加速溶劑萃取凝膠滲透色譜/固相萃取凈化氣相色譜質(zhì)譜法測(cè)定咸魚(yú)中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留

摘 要 建立了咸魚(yú)中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的分析方法。乙腈為溶劑，樣品經(jīng)ASE萃取，提取液用凝膠滲透色譜除去脂類(lèi)、蛋白質(zhì)和大部分的色素，再經(jīng)Carb/PSA小柱凈化。采用GC-MS定性分析，GC-FPD定量分析。加標(biāo)水平為0.05～0.20 mg/kg時(shí)，農(nóng)藥的回收率為64.5%～98.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差2.7％～14.7％。方法的檢出限為0.6～9.0 SymbolmA@ g/kg（以3倍性噪比計(jì)）。本方法具有提取效率高，凈化效果好，回收率高，準(zhǔn)確靈敏等優(yōu)點(diǎn)，適用于咸魚(yú)中農(nóng)藥殘留檢測(cè)實(shí)際工作的需要。

關(guān)鍵詞 加速溶劑萃取; 凝膠滲透色譜; 固相萃取; 氣相色譜-質(zhì)譜; 有機(jī)磷; 咸魚(yú)

1 引 言

食品中的農(nóng)藥殘留嚴(yán)重影響人們的健康與安全。咸魚(yú)加工銷(xiāo)售過(guò)程中，不法商販常向咸魚(yú)噴淋、浸泡有機(jī)磷農(nóng)藥來(lái)防治蚊蠅和蛆蟲(chóng)，嚴(yán)重威脅人們的健康。因此，準(zhǔn)確、快速測(cè)定此類(lèi)食品中的有機(jī)磷殘留具有重要意義。目前，檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥方法主要有分光光度法[1]、熒光法[2]、流動(dòng)注射法[3，4]、電化學(xué)法[5，6]、膠束電動(dòng)色譜[7]、電流動(dòng)分析法[8]、傳感器法[9]、氣相色譜法[10，11]、液相色譜法[12]、氣質(zhì)聯(lián)用[13，14]法和液質(zhì)聯(lián)用法[15]等。文獻(xiàn)研究集中于蔬菜、凈潔水體和土壤樣品，采用GC-MS法測(cè)定咸魚(yú)中有機(jī)磷農(nóng)藥的殘留尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究基于咸魚(yú)樣品農(nóng)藥殘留萃取難的特點(diǎn)，采用加速溶劑萃取法提取樣品，相比于傳統(tǒng)提取方法，顯著提高萃取效率、減少分析時(shí)間并降低了環(huán)境污染；采用凝膠滲透色譜/固相萃取聯(lián)用凈化模式，能完全除去樣品中脂類(lèi)、色素等雜質(zhì)， 實(shí)現(xiàn)了咸魚(yú)中農(nóng)藥殘留的CG-MS分析。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Trace-DSQⅡ氣質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)Thermo公司）；7890A氣相色譜儀（配FPD檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司）；350型加速溶劑萃取儀（美國(guó)Dione公司）；AccuPrepTＭ/AccuVap凝膠滲透色譜儀（配450 mm×15 mm凈化柱，Bio-Beads S-X3填料，美國(guó)J2 Scientific公司）；GX-274全自動(dòng)固相萃取儀（法國(guó)Gilson公司）；Syncore多樣品定量濃縮儀（瑞士BＣHＩ公司）；MS1渦旋振蕩器（德國(guó)IKA公司）；N7/H馬弗爐（德國(guó)Nabertherm公司）；色譜柱：DB-1701石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm， 0.25SymbolmA@ m，美國(guó)Agilent公司）；Carb/PSA固相萃取小柱（500 mg/6 mL， 美國(guó)Supelco公司）；敵敵畏、甲胺磷、乙酰甲胺磷、甲拌磷、治螟磷、氧樂(lè)果、久效磷、磷胺、樂(lè)果、毒死蜱、磷胺、甲基對(duì)硫磷、殺螟硫磷、對(duì)硫磷、甲基異柳磷、水胺硫磷及三唑磷的標(biāo)準(zhǔn)混合液 （1.00 g/L，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心）；所用試劑均為色譜純或分析純。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 樣品提取 在34 mL萃取池依次裝入濾膜、4.00 g切碎混勻的咸魚(yú)樣品及硅藻土混合物。系統(tǒng)壓力為10000 kPa，以80 ℃加熱5 min，靜態(tài)萃取5 min，提取劑為乙腈。用池體積60%的乙腈沖洗萃取池，并用氮?dú)獯祾咻腿〕?20 s，循環(huán)萃取1次。萃取液脫水后，于多樣品濃縮儀中35 ℃真空蒸發(fā)近干，以環(huán)己烷-乙酸乙酯（1∶1，V/V）溶解并定容至10.0 mL， 過(guò)0.452.2.2 樣品凈化 凝膠色譜凈化：流動(dòng)相為環(huán)己烷-乙酸乙酯（1∶1，V/V），流速為5.0 mL/min，樣品定量環(huán)為5.0 mL，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。收集9～15 min組分，35 ℃真空濃縮近干， 用2 mL丙酮-正己烷（1∶1，V/V）溶解，待SPE凈化。固相萃取凈化：以5 mL丙酮-正己烷（1∶1，V/V）淋洗Carb/PSA柱，2 mL樣品全部上樣。待凈化液通過(guò)該柱后，用20 mL丙酮-正己烷（1∶1，V/V）洗脫，收集全部流出液，在35 ℃真空濃縮近干，以丙酮定容至1.0mL，供GC-MS和GC-FPD分析。

