入10 mL磷酸鹽緩沖溶液，3號加入10 mL 0.4 g/L 溶菌酶溶液，放入30 ℃搖床， 130 r/min振蕩吸附4 h， 取上清液。以1號作參比，2號加入初始濃度的酶液作對照，用紫外分光光度計測定280 nm處的吸光度值，計算酶的吸附量。

分 析 化 學(xué)第39卷

第1期陳 聰?shù)龋?辛巴藍(lán)F-3GA修飾的啤酒廢酵母菌親和吸附溶菌酶

用不同濃度的NaCl和NaSCN溶液對吸附了溶菌酶的菌體洗脫。在上述移去上清液的3個錐形瓶中各加入10 mL洗脫劑，30 ℃搖床振蕩4 h后，取上清液，測定溶菌酶含量，計算洗脫率。

2.2.5 雞蛋清中溶菌酶的分離純化及酶活測定 取適量新鮮雞蛋清液，加入等體積的磷酸鹽緩沖液（pH 7.0），攪拌均勻后，以12000 r/min離心15 min去雜質(zhì)，取上清液10 mL做吸附洗脫實驗。并按照文獻(xiàn)[9]，在25 ℃，pH 6.2，波長450 nm條件下，測定吸附洗脫前后純酶液與雞蛋清液的溶菌酶活力，計算活力收得率和純化倍數(shù)。

3 結(jié)果與討論

3.1 交聯(lián)菌與修飾菌的表征

3.1.1 顯微形態(tài) 顯微鏡觀察結(jié)果顯示：未交聯(lián)酵母菌呈球狀分散，菌體間聚集少；交聯(lián)后菌體間集結(jié)明顯，細(xì)胞壁完好。表明菌體因戊二醛而交聯(lián)，機(jī)械強(qiáng)度提高，也使其更易與水分離。 圖1 菌修飾前（a）后和修飾（b）的拉曼光譜圖

Fig．1 Raman spectra of unmodified （a） and modified （b） yeast

3.1.2 拉曼光譜表征 由圖1可見，交聯(lián)菌經(jīng)辛巴藍(lán)F-3GA修飾后，出現(xiàn)了新的Raman譜帶，證明修飾成功。1642 cm－1處的譜帶應(yīng)為CＮ， CＣ的伸縮振動；1044和1026 cm－1為苯環(huán)的面內(nèi)彎曲振動。1163與1325 cm－1 分別為（C）SO2的對稱與反對稱伸縮振動。表明辛巴藍(lán)F-3GA通過活潑的三嗪基氯與菌體表面羥基、氨基反應(yīng)，并直接固載到交聯(lián)酵母菌上。

3.1.3 吸附劑合成條件優(yōu)化 正交實驗極差分析顯示，辛巴藍(lán)F-3GA用量對吸附劑的性能影響較大，隨著辛巴藍(lán)F-3GA用量的增加，吸附率逐漸增大。根據(jù)對溶菌酶的吸附效果數(shù)據(jù)分析，反應(yīng)時間確定為4 h，NaCl用量確定為2.0 g。辛巴藍(lán)F-3GA用量確定為200.0 mg。

3.2 溶菌酶吸附行為的影響因素

3.2.1 吸附時間 考察不同吸附時間下交聯(lián)菌與修飾菌對溶菌酶的吸附速率（見圖2a）。吸附速度在初期較快，隨后減慢，4 h后吸附達(dá)飽和。由于吸附初期菌體表面暴露的吸附位點多，液相中溶菌酶的濃度較高。隨著吸附的進(jìn)行，吸附位點逐漸被占據(jù)，溶液中酶的濃度降低，吸附速率下降。

3.2.2 溶菌酶初始濃度 圖2b顯示，隨溶菌酶初始濃度的增大，吸附量增大。當(dāng)初始濃度為1.5 g/L時，修飾菌達(dá)到最大平衡吸附量（229.1 mg/g）。與交聯(lián)菌相比，修飾菌由于染料配體與酶的特異性作用，修飾菌的吸附量顯著提高，也表明交聯(lián)菌的非特異性吸附較小。

3.2.3 pH值 在pH 5.0～8.5范圍內(nèi)，溶菌酶分子帶正電荷，隨著pH值升高，修飾菌表面SO2－3增加，使吸附量增大。由圖2c可見，當(dāng)pH≥7.0時，修飾菌吸附達(dá)飽和；pH＝7.0時，交聯(lián)菌吸附率僅40%；pH＞7.0后，吸附量變化很大，這可能是因為交聯(lián)形成的Schiff堿的作用。據(jù)文獻(xiàn)[10]報道，pH＞7.0時，溶菌酶活性急劇下降。為保持溶菌酶活性，選定pH＝7.0。

