納米材料應(yīng)用于DNA檢測(cè)領(lǐng)域的研究進(jìn)展

摘 要 本文主要評(píng)述了近年來納米材料在除了PCR領(lǐng)域以外的DNA檢測(cè)方面的研究進(jìn)展。對(duì)以納米材料（納米粒子、納米纖維、納米線、納米管）為單元， 或以納米器件的制備為實(shí)驗(yàn)方法而開展的DNA檢測(cè)方面的工作進(jìn)行了介紹。研究表明，基于納米材料的DNA檢測(cè)法，無論是在定位、可視化還是多重檢測(cè)等方面都比傳統(tǒng)PCR技術(shù)的檢測(cè)方法表現(xiàn)出其自身的優(yōu)越性。在以納米材料為單元的研究中，基于納米粒子標(biāo)記的DNA檢測(cè)方法研究的最多。本文分別進(jìn)行了例證說明，具體內(nèi)容包括：比色法、熒光檢測(cè)法、共振光散射法、表面增強(qiáng)拉曼光譜法、電化學(xué)法、MALDI-TOF質(zhì)譜分析法、元素分析法。而圍繞納米器件制備方法開展的DNA檢測(cè)研究中，從4個(gè)方面進(jìn)行了介紹：納米排列圖案法、納米電機(jī)械設(shè)備法、納米孔檢測(cè)法和微排列檢測(cè)法。

關(guān)鍵詞 納米材料；DNA檢測(cè)；靈敏度；選擇性；綜述

1 引 言

DNA是遺傳信息的承擔(dān)者，是生物遺傳的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。由于對(duì)每一種生物體來說，核酸的序列都是獨(dú)一無二的。因此，在診斷和識(shí)別各種疾病時(shí)，這些細(xì)菌、病毒、病原體的核酸序列就成為了研究對(duì)象。目前，很多疾病的序列信息已被人們掌握，為了能夠有效抗擊這些疾病，及早和準(zhǔn)確地探測(cè)DNA序列顯得尤為重要。許多研究小組對(duì)基于納米技術(shù)的核酸的序列進(jìn)行了研究，證明其可與傳統(tǒng)的熒光耦合聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase chain reaction， PCR）′DNA檢測(cè)方法相媲美[1～7]。PCR技術(shù)，可以將部分DNA序列進(jìn)行復(fù)制，信號(hào)放大，在靈敏度方面代表了檢測(cè)的極限[8]。而基于納米材料的DNA檢測(cè)手段則在定位、可視化、多重檢測(cè)等方面更具有優(yōu)勢(shì)。因此，為了將針對(duì)核酸為基礎(chǔ)的檢測(cè)手段推廣到一些實(shí)時(shí)的護(hù)理站，像醫(yī)生的辦公室、戰(zhàn)場、第三世界、以及在生物恐怖襲擊事件中第一反應(yīng)現(xiàn)場等場所，促使人們?nèi)ヌ剿鞲臃奖阌行У臋z測(cè)DNA序列的方法。

納米材料是指顆粒尺寸在1～100 nm范圍內(nèi)的超微粒子或其組裝結(jié)構(gòu)，由于其處于微觀區(qū)域，具有許多與同質(zhì)分子不同的物理化學(xué)性質(zhì)，如不同尺寸和形狀的納米粒子表現(xiàn)出顯著不同的光學(xué)性質(zhì)及特殊的磁、電、熱力學(xué)等性能。納米材料還是優(yōu)良的生物分子標(biāo)記物。本文主要綜述了納米材料在除PCR技術(shù)以外的DNA測(cè)序方面研究較多的一些方法。

2 基于納米粒子標(biāo)記的DNA檢測(cè)