2.2.3 儀器條件 （1）氣相色譜-質(zhì)譜條件 初始溫度80 ℃，保持1 min；以20 ℃/min升至200 ℃，保持5 min；以20 ℃/min升至260 ℃，保持10 min。進(jìn)樣口溫度230 ℃，離子源溫度為250 ℃，接口溫度為250 ℃，離子選擇監(jiān)測(cè)（SIM）方式。載氣為高純氦氣，流速為0.5 mL/min，進(jìn)樣量為1 SymbolmA@ L。脈沖不分流進(jìn)樣，脈沖壓力為200 kPa， 脈沖時(shí)間為0.75 min。（2）氣相色譜條件 初始溫度100 ℃，保持1 min；以20 ℃/min升至230 ℃，保持8 min；以20 ℃/min升至260 ℃，保持10 min。進(jìn)樣口溫度230 ℃，檢測(cè)器溫度230 ℃。以氫氣為燃?xì)猓魉?5 mL/min；以空氣為助燃?xì)猓魉?00 mL/min；載氣為高純氮?dú)?，流速為?.5 mL/min，進(jìn)樣量為1 SymbolmA@ L。脈沖不分流進(jìn)樣，脈沖壓力為200 kPa， 脈沖時(shí)間為0.75 min。

3 結(jié)果與討論

3.1 提取方式的優(yōu)化

加速溶劑萃取（ASE）采用高溫高壓模式，增加物質(zhì)溶解度和溶質(zhì)擴(kuò)散效率，具有萃取效率高、用時(shí)短、選擇性好、溶劑用量少及自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)[16]，得到廣泛的應(yīng)用[17]。相比于丙酮和二氯甲烷等溶劑，乙腈萃取出的雜質(zhì)較少，便于凈化處理，且咸魚(yú)中農(nóng)藥殘留集中在魚(yú)體內(nèi)外表面，乙腈與丙酮等溶劑提取效率相當(dāng)。本研究選用乙腈作為提取溶劑。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，萃取溫度高于80 ℃、萃取時(shí)間超過(guò)5 min時(shí)，部分有機(jī)磷農(nóng)藥會(huì)發(fā)生分解，導(dǎo)致回收率下降。按2.2.1節(jié)的條件對(duì)加標(biāo)樣品提取后的殘?jiān)貜?fù)提取一次，未檢出有機(jī)磷農(nóng)藥，說(shuō)明本ASE樣品提取條件下能完全提取咸魚(yú)中的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留。

3.2 凈化方式選擇

3.2.1 凝膠滲透色譜凈化（GPC） GPC凈化可有效去除樣品中的脂類(lèi)、色素、蛋白等大分子干擾物，常用于脂肪含量較高的動(dòng)物源性食品的凈化[18]。本研究采用GPC凈化提取液，咸魚(yú)樣品和17種有機(jī)磷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的GPC紫外色譜圖見(jiàn)圖1。結(jié)果表明：脂類(lèi)、蛋白及絕大多數(shù)色素干擾物在9 min內(nèi)流出GPC柱（如圖1a）；而17種有機(jī)磷目標(biāo)物在9～15 min流出（如圖1b）。收集9～15 min樣品可去除樣品中脂類(lèi)、蛋白及絕大多數(shù)色素干擾物，而不損失目標(biāo)物。殘余少量小分子雜質(zhì)可用SPE凈化除去。