3.2.4 離子強(qiáng)度 由圖2d可知，隨著離子強(qiáng)度的增加，溶菌酶的吸附量明顯減小。這可能是因為離子強(qiáng)度的增加，使溶菌酶分子與配體結(jié)合的空間阻礙和靜電排斥作用增大；同時，鹽離子也會與配體（SO2－3）作用，阻礙溶菌酶與配體的結(jié)合。大多數(shù)蛋白與染料配體間的作用力是特異性與非特異性吸附共存[10]。辛巴藍(lán)F-3GA帶有磺酸基和氨基，并有一定的芳香性，所以離子交換作用與疏水作用也同時存在。圖2 吸附時間（a）、溶菌酶初始濃度（b）、pH值（c）、離子強(qiáng)度（d）對吸附的影響

Fig．2 Effect of contact time （a）， lysozyme （LYS） initial concentration （b）， pH（c）， ionic strength（d） on adsorption

1. 未修飾菌（Unmodified yeast）; 2. 修飾菌（Modified yeast）。

3.2.5 溫度 在15～45 ℃范圍內(nèi)，隨溫度的升高，吸附率增大，溶液中分子熱運(yùn)動加劇，吸附量增加。當(dāng)溫度達(dá)到20 ℃后，吸附率變化不大，表明吸附可在較寬的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。

3.2.6 溶菌酶洗脫及吸附劑的復(fù)用性 隨洗脫液鹽濃度的增加，洗脫率提高，當(dāng)鹽濃度為1.0 mol/L時， NaCl和NaSCN的洗脫率分別為70.7%和89.1%。NaSCN比NaCl有更好的解吸作用。一方面，鹽濃度升高，離子強(qiáng)度增加，溶菌酶與染料配體間的靜電結(jié)合減弱，同時，蛋白構(gòu)象也會因離子強(qiáng)度的增加改變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)疏水作用減弱，促進(jìn)解吸; 另一方面，SCN－極易與蛋白質(zhì)分子結(jié)合，大大促進(jìn)了酶的脫附[12]。

將吸附劑再生，多次重復(fù)吸附-洗脫，吸附率僅減少5%，證明此染料親和吸附劑具有良好的重復(fù)使用性能。

3.3 雞蛋清中溶菌酶的分離純化

實驗測得溶菌酶在吸附前后比活力分別為18667和16996 U/mg，活性保持率為91.0%。從雞蛋清中提取溶菌酶效果理想，活力收得率73.5%，純化倍數(shù)26.7，實驗重復(fù)3次，RSD分別為2.3%和1.3%。

3.4 小結(jié)

用戊二醛交聯(lián)的啤酒廢酵母菌體機(jī)械強(qiáng)度高，溶脹性小，性質(zhì)穩(wěn)定，具有較低的非特異性吸附。實驗測得交聯(lián)菌上的染料固載量為161.1 mg/g，吸附劑比表面積大，對溶菌酶的飽和吸附量為229.1 mg/g，且在吸附過程中溶菌酶的活性保持完好。從雞蛋清中提取溶菌酶的活力收得率較高，純化效果顯著。與商品化的染料親和吸附劑相比，在機(jī)械穩(wěn)定性、染料固載量和蛋白吸附容量等方面均具有一定的優(yōu)勢。

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Adsorption of Waste Beer Yeast Modified with Cibacron Blue

F-3GA for Lysozyme

CHEN Cong ， SUN Xiao-Mei， LI Bu-Hai*

（Key Laboratory of Analytical Chemistry of the State Ethnic Affairs Comission，

South-central University for Nationalities， Wuhan 430074）

Abstract The waste beer yeast was crosslinked with glutaraldehyde and modified with Cibacron B1ue F-3GA. A new dye affinity adsorbent was prepared. The amount of immobilized Cibacron Blue F-3GA on the crosslinked yeasts was 161.1 mg/g. The effects of contact time， initial lysozyme concentration， medium pH and ionic strength on the adsorption of modified yeasts for lysozyme were studied. The dye affinity adsorbents were used for lysozyme purification from chicken egg white. The lysozyme adsorption capacity of the modified yeast was 229.1 mg/g， its adsorption performance was better than the unmodified yeast. The high desorption rate （89.1%） was achieved by using 1.0 mol/L NaSCN as eluate， the rate of activity-preserving was 91.0%. In extracting lysozyme from chicken egg white， the purification fold and average recovery yield of lysozyme activity were 26.7% and 73.5%， respectively. The adsorbents could be reused without significant decreases in the adsorption capacities.

Keywords Waste beer yeast; Cibacron Blue F-3GA; Dye affinity adsorbent; Lysozyme

（Received 15 May 2010; accepted 14 July 2010）