2.1 比色法

Elghanian等[9]基于金納米粒子溶液顏色變化對(duì)DNA進(jìn)行了檢測(cè)。在該研究中，用兩種5′端帶巰基的24個(gè)堿基的寡核苷酸通過AuS鍵分別在13 nm的金納米粒子上進(jìn)行組裝，形成兩種帶不同序列寡聚核苷酸的金探針1和2。在24個(gè)堿基中，靠近金納米粒子的前12個(gè)堿基充當(dāng)柔性間隔基團(tuán)，后12個(gè)堿基作為識(shí)別基團(tuán)和目標(biāo)DNA進(jìn)行雜交配對(duì)（圖1）。同時(shí)含有探針1和探針2的溶液呈現(xiàn)紅色。由于一個(gè)納米金上有多個(gè)DNA探針，當(dāng)加入目標(biāo)DNA后，在熔鏈溫度以下，探針1、2與目標(biāo)DNA以頭-尾排列方式（圖1A）或尾-尾排列方式（圖1B）雜交形成網(wǎng)狀的納米金聚集物。由此導(dǎo)致金納米粒子相互靠近，使其質(zhì)譜共振帶移動(dòng)，相應(yīng)的溶液顏色由原來的紅色變?yōu)樽仙?。這種通過顏色變化來檢測(cè)目標(biāo)DNA是一種既快速又簡單廉價(jià)的好方法，不需要昂貴的檢測(cè)儀器，目標(biāo)DNA的檢出限可達(dá)10 nmol/L。

圖1 金納米粒子探針1和探針2以頭-尾排列方式（A）或尾-尾排列方式（B）和目標(biāo)DNA雜交[9]

Fig.1 Head-to-tail （A） and tail-to-tail （B） alignments of gold nanoparticle probes[9]

Thompson等[3]以同樣的方法，利用寡核苷酸修飾的銀納米粒子作為探針，通過雜交熔鏈的顏色變化實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)分別實(shí)現(xiàn)了兩種銀探針以頭-頭、頭-尾以及尾-尾的排列方式和目標(biāo)DNA進(jìn)行雜交，檢出限比用金納米粒子的進(jìn)行的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)低50倍[3]。

Hong等[4]建立了多功能納米粒子界面組裝方法。利用金納米粒子探針（DNA-AuNPs）和氟分子標(biāo)記的探針（F-DNA）兩種類型探針進(jìn)行表征。這種方法結(jié)合了自然界本來賦予的DNA雜交組裝，并專門設(shè)計(jì)的利用氟相互作用的聚集策略，進(jìn)行了DNA檢測(cè)。反應(yīng)體系中加入目標(biāo)DNA后，在氣相-液相界面、液相-液相界面、液相-固相界面觀察到紫色的金膜或藍(lán)色的金納米粒子的密堆積結(jié)構(gòu)（圖2）[4]。

分 析 化 學(xué)第39卷

第1期洪 敏等： 納米材料應(yīng)用于DNA檢測(cè)領(lǐng)域的研究進(jìn)展

2.2 熒光檢測(cè)法 圖2 基于金納米粒子氣-液（b）、氣-固（c）界面組裝的DNA檢測(cè)示意圖[4]

Fig.2 Schematic representation of DNA detection strategy by gas-liquid （b） and solid-liquid （c） interfacial gold nanoparticle assembly[4]

早在1970年，Drexhage等[10]發(fā)現(xiàn)在金屬膜附近熒光團(tuán)的發(fā)射壽命依賴于它距金屬表面的距離。后被證實(shí)當(dāng)熒光團(tuán)緊緊靠近金屬粒子時(shí)，熒光被猝滅；而當(dāng)熒光團(tuán)距金屬粒子一定距離時(shí)，熒光被增強(qiáng)。這種被金屬粒子增強(qiáng)的熒光稱為金屬增強(qiáng)熒光（MEF），用于生物檢測(cè)中可以增強(qiáng)目標(biāo)分子探測(cè)的靈敏度。利用這種效應(yīng)發(fā)展了一種基因檢測(cè)的重要方法——分子信標(biāo)（Molecular beacon），其基本原理是通過設(shè)計(jì)DNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)來構(gòu)建熒光分子-猝滅劑對(duì)，莖環(huán)結(jié)構(gòu)在檢測(cè)到靶基因時(shí)會(huì)發(fā)出很亮的指示熒光。分子信標(biāo)常用于核酸檢測(cè)，但它的缺點(diǎn)是分子猝滅劑的猝滅效率不高， 以金納米粒子代替分子猝滅劑的猝滅效率極大提高，用作探針檢測(cè)DNA的靈敏度也會(huì)提高。

