pH值敏感相分離特性的蛋白質(zhì)酶解試劑研究

摘 要 通過(guò)DEC/NHS偶聯(lián)反應(yīng)將胰蛋白酶（Trypsin）連接到具有pH值敏感性的殼聚糖（CS）鏈上。Trypsin-CS偶聯(lián)物保留了CS的pH值敏感相分離特性及Trypsin的酶催化活性。濁度滴定實(shí)驗(yàn)表明，此偶聯(lián)物的臨界相分離pH值（CPSP）仍保持在偏中性范圍內(nèi)，并且隨CS的分子量降低而略有上升。這種偏中性的CPSP值有利于相分離循環(huán)過(guò)程中保持酶的催化活性。分子量為8×104的CS與Trypsin的偶聯(lián)物在存放30 d后可保留69%的初始酶活性。偶聯(lián)物經(jīng)過(guò)6次循環(huán)使用后的殘余活性為初始活性的79%。Trypsin-CS偶聯(lián)物可在低于CPSP值的條件下對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行均相酶解，并在高于CPSP值時(shí)從催化體系中分離出來(lái)。HPLC肽譜分析表明，Trypsin-CS偶聯(lián)物中Trypsin的自降解被顯著抑制，因而有效消除了Trypsin自降解肽段對(duì)肽譜分析的干擾。

關(guān)鍵詞 pH值敏感高分子；胰蛋白酶; 偶聯(lián); 酶活性; 肽譜分析

1 引 言

pH值敏感高分子材料或凝膠是一種能隨pH值的變化而產(chǎn)生體積或形態(tài)改變的材料。這種變化是基于分子水平及大分子水平的刺激響應(yīng)性，因而具有可重現(xiàn)特性。通常，具有pH值響應(yīng)性的高分子材料中含有弱酸性或弱堿性基團(tuán)。隨著介質(zhì)pH值的改變，這些基團(tuán)發(fā)生可逆的電離及去電離過(guò)程，導(dǎo)致大分子鏈段間各種作用力的平衡狀態(tài)發(fā)生變化，引起溶脹體積變化或溶解度的改變。對(duì)于溶解-沉淀可逆的高分子而言，通過(guò)調(diào)節(jié)環(huán)境pH值，可實(shí)現(xiàn)溶解與沉淀狀態(tài)的相互轉(zhuǎn)化。利用此特性，線型pH值敏感高分子可用于生物大分子的分離、酶的固定化和免疫分析的研究[1～4]。

pH值敏感高分子材料具有臨界相分離pH值（Critical phase separation pH point， CPSP）。在此pH值附近，高分子材料發(fā)生溶解及沉淀的兩相轉(zhuǎn)化。在生物分離與分析應(yīng)用領(lǐng)域，接近于中性的CPSP值是該類(lèi)高分子材料的理想特性。因?yàn)榇蠖鄶?shù)生物分子在偏中性條件下能保持最大的活性。殼聚糖（CS）分子中氨基的pKa值在6.3～6.5之間[5]，因此， CS是具有偏中性CPSP值的天然高分子材料。此外， 其豐富的氨基使生物功能分子極易被偶聯(lián)到CS分子鏈上，并使復(fù)合物同時(shí)具備pH值敏感的相分離特性及生物活性。利用復(fù)合物的溶解-沉淀可逆特性，可實(shí)現(xiàn)均相生物催化反應(yīng)、選擇性識(shí)別與結(jié)合，及異相分離[6]。然而胰蛋白酶（Trypsin）的最佳活性pH值在7.0～8.0之間，天然CS的CPSP值仍無(wú)法滿足要求。本研究通過(guò)CS的分子量控制制備CPSP值更接近于中性的Trypsin-CS偶聯(lián)物，在低于CPSP值下進(jìn)行高效的均相酶解反應(yīng)，在高于CPSPH值下將Trypsin-CS進(jìn)行沉淀分離及重復(fù)使用，消除了Trypsin均相催化時(shí)自身酶解產(chǎn)生的肽段對(duì)目標(biāo)蛋白肽譜分析的干擾。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