圖1 咸魚(yú)樣品（a）和17種有機(jī)磷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的GPC色譜圖（b）

Fig．1 Gel permeation chromatogram of salt fish （a） and standard of 17 organophosphrous （b）

3.2.2 固相萃取凈化 石墨化碳黑小柱對(duì)色素的吸附效果良好，N-丙基乙二胺柱（PSA柱）能有效地吸附有機(jī)酸和糖分等，Carb/PSA柱處理咸魚(yú)樣品，凈化效果較好。比較了丙酮-正己烷（1∶1，V/V）和乙腈-甲苯（3∶1，V/V）兩種洗脫劑發(fā)現(xiàn)， 20 mL兩種溶劑均能將目標(biāo)物洗脫下來(lái)，但丙酮-正己烷毒性較小且沸點(diǎn)較低，后續(xù)濃縮較方便，故本研究選用丙酮-正己烷為洗脫劑。凈化液過(guò)Carb/PSA小柱后，35 ℃真空濃縮近干，以丙酮定容至2.0 mL，供GC-MS及GC-FPD分析。

3.3 線性范圍及檢出限

用咸魚(yú)基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)試。結(jié)果表明，在10.0～1000.0 SymbolmA@ g/L范圍內(nèi)，峰面積值與有機(jī)磷農(nóng)藥濃度呈良好的線性關(guān)系。，按3倍性噪比測(cè)得檢出限，結(jié)果如表1所示。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)

Table 1 Parameters of calibration

序號(hào)

Number化合物名稱(chēng)

Compound name定性離子

Qualitative ions

（m/z）保留時(shí)間tR （min）檢出限

LOD

（mg/kg）

線性回歸方程

Regression equation

相關(guān)系數(shù)