圖3 熒光猝滅檢測(cè)DNA示意圖[10]

Fig.3 Nanoparticle-based probes and their operating principles[10]

Maxwell等[11]用2.5 nm的金納米粒子作為支架和猝滅劑。金納米粒子一側(cè)連接帶巰基官能團(tuán)， 另一側(cè)是帶熒光團(tuán)的核苷酸鏈。硫醇吸附在金核的表面，熒光團(tuán)靠非特異性吸附作用也吸附在金核表面，導(dǎo)致在金核外組裝的DNA鏈形成拱形結(jié)構(gòu)（圖3）。此時(shí)，金納米粒子猝滅熒光團(tuán)的發(fā)射。目標(biāo)DNA加入后與金核上拱起的識(shí)別DNA雜交，原有的拱形構(gòu)象快速發(fā)生變化，被拉成直鏈。熒光團(tuán)遠(yuǎn)離金核約10 nm，被猝滅的熒光團(tuán)發(fā)出熒光，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的檢測(cè)。

Song等[12]構(gòu)建了多色納米信標(biāo)（Multicolor nanobeacon），并應(yīng)用該探針實(shí)現(xiàn)多種腫瘤基因標(biāo)志物的同步檢測(cè)，而且能夠檢測(cè)低至pmol/L的DNA， 并可以很好地區(qū)分單堿基錯(cuò)配。此外，石墨烯作為一種片層納米材料，其納米界面能量轉(zhuǎn)移特性（Nanoscale surface energy transfer， NSET）對(duì)熒光染料也具有很高的猝滅效率。研究表明，氧化石墨烯與單雙鏈DNA之間的相互作用差別顯著，熒光染料標(biāo)記的單鏈DNA能夠吸附在石墨烯表面，導(dǎo)致熒光猝滅；而雙鏈DNA與石墨烯之間的作用則很弱。在此基礎(chǔ)上，He等[13]發(fā)展了基于氧化石墨烯的多色熒光探針，用于多種基因的同時(shí)快速靈敏檢測(cè)。 圖4 基于QD/Cy3標(biāo)記的DNA的熒光共振能量轉(zhuǎn)移的DNA雜化檢測(cè)示意圖[2]

Fig.4 Principle of DNA Hybridization-Detection system based on the quantum dot (QD)/dye cy3（QD/Cy3）-labeled DNA fluorescence resonance energy transfer（FRET）[2]

與常規(guī)熒光團(tuán)相比，半導(dǎo)體納米晶體（又稱為量子點(diǎn)，Quantum dot， QD）用作熒光探針檢測(cè)DNA，具有許多優(yōu)點(diǎn)：寬激發(fā)光譜、窄的發(fā)射光譜、易調(diào)、均衡的發(fā)射性質(zhì)以及光學(xué)穩(wěn)定性。Travas-Sejdic課題組[2]利用發(fā)射藍(lán)色熒光的CdTe量子點(diǎn)和標(biāo)記了染料（Cy3）的單鏈DNA之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence resonance energy transfer， FRET），制備了一種簡單的DNA傳感裝置。該裝置中使用了一種陽離子聚合物作為靜電鏈接分子，將量子點(diǎn)供體上的能量有效的轉(zhuǎn)移到染料分子受體上。由于單鏈DNA和雜交了目標(biāo)DNA后的雙鏈DNA與CdTe之間的相互作用存在明顯的差別，因此兩種單鏈和雙鏈DNA的FRET的效率也出現(xiàn)很大的不同，以此為平臺(tái)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的檢測(cè)（圖4）。該方法操作簡單，在制備DNA探針時(shí)僅需要很少的修飾過程，具備了基于溶液的熒光檢測(cè)方法的所有優(yōu)點(diǎn)。