751-GW分光光度計(jì)（上海分析儀器廠）；Agilent 1100高效液相色譜（美國(guó)Agilent公司）；HY-2調(diào)速振蕩器（江南儀器廠）；移液器（芬蘭雷勃公司）；DKS-A型恒溫水浴鍋（杭州藍(lán)天化驗(yàn)儀器廠）。

殼聚糖（CS， Mw 8.0×105，脫乙酰度96%，浙江海洋生物化學(xué)有限公司）；經(jīng)TPCK處理的胰蛋白酶（Trypsin-TPCK， Worthington公司），牛血清白蛋白（BSA，上海生物工程有限公司）；二硫蘇糖醇（DTT，上海生物工程有限公司），n-苯甲酰-D，L-精氨酸對(duì)硝基苯胺鹽酸鹽（BAPNA，Sigma-Aldrich公司）；三羥甲基甲胺（Tris）；2-（N-嗎啉）乙磺酸（MES）；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽 （EDC）；N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）為生化試劑。 三氟乙酸（TFA，化學(xué)純）；乙腈（CAN，色譜純）；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 不同分子量CS的制備方法[7] 將5 g CS溶解在150 mL 3%醋酸溶液中，逐滴加入50 mL 6% H2O2溶液，在

40 ℃水浴降解。每隔數(shù)小時(shí)，取適量溶液，用10 mol/L NaOH沉淀，以水洗至中性后，用乙醇沖洗，真空干燥備用。不同降解時(shí)間的ＣS在0.1 mol/L乙酸和0.2 mol/L NaCl溶液中于25 ℃下測(cè)定特性粘度數(shù)（η），按下式計(jì)算CS的粘均分子量（Mη）:

η＝0.00181 M0．93η

2.2.2 Trypsin-CS偶聯(lián)物的制備方法 將10 mg CS溶解于5 mL 0.1 mol/L MES 緩沖液（pH＝5.50）中，加入1 mL 5 g/L EDC，1 mL 10 g/L NHS及3 mL 2 g/L Trypsin （比活力為2500 U/mg）-MES溶液，在5～15 ℃條件下反應(yīng)2 h。將溶液調(diào)至堿性，離心沉淀物，用PBS洗滌，除去未偶聯(lián)的Trypsin。將得到的固體分散在0.01 mol/L Tris（含150 mmol/L NaCl，0.1% NaN3，0.2% BSA，pH 8.2），室溫反應(yīng)2 h，封閉剩余的活性位點(diǎn)。反應(yīng)完畢后，用PBS充分洗滌，除去多余的BSA后，得到Trypsin-CS偶聯(lián)物。

分 析 化 學(xué)第39卷

第1期吳蓓蓓等： pH值敏感相分離特性的蛋白質(zhì)酶解試劑研究

2.2.3 CPSP值的測(cè)定 采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定CS及Trypsin-CS體系在不同pH值下的濁度變化，將10 mg CS或Trypsin-CS溶解于5 mL 0.1 mol/L HAc溶液中，調(diào)至pH 4.0，逐滴加入0.1 mol/L NaOH，在pH 4.0～10.0之間，每隔0.5個(gè)pH單位取樣，在543.5 nm下測(cè)定不同pH值下的濁度變化，以濁度對(duì)pH值作圖，濁度突變的pH值即CPSP值。滴加3％醋酸至沉淀中，將溶液緩慢調(diào)至酸性，按上述方法重復(fù)測(cè)定3次。

2.2.4 Trypsin-CS偶聯(lián)物對(duì)BAPNA底物的催化活性測(cè)定

依據(jù)文獻(xiàn)[8]測(cè)定Trypsin的活性，在25 ℃下，以BAPNA為底物進(jìn)行測(cè)定。用1 mL DMSO溶解33 mg BAPNA，即得BAPNA底物溶液。在410 nm下，每分鐘0.001個(gè)單位吸光度的增加值即定義為一個(gè)活性單位（IU）。將適量Trypsin 或Trypsin-CS溶于50 mmol/L MES緩沖液（pH 6.2，含10 mmol/L CaCl2），使其終體積為3.0 mL，加入15 SymbolmA@ L底物溶液，充分混勻，在410 nm下，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度隨時(shí)間的變化值。