Correlation

coefficient

1

敵敵畏 Dichlorvos109，185，797.110.0020y＝12118x＋197.340.9997

2甲胺磷 Methamidophos

94，95，1417.870.0012y＝18667x＋154.38

0.99933

乙酰甲胺磷 Acephate

136，94，95

10.37

0.0090

y＝3264.8x － 14.71

0.99874

甲拌磷 Phorate

75，97，121

11.80

0.0006

y＝26846x＋154.81

0.99955

治螟磷 Sulfotepp

97，121，322

11.82

0.0008

y＝21124x － 131.29

0.99966

氧樂(lè)果 Omethoate

156，110，79

12.98

0.0036

y＝7720.1x － 104.31

0.99957

久效磷 Monocrotophos

127，97，192

14.20

0.0032

y＝6534.4x＋100.85

0.99978

磷胺Phosphamidon

87，93，125

14.48

0.0074

y＝3564.8x – 23.74

0.99839

樂(lè)果 Dimethoate

127，264，109

14.53

0.0016

y＝13379x＋371.53

0.999910

毒死蜱 Chlorpyrifos

197，199，97

15.25

0.0022

y＝10054x＋276.19

0.999811

磷胺 Phosphamidon

125，109，263

15.40

0.0042

y＝7060.4x ＋ 65.29

0.999312

甲基對(duì)硫磷

Methyl parathion

127，264，109

15.41

0.0022

y＝10283x＋121.41

0.999113

殺螟硫磷 Fenitrothion

125，127，109

15.77

0.0026

y＝9619.4x＋68.65

0.999714

對(duì)硫磷 Parathion

97，109，291

16.16

0.0018

y＝12447x＋262.54

0.999815

甲基異柳磷

Isofenphos-methyl

199，121，58

16.23

0.0022

y＝11236x＋257.5

0.998216

水胺硫磷 Isocarbophos

136，121，109

16.53

0.0048

y＝9310.7x＋21.78

0.999217

三唑磷 Triazophos

161，171，97

20.80

0.0030

y＝6634.3x＋376.98

0.9998

3.4 方法的回收率和精密度

將未檢出有機(jī)磷農(nóng)藥的咸魚(yú)（草魚(yú)）樣品切碎混均，與硅藻土混勻后，裝入萃取池中。向萃取池分別添加水平為0.05， 0.10和0.20 mg/kg的目標(biāo)物，按2.2節(jié)所述的提取、凈化和檢測(cè)條件進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)， 如圖2所示。由圖2可知，有機(jī)磷混標(biāo)在GC-FPD圖譜上可完全分開(kāi)；在GC-MS圖譜上則有15個(gè)峰。保留時(shí)間相近的化合物可根據(jù)不同的定性定量離子，通過(guò)提取離子色譜圖分開(kāi)，如磷胺和樂(lè)果、磷胺和甲基對(duì)硫磷在總離子圖中為一個(gè)色譜峰，通過(guò)采用不同的定量離子（m/z 87和127及m/z 109和127）辨別。結(jié)合GC-FPD和GC-MS圖，可以準(zhǔn)確分析此17種有機(jī)磷農(nóng)藥。圖2 加標(biāo)（0.20 mg/kg）咸魚(yú)樣品的GC-flame photometry detector（FPD）（a）和GC-MSD（SIM）（b）色譜圖

Fig．2 GC-flame photometry detector（FPD） （a） and GC-MSD（b） chromatograms of spiked salt fish sample （0.20 mg/kg）

峰號(hào)同表1（Peak nubers are the same as in Table 1）。

向咸魚(yú)（草魚(yú)）樣品加標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每組加標(biāo)水平平行測(cè)定7次，計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，17種有機(jī)磷3個(gè)添加水平的回收率在64.5％～98.6％之間；RSD在27％～147％之間。其中，敵敵畏回收率偏低，是由于其具有揮發(fā)性，在提取及濃縮過(guò)程造成了部分損失。生物體中有機(jī)磷多殘留，由于高溫易分解且基質(zhì)復(fù)雜，檢測(cè)結(jié)果的重現(xiàn)性較差［19］。本實(shí)驗(yàn)由于提取和凈化條件溫和，且凈化效果良好，故所有組分回收率和精密度均滿足日常檢測(cè)要求。

3.5 樣品測(cè)定

利用本方法對(duì)市場(chǎng)上采集的15份咸魚(yú)樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性樣品2個(gè)，檢出敵敵畏，含量分別為0.082和0.216 mg/kg，見(jiàn)圖3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法可用于咸魚(yú)中有機(jī)磷殘留的定性與定量檢測(cè)，具有提取效率高，凈化效果好，回收率高，定量準(zhǔn)確，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。

圖3 某陽(yáng)性樣品的GC-FPD和GC-MSD（SIM） 譜圖

Fig．3 GC-FPD/MSD（SIM） chromatograms of a salt fish sample

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Determination of Organophosphate Pesticide Residues in Salt Fish

Using Accelerated Solvent Extraction and Gel Permeation

Chromatography/Solid Phase Extraction with Gas

Chromatography-Mass Spectrometry

WANG Yao1，2， LIU Shao-Bin1，2， XIE Cui-Mei1，2， ZHANG Han-Xia1，2， LU Wei-Hua1，2

1（Dongguan Ocean and Fishery Environment Monitoring Station，Dongguan 523079）

2（Dongguan Aquatic Product Quality Supervision And Inspection Station， Dongguan 523079）

Abstract A novel method for the determination organophosphrous pesticides residues in salt fish was established．The target anslytes were extracted by accelerated solvent extraction （ASE） using acetonitrile as the extraction solvent. The gel permeation chromatography was used to remove the grease，protein and pigment and then， the small molecule compounds in the extracted solution were purified by the Carb/PSA solid phase extraction. The qualitative analysis were performed by using mass spectrometric detection GC-MSD（SIM） and quantitative analysis by GC-flame photometry detector（FPD） method．The average recoveries of organophosphrous pesticides were 64.5%－98.6%， spiked at 0.05－0.20mg/kg levels. The relative standard deviations for all the compounds were 2.7％－14.7％. The detection limit of the method varied between 0.0006－0.0090 mg/kg. The method is rapid， precise， sensitive， high efficient.It can be applied to the routine analysis for organophosphrous pesicide resdues in salt fish.

Keywords Accelerated solvent extraction；Gel permeation chromatography; Solid phase extraction；Gas chromatogrpahy-mass spectrometry；Organophosphrous pesticid；Salt fish

（Recived 3 February 2010; accepted 6 July 2010）