Gerion等[14]設(shè)計(jì)了兩種CdSe/ZnS量子點(diǎn)標(biāo)記的DNA探針，與目標(biāo)DNA陣列進(jìn)行雜交，然后對(duì)該陣列進(jìn)行掃描，根據(jù)掃描到的熒光信號(hào)以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的檢測(cè)。研究表明， 在各種堿基序列錯(cuò)配的干擾背景下，目標(biāo)DNA的檢測(cè)下限為2 nmol/L。

具有兩種可辨別發(fā)射波長的QD納米探針，當(dāng)它們同時(shí)與匹配的目標(biāo)DNA雜交，形成三明治結(jié)構(gòu)后，兩個(gè)QD納米探針相連接。由于它們的空間共定位作用，光學(xué)圖像呈現(xiàn)出混合色。這樣，利用不同顏色的QD納米探針聯(lián)合探測(cè)目標(biāo)DNA，通過比色法可以實(shí)現(xiàn)DNA的多重檢測(cè)。Ho等[15]采用上述QD標(biāo)記探針，利用多色共定位（Ｍulticolor colocalization）法實(shí)現(xiàn)多重DNA探測(cè)。Wang等[16]則是通過對(duì)量子點(diǎn)-抗體-DNA復(fù)合物的激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA的分析，其檢出限為120 fmol/L。

2.3 共振光散射法

不同尺寸的金屬納米粒子，由于其獨(dú)特的表面共振，能夠發(fā)射出不同波長的光。這些能夠產(chǎn)生不同色彩光的金屬納米粒子可以用于標(biāo)記DNA，并采用陣列檢測(cè)方法實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA序列的檢測(cè)。

圖5 用兩種不同尺寸的金納米探針以三明治結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA的雙重檢測(cè)示意圖[17]

Fig.5 Scheme of DNA detection with two different size gold nanoparticle probes in a three-component sandwich assay[17]

Taton等[16]用50和100 nm的金納米粒子標(biāo)記不同的DNA，用以識(shí)別溶液中的兩種目標(biāo)DNA， 最后被玻璃片上的DNA陣列捕獲（圖5）。將載波片放在顯微鏡下，發(fā)出綠光（λmax ＝542 nm）的區(qū)域吸附的是50 nm金納米粒子探針，發(fā)出橘紅色光（λmax ＝583 nm）的區(qū)域吸附的是100 nm的金納米粒子探針。該方法靈敏度高，選擇性好，實(shí)現(xiàn)了雙重檢測(cè)，檢出限為1 pmol/L。Bao等[18]將共振光散射（Resonance light scattering， RLS）粒子標(biāo)記DNA和熒光團(tuán)標(biāo)記DNA做雜交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行比較，證明RLS粒子標(biāo)記DNA的雜交實(shí)驗(yàn)靈敏度更高。

另外，He等[19]報(bào)道了一種不需標(biāo)記的一步DNA檢測(cè)體系。該方法是以表面帶正電的金納米棒作為識(shí)別探針，在與無標(biāo)記的單鏈DNA探針同時(shí)存在的情況下，加入目標(biāo)DNA后發(fā)現(xiàn)該高離子強(qiáng)度溶液顏色由紅色變?yōu)榈仙＠闷涞入x子共振光散射信號(hào)，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)DNA的檢測(cè)。