2.2.5 Trypsin-CS的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將10 mg Trypsin-CS溶于5 mL MES緩沖液（pH＝6.2）中，在室溫下放置，記錄30 d后酶活性的變化。以自由態(tài)Trypsin作對(duì)照，觀察Trypsin-CS偶聯(lián)物中酶的穩(wěn)定性。

2.2.6 Trypsin-CS在兩相循環(huán)過(guò)程中的穩(wěn)定性變化 在測(cè)定Trypsin-CS對(duì)BAPNA的催化活性后，用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)至pH 8.0，此時(shí)Trypsin-CS沉淀，5000 r/min離心，洗滌，再用MES緩沖液（pH 6.2）溶解，重復(fù)測(cè)定酶活性。按上述方法循環(huán)數(shù)次，分別記錄每個(gè)循環(huán)的酶活性。

2.2.7 Trypsin-CS對(duì) BSA的酶解及產(chǎn)物的HPLC分析[9] 將10 mg Trypsin-CS溶于5 mL MES緩沖液（pH 6.2）中， 取樣500 SymbolmA@ L 置于聚乙烯離心管中，加入170 SymbolmA@ L 0.1 mol/L NH4HCO3，10 ymbolmA@ L DTT和20 SymbolmA@ L 100 g/L BSA溶液，混勻后置于37 ℃下進(jìn)行酶解反應(yīng)。一定時(shí)間后加入0.1 mol/L NaOH終止消解反應(yīng)，并將Trypsin-CS沉淀。過(guò)濾后，用HPLC檢測(cè)酶解產(chǎn)物。以乙腈和0.1% 三氟乙酸為流動(dòng)相，Hypersil C8 蛋白質(zhì)分析柱（20 cm ×4.6 cm， 5 SymbolmA@ m）為固定相，分離水解所得的肽段溶液。流速為1.0 mL/min，乙腈在0～30 min變化為5%～70%，對(duì)肽段進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。

2.2.8 Trypsin自消解產(chǎn)物的HPLC分析分別將5 mg Trypsin 及10 mg Trypsin-CS溶于5 mL MES緩沖液（pH 6.2）中， 取樣500 SymbolmA@ L置于聚乙烯離心管中，加入170SymbolmA@ L 0.1 mol/L NH4HCO3和10 SymbolmA@ L DTT。混勻后置于37 ℃下進(jìn)行酶的自消解反應(yīng)。按上述同樣的HPLC分析條件測(cè)定自消解產(chǎn)生的肽段。

3 結(jié)果與討論

3.1 Trypsin-CS偶聯(lián)物的制備

EDC/NHS體系常采用蛋白質(zhì)偶聯(lián)，EDC可活化Trypsin分子中的COOH，與NHS生成較穩(wěn)定的中間產(chǎn)物，此中間產(chǎn)物可與CS中的氨基反應(yīng)，生成Trypsin-CS偶聯(lián)物。此偶聯(lián)反應(yīng)過(guò)程如圖解1所示。

圖解1 Trypsin與CS偶聯(lián)反應(yīng)示意圖

Scheme 1 Diagram of conjugate reaction between trypsin and chitosan （CS）

當(dāng)固定EDC/NHS的用量及活化時(shí)間后，可以通過(guò)反應(yīng)體系中的CS與Trypsin的比例控制CS鏈中的氨基與Trypsin的偶聯(lián)率。實(shí)驗(yàn)表明，隨著Trysin在反應(yīng)體系中的比例增加，單位質(zhì)量的偶聯(lián)物酶活性增大， CS中有更多的氨基糖單元與Trypsin偶聯(lián)。酶活性測(cè)定結(jié)果表明，在上述實(shí)驗(yàn)條件下，獲得的 Trypsin-CS偶聯(lián)物中Trypsin的總活力為8500 U。反應(yīng)體系中共投加15000 U Trypsin， 因此約有56.7% Trypsin與CS偶聯(lián)。將Trypsin-CS沉淀后，測(cè)定上清液的酶活力發(fā)現(xiàn)，占初始總活力25%的酶殘存于溶液中。兩者總活力之和小于初始總活力，說(shuō)明在EDC/NHS偶聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中部分酶失活， 也可能是由于Trypsin與CS偶聯(lián)后， 活性位點(diǎn)受到空間位阻，而導(dǎo)致酶活性的降低。偶聯(lián)物中酶活力的存在，直接證明了Trypsin與CS發(fā)生偶聯(lián)。