Wark等[20]制備一種金衍射光柵上吸附金納米粒子的超靈敏表面生物親和傳感器。他們?cè)诮鸸鈻疟砻嫘纬捎山鸺{米粒子參與的DNA互補(bǔ)配對(duì)雜交的三明治結(jié)構(gòu)，利用表面等離子共振激發(fā)的幾何構(gòu)型，能夠控制納米粒子增強(qiáng)衍射信號(hào)的波長范圍。該方法對(duì)未作任何修飾的DNA的檢出限達(dá)到10 fmol/L。

2.4 表面增強(qiáng)拉曼光譜法

表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）是利用粗糙的金屬表面增強(qiáng)表面吸附分子的拉曼散射，這一增強(qiáng)高達(dá)原分子在溶液中本身拉曼散射的106倍。SERS是一種靈敏度和選擇性非常高的診斷方法， 可以用于基因檢測(cè)[21]。Cao等[22]將拉曼染色標(biāo)記DNA修飾在金納米粒子探針的表面，可以產(chǎn)生目標(biāo)DNA的光譜條碼，這種方法可以用于多重檢測(cè)。特別是用銀染色可以確定目標(biāo)DNA的存在，同一目標(biāo)DNA可以用SERS方法顯現(xiàn)，只需要探測(cè)納米粒子附近的拉曼染色點(diǎn)即可。

2.5 電化學(xué)法

電化學(xué)法因其靈敏度高、儀器體積小、簡單易于攜帶、成本低等優(yōu)點(diǎn)，廣泛的應(yīng)用于DNA檢測(cè)[23～35]。通常，將金納米粒子[27～30]或量子點(diǎn)[31～34]捕獲到雜交的目標(biāo)DNA上，隨后采用電化學(xué)的方法測(cè)量出酸溶或陽極脫模得到的金屬離子，以此檢測(cè)目標(biāo)DNA的存在。如Liu等[34]用ZnS， PbS和CdS的量子點(diǎn)作為標(biāo)記使用電化學(xué)法實(shí)現(xiàn)DNA多重檢測(cè) （圖6）。此外，Park等[35]使用基于電導(dǎo)率的方法，結(jié)合金納米探針實(shí)現(xiàn)了高選擇性和高靈敏度檢測(cè)DNA。 圖6 基于不同無機(jī)納米晶體示蹤物的多重電化學(xué)檢測(cè)DNA示意圖

Fig.6 Multi-target electrical DNA detection protocol based on different inorganic colloid nanocrystal tracers

（A） 引入磁性粒子探針(Introduction of probe-modified magnetic beads); （B） 和目標(biāo)DNA雜交配對(duì)(Hybridization with the DNA target);（C） 再和量子點(diǎn)標(biāo)記探針雜交配對(duì)(Second hybridization with the QD-labeled probes);（D） 溶解量子點(diǎn)并進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)（Dissolution of QDs and electrochemical detection）[34]。

[Ru（NH3）6]3+（RuHex）陽離子和帶有負(fù)電荷的DNA可以通過靜電作用相互結(jié)合。Steel等[36]用陽離子還原標(biāo)記物標(biāo)記DNA鏈，運(yùn)用計(jì)時(shí)庫侖法定量的測(cè)量電極表面DNA的修飾密度。Zhang等[37]利用上述定量方法，在金電極上修飾捕獲DNA，用于捕獲溶液中的目標(biāo)DNA，再用金納米探針標(biāo)記被捕獲在電極表面的目標(biāo)DNA，形成三明治結(jié)構(gòu)。目標(biāo)DNA鏈以及金電極和金納米粒子表面修飾的DNA鏈都靜電吸附有RuHex陽離子作為信號(hào)分子。由于每個(gè)金納米粒子表面修飾有成百上千個(gè)識(shí)別DNA鏈，該金納米探針和目標(biāo)DNA雜交后，可以顯著提高電信號(hào)，達(dá)到檢測(cè)的目的。該方法重復(fù)性好，靈敏度高，具有很好的辨別各種單錯(cuò)配堿基的能力，檢出限可達(dá)到10 fmol/L。

2.6 MALDI-TOF質(zhì)譜分析法

基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（MALDI-TOF MS）是一種分析包括蛋白質(zhì)和核酸的有效工具[38]。然而由于寡核苷酸的電離效率低且容易破碎，MALDI-TOF MS對(duì)核酸的檢測(cè)效果不及蛋白質(zhì)。

Kong 等[39]在聚賴氨酸包裹的金剛石納米晶體上修飾捕獲DNA鏈，用于捕獲溶液中的目標(biāo)DNA，然后加入氨水并升高溫度洗脫出捕獲的目標(biāo)DNA鏈，直接用MALDI- TOF MS進(jìn)行分析。

Qiu等[40]以MALDI-TOF MS為表征手段，建立了基于單層條碼修飾的納米粒子的芯片DNA雜交檢測(cè)方法。首先設(shè)計(jì)制備一種由巰基DNA和一個(gè)含二硫鍵的小分子共同作用過的雙重修飾金納米粒子，根據(jù)化學(xué)作用將另一段巰基DNA組裝到硅片上，目標(biāo)DNA加入后，通過互補(bǔ)DNA雜交的識(shí)別功能，3種DNA鏈形成三明治結(jié)構(gòu)。然后利用MALDI-TOF MS作為信號(hào)讀出工具，得到含二硫鍵的小分子的質(zhì)譜信號(hào)，以此可以有效的達(dá)到檢測(cè)目標(biāo)DNA的目的。同時(shí)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA的雙重檢測(cè)。由于多肽是一種更容易被質(zhì)譜儀檢測(cè)的標(biāo)記物，在MALDI-TOF MS中非常容易出峰。最近，Zhou等[41]又設(shè)計(jì)了一種基于多肽標(biāo)記物的MALDI-TOF 質(zhì)譜分析法。該方法也可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的雙重檢測(cè)。除了選用有機(jī)小分子或多肽作為標(biāo)記物進(jìn)行質(zhì)譜分析，以此間接證明目標(biāo)DNA的存在外，該研究組又進(jìn)一步發(fā)展了以MALDI-TOF MS為研究手段，實(shí)現(xiàn)對(duì)修飾在基板表面的DNA進(jìn)行直接的檢測(cè)[42]。采用交替層層靜電吸附，在硅片上組裝多孔金納米粒子組裝的多層膜或金和二氧化硅納米粒子雜化組裝的多層膜。通過AuS鍵將巰基修飾的寡核苷酸固定到組裝膜表面。利用MALDI-TOF MS可以對(duì)固定在基于金納米粒子界面上的單鏈DNA和由2條或3條DNA鏈雜交成的雙鏈DNA進(jìn)行分析。值得注意的是，除了能夠?qū)﹄s交體系中第2條或第3條DNA鏈的識(shí)別外，還可以對(duì)由金納米粒子和二氧化硅納米粒子組裝的基板上共價(jià)鍵結(jié)合的巰基DNA的SAM進(jìn)行直接的分析。