3.2 CS 分子量對(duì)偶聯(lián)物CPSP值的影響

pH值敏感高分子在處于CPSP值時(shí)發(fā)生溶解與沉淀的兩種狀態(tài)的轉(zhuǎn)化。對(duì)于CS及其衍生物而言，當(dāng)pH＜CPSP時(shí)，CS鏈中的氨基質(zhì)子化產(chǎn)生靜電排斥作用，而使CS或其偶聯(lián)物溶解；當(dāng)pH＞CPSP時(shí)，靜電排斥作用消失，糖鏈之間的氫鍵及骨架間的疏水作用使高分子鏈團(tuán)聚而發(fā)生沉淀，

圖1 CS分子量對(duì)Trypsin-CS偶聯(lián)物ＣPSP值的影響

Fig．1 Effect of chitosan molecular weight on the critical phase transitional pH（CPSP）

當(dāng)CS偶聯(lián)生物分子后， pH值敏感的相分離特性仍然能保留。用于生物催化和生物分離的高分子材料，其CPSP越接近中性越好。如果CPSP遠(yuǎn)離中性值，在相分離過(guò)程中有可能導(dǎo)致生物分子失活。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CS的分子量對(duì)偶聯(lián)物的CPSP值有一定的影響。圖1表明，隨CS的分子量的增加，CPSP值趨向酸性；而CS分子量降低時(shí)，CPSP值向中性接近。由此可見(jiàn)，采用較低分子量的CS較為有利。但分子量過(guò)低時(shí)，CS不再具有相分離特性，既在所有pH值下均呈溶解狀態(tài)。本研究中選用分子量為8SymboltB@ 104的CS，其CPSP值為6.36。在pH<6.36時(shí)，CS為溶解狀態(tài)；pH>6.36時(shí)，則為聚沉狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)CS與Trypsin偶聯(lián)后，偶聯(lián)物的CPSP值未發(fā)生明顯變化。

3.3 Trypsin-CS偶聯(lián)物在多次相分離過(guò)程中的活性回收率 圖2 多次相分離循環(huán)過(guò)程中的酶活性回收率變化

Fig．2 Recovery of residual enzyme activity during phase transitional cycles

由于Trypsin與分子量為8×104的CS的偶聯(lián)物仍具備pH值敏感特性，因此可通過(guò)調(diào)節(jié)溶液體系的pH值實(shí)現(xiàn)均相酶催化，并通過(guò)相分離將Trypsin-CS偶聯(lián)物回收重復(fù)使用。在循環(huán)使用過(guò)程中，酶活性的變化程度是評(píng)價(jià)該類(lèi)偶聯(lián)物性能的重要指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)中，將初始酶活性設(shè)定為100%，經(jīng)過(guò)各次相分離循環(huán)后，將所測(cè)得的偶聯(lián)物的酶活性與初始活性比較，既可得到各次循環(huán)的酶活性回收率，結(jié)果如圖2所示。在6次循環(huán)過(guò)程中，酶的活性回收率總體呈降低趨勢(shì)，但降低幅度不大。經(jīng)過(guò)第6次相分離循環(huán)后，殘余酶活性仍達(dá)79%，說(shuō)明相分離循環(huán)過(guò)程中的環(huán)境改變對(duì)酶的活性變化影響較小。這可能是由于所制備的Trypsin-CS偶聯(lián)物的CPSP在接近于中性條件（在pH 6.0～7.0之間循環(huán)變化）下，實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)物的相分離循環(huán)過(guò)程，在此pH范圍內(nèi)，不至于引起Trypsin的構(gòu)象發(fā)生較大變化，有利于酶活性的保留。文獻(xiàn)[10]報(bào)道，漆酶（Laccase）與CS偶聯(lián)物在經(jīng)過(guò)多次相分離循環(huán)后也能保持較高的活性回收率。少量活性的損失可能是由于偶聯(lián)物相分離過(guò)程中質(zhì)量回收率也有一定程度的降低。此外，游離態(tài)Trypsin通常在pH 7.0～8.0的范圍內(nèi)保持最佳催化活性。本研究發(fā)現(xiàn)，Trypsin-CS偶聯(lián)物在pH 6.2條件下也能保持較高的催化活性。隨pH值的降低，此偶聯(lián)物的生物催化活性有所降低，但其活性對(duì)pH值敏感性明顯低于游離態(tài)Trypsin。這可能是由于偶聯(lián)物中的Trypsin被高分子鏈纏繞，增加了其構(gòu)象的穩(wěn)定性。