2.7 元素分析法

電感耦合等離子體（ICP）是一種很好的霧化、電離、發(fā)射源，可以和原子發(fā)射光譜（AES）或質(zhì)譜（MS）聯(lián)用，用于痕量元素分析。ICP在理論上有很高的分辨率，可實(shí)現(xiàn)多元素同時(shí)檢測(cè)。 Zhang等[43]報(bào)道了一種基于ICP-MS的檢測(cè)蛋白質(zhì)的免疫檢測(cè)方法。Merkocüi等[44]將電感耦合等離子原子發(fā)射光譜（ICP-AES）用于肽-核苷酸的免疫檢測(cè)。ICP-AES是一種常用的元素分析工具，具有很高的特異性，多元素檢測(cè)能力和較低的檢出限，應(yīng)用非常廣泛。Wu等[45]利用ICP-AES實(shí)現(xiàn)溶液中DNA的檢測(cè)。研究中用到了兩種類型的粒子：二氧化硅納米粒子或金納米粒子，分別將它們修飾上能夠與溶液中目標(biāo)DNA鏈的一半序列相匹配的核苷酸鏈作為探針， 提供元素信號(hào)；磁性微球表面修飾上和目標(biāo)DNA鏈另一半序列相匹配的核苷酸鏈作為捕捉組分。當(dāng)目標(biāo)DNA存在時(shí)，探針、捕捉組分和目標(biāo)DNA三者間形成典型的三明治結(jié)構(gòu)，外加磁場可以將三明治結(jié)構(gòu)與周圍的溶液分離從而進(jìn)一步清洗。最后，利用ICP-AES作為檢測(cè)工具， 提供的無機(jī)元素信號(hào)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的有效檢測(cè)。

3 基于納米纖維、納米線和納米管的DNA檢測(cè)方法

在對(duì)DNA的電檢測(cè)方法中，納米纖維、納米線和納米管正被逐漸證實(shí)為新的信號(hào)轉(zhuǎn)換體[46～51]。如Hahm等[46]的研究證明，用肽核酸修飾過的硅納米纖維可以用于實(shí)時(shí)且不用任何標(biāo)記的DNA檢測(cè)。

Cattani-Scholz等[47]報(bào)道了一種基于有機(jī)磷酸和多肽核酸（Peptide nucleic acid， PNA）修飾的硅納米線的無標(biāo)記DNA檢測(cè)方法。在硅納米線表面修飾羥烷基化的有機(jī)磷酸，形成單層膜。并以此為基礎(chǔ)， 通過一個(gè)雙官能團(tuán)的鏈接分子將PNA結(jié)合到單層膜表面，隨后將該納米纖維轉(zhuǎn)移到場效應(yīng)傳感器裝置（長2

SymbolmA@ m，寬100 nm）中，由此可以實(shí)現(xiàn)對(duì)無標(biāo)記的DNA/PNA的電化學(xué)檢測(cè)。

文獻(xiàn)[48，49]采用單壁碳納米管原子力顯微鏡探針，對(duì)含有上千個(gè)堿基的特殊DNA序列進(jìn)行了檢測(cè)。將鏈狀生物素標(biāo)記了的互補(bǔ)DNA探針，連接到這種特殊的DNA序列上；然后利用原子力顯微鏡識(shí)別鏈狀生物素，以達(dá)到對(duì)目標(biāo)DNA序列的定位。這種技術(shù)為進(jìn)行標(biāo)志著基因紊亂的特異性的單模標(biāo)本的檢測(cè)提供了可能。

碳納米管修飾的玻碳電極能夠放大鳥嘌呤堿基的電化學(xué)信號(hào)。Wang等[50]利用此現(xiàn)象實(shí)現(xiàn)nmol/L級(jí)的未進(jìn)行任何標(biāo)記的DNA的電化學(xué)檢測(cè)。此外，碳納米管的微排列或金納米電極的微排列[51]都可用于檢測(cè)DNA的雜化。Heller等[52，53]用單壁碳納米管實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA構(gòu)象多形性的光學(xué)檢測(cè)。

Hu等[54]報(bào)道了基于碳納米管和磁性粒子的DNA雜交檢測(cè)方法。研究表明，由DNA探針修飾的多壁碳納米管能在水溶液中穩(wěn)定存在，當(dāng)在完全互補(bǔ)的目標(biāo)DNA存在的條件下，可與另一個(gè)磁性粒子修飾的DNA探針結(jié)合，形成三明治結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)在紫外-近紅外光束的激發(fā)下會(huì)發(fā)射出強(qiáng)烈的光散射信號(hào)，以此實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的檢測(cè)。