3.4 Trypsin-CS偶聯(lián)物的活性穩(wěn)定性

研究表明，Trypsin 溶液在保存過(guò)程中酶活性降低程度較大，在室溫存放30 d后，殘余酶活性?xún)H約為初始活性的5%[7]。Trypsin的自降解是引起存放過(guò)程中活性損失的主要原因，這是因?yàn)樽杂蓱B(tài)的酶分子之間極易相互碰撞而產(chǎn)生催化降解作用。實(shí)驗(yàn)表明，Trypsin-CS偶聯(lián)物在經(jīng)過(guò)30 d存放后仍能保存69%的初始酶活性，與固定化Trypsin的活性穩(wěn)定性相似[7]。盡管Trypsin-CS在保存時(shí)仍以溶液狀態(tài)存在，但偶聯(lián)于CS鏈上的Trypsin分子自由度較小，相互之間進(jìn)行催化降解的能力顯著降低。

3.5 Trypsin-CS偶聯(lián)物與自由態(tài)Trypsin對(duì)BSA的酶解及自身酶解程度比較

Trypsin是蛋白質(zhì)肽譜分析中的常用酶解試劑。采用自由態(tài)Trypsin對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解時(shí)，Trypsin本身的自降解產(chǎn)生的肽段極有可能對(duì)肽指紋圖譜（Peptide fingerprint mapping）的分析產(chǎn)生干擾。采用固定化酶對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行降解可有效避免此問(wèn)題。但在試樣量較小的情況下，固定化酶的固相基質(zhì)對(duì)微量蛋白的吸附會(huì)大大降低肽譜分析的靈敏度。采用Trypsin-CS偶聯(lián)物在均相條件下對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行降解，既可提高酶解效率，又可顯著降低Trypsin的自降解程度。文獻(xiàn)[11]的研究表明，CS對(duì)蛋白質(zhì)的非特異性吸附較小，因而相分離后的偶聯(lián)物對(duì)降解產(chǎn)物的吸附應(yīng)低于常用的固定化酶基質(zhì)。圖3a為自由態(tài)Trypsin與BSA在37 ℃下恒溫2 h后降解產(chǎn)物的HPLC圖。由于試樣中除了BSA降解的肽段外，還存在Trypsin及其自降解產(chǎn)物，這些物質(zhì)的存在對(duì)BSA肽段的HPLC分離產(chǎn)生了干擾。圖3a的插圖為T(mén)rypsin自降解24 h后的HPLC圖，進(jìn)一步證明了自降解肽段的存在。圖3b表明，以Trypsin-CS偶聯(lián)物作為酶解試劑時(shí)，BSA降解產(chǎn)物的HPLC色譜峰之間有更好的分辨率，這是由于HPLC試樣中Trypsin-CS已經(jīng)被相分離而去除，而且自降解幾乎被抑制（圖3b插圖）。由此可見(jiàn)，具有pH值敏感相分離特性的Trypsin-CS偶聯(lián)物可有效避免Trypsin及其自身降解產(chǎn)物對(duì)蛋白質(zhì)肽譜分析的干擾。

圖3 BSA經(jīng)Trypsin（a）及Trypsin-CS（b）酶解后的HPLC肽譜以及Trypsin自降解肽段的液相色譜圖

Fig．3 HPLC peptide map of bovine serum albumin（BSA） digested by trypsin（a） and Trypsin-CS（b） Conjugant， the inset is the self-digestive peptide fragment of trypsin

a. BSA被Trypsin水解2 h的肽譜， 插圖為自降解產(chǎn)物肽譜（Peptide map of BSA digested by free trypsin for 2 h， peptide map of self-digestive product is shown on the inset）; b. BSA被Trypsin-CS水解2 h的肽譜， 插圖為自降解產(chǎn)物肽譜（Peptide map of BSA digested by trypsin-CS for 2 h）\\.

4 結(jié) 論

Trypsin-CS偶聯(lián)物同時(shí)具備了酶催化活性和pH值敏感的相分離特性，使之兼具均相酶催化的高效特性及固定化酶的的高穩(wěn)定性及重復(fù)使用性。作為蛋白質(zhì)降解試劑可有效避免酶自身降解產(chǎn)物對(duì)蛋白質(zhì)肽譜分析的干擾。此高分子酶解試劑有望用于微通道內(nèi)壁的蛋白酶修飾，制備高效酶解微反應(yīng)器。

References

1 Chen J， Hoffman A. Biomaterials， 1990， 11（9）: 631～634

2 Sharma S， Kaur， P， Jain， A， Rajeswari M， Gupta M. Biomacromolecules， 2003， 4（2）: 330～336

3 Monji N， Hoffman A， Priest J， Houghton R. US Patent， US 4，780，409

4 Alarcon C， Pennadam S， Alexander C. Chem. Soc. Rev.， 2005， 34（3）: 276～285

5 Shahidi F， Arachchi K， Jeon Y. Trends in Food Sci. Tech.， 1999， 10（2）: 37～40

6 Hoffman A， Stayton P. Prog. Polym. Sci.， 2007， 32（8-9）: 922～932

7 ZHAO Jia-Yin， WU Jian-Min（趙佳胤， 鄔建敏）. Chinese J. Anal. Chem.（分析化學(xué)）， 2006， 34（11）: 1555～1559

8 Xi F， Wu J， Jia Z， Lin X. Process Biochemistry， 2005， 40（8）: 2833～2840

9 LUAN Ming-Ming， WU Jian-Min（欒明明，鄔建敏）. Chinese J. Anal. Chem.（分析化學(xué)）， 2006， 34（12）: 1707～1710

10 Rafael V， Raunel T， Paul D， Timmie L， Payne G. Bioconjugate Chem.， 2001， 12（2）: 301～306

11 Xi F， Wu J. J. Chromatogr. A， 2004， 1057（1-2）: 41～47

pH Sensitive Phase Transition and Enzyme Activity of

Trypsin-Chitosan Conjugant

WU Bei-Bei， SHANG Yun-Ling， WU Jian-Min*

（I(xiàn)nstitute of Microanalytical System， Department of Chemistry， Zhejiang University， Hangzhou 310027）

Abstract Trypsin-chitosan conjugant was prepared by coupling trypsin with chitosan （CS） through the method of 1-（3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide/N-hudroxysuccinamide （EDC/NHS） coupling reactions. The resulting conjugant had borne both characteristics of pH-sensitive phase transitional behavior and enzyme catalytic activity. The critical phase transitional pH point （CPSP） of the conjugant was determined by turbid titration method. The results show that CPSP value increase with the decrease of chitosan molecular weight. The CPSP value of CS and its trypsin conjugant could reach 6.36 when the chitosan with molecular weight of 8×104 was used. The near neutral CPSP is in favor of stabilizing the enzyme activity during the cyclic procedure of phase transition. Trypsin-CS conjugant could preserve 69% of initial enzyme activity after 30 days storage， and 79% of enzyme activity was observed after 6 cyclic phase transitional procedure. Trypsin-CS conjugant could catalyze the degradation of BSA in homogeneous phase when the pH of solution is slightly less than CPSP value. The conjugant could be recovered by precipitating it from solution when the pH is higher than CPSP value. HPLC results demonstrated that the self degradation of trypsin was significantly inhibited and the interference from the self-degraded peptide could be eliminated in the peptide fragment mapping.

Keywords pH sensitive polymers; Trypsin; Conjugation; Enzyme activity; peptide fragment mapping

（Received 11 April 2010; accepted 27 June 2010）