4 以納米器件制備方法為基礎(chǔ)的DNA檢測(cè)法

4.1 納米排列圖案法

現(xiàn)在，以芯片為基礎(chǔ)的生物診斷檢測(cè)模式，均是將待捕獲的分子以微小的尺度按照一定的圖案修飾到芯片表面。此模式允許對(duì)各種分析物在很小的面積內(nèi)進(jìn)行大規(guī)模的平行篩選，該特征對(duì)基因組的研究非常有利。而且，這種微排列為在小面積內(nèi)進(jìn)行DNA的多重檢測(cè)提供了一個(gè)平臺(tái)?，F(xiàn)在，已經(jīng)發(fā)展了很多用于在各種表面（Au、SiO2、Ni）制備DNA的納米級(jí)圖案的方法，如蘸筆式納米平版印刷術(shù)（DPN）[55～59]、納米嫁接術(shù)[60]及離子束平版印刷術(shù)[61]等。

為充分發(fā)揮納米排列在檢測(cè)方面的潛在應(yīng)用，將這種方法與傳統(tǒng)的技術(shù)結(jié)合在一起，有效實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子的篩選與反應(yīng)。為達(dá)該目的，利用DPN方法制備的DNA納米排列，既可以識(shí)別用熒光分子標(biāo)記的互補(bǔ)的目標(biāo)DNA[55]， 又能對(duì)DNA修飾過的金納米粒子進(jìn)行辨認(rèn)（圖7）[56]。在有目標(biāo)DNA存在的條件下，相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以分別用熒光顯微鏡、原子力顯微鏡或掃描電子顯微鏡[57]進(jìn)行表征。

圖7 利用蘸筆式納米平版印刷術(shù)在SiOx表面構(gòu)建寡聚核苷酸的納米圖案，圖案的反應(yīng)性可以用熒光顯微鏡或原子力顯微鏡進(jìn)行表征[56]

Fig.7 Using dip-pen nanolithography， the nanopatterns of oligonucleotides can be constructed on SiOx surfaces. The reactivity of patterns can be interrogated using either fluorescence microscopy or atomic force microscopy（AFM）[56]

4.2 納米電機(jī)械設(shè)備法

光子或電子束平版印刷技術(shù)的發(fā)展，推進(jìn)了綜合設(shè)備的向前發(fā)展，同時(shí)使得在微米或納米尺度上進(jìn)行制備成為可能。具有納米厚度的微懸臂，通過測(cè)量結(jié)合了功能性的目標(biāo)分子后的頻率變化，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)許多重要的生物分子的檢測(cè)[62，63]。例如，捕獲DNA功能化了的微懸臂，為在捕獲DNA、目標(biāo)DNA和DNA修飾的金納米粒子探針之間形成三明治結(jié)構(gòu)提供了有利的平臺(tái)。由于金納米粒子標(biāo)記物的存在，促進(jìn)了Ag+的還原，相應(yīng)增加懸臂的質(zhì)量，以此作為檢測(cè)與目標(biāo)DNA相關(guān)頻率移動(dòng)的傳輸信號(hào)[63]。

4.3 納米孔檢測(cè)法

由于納米材料與生命大分子以及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)在空間尺度上的吻合，前者的發(fā)展為蛋白質(zhì)、DNA以及細(xì)胞器等的研究提供了更多的可能性。20世紀(jì)90年代中期，Branton和Craighead等先后發(fā)表了單鏈DNA在電場作用下通過納米孔通道研究發(fā)現(xiàn)，提出了納米通道DNA測(cè)序的設(shè)想。隨后十幾年間，眾多的課題組進(jìn)行了大量的相關(guān)的研究[64～68]。

Bashir課題組[69]在固相納米孔檢測(cè)DNA技術(shù)上取得的突破性的進(jìn)展。他們利用絕緣體硅材料（Silicon-on-insulator）構(gòu)建了固相納米孔通道（Solid-state nanopore channels），并用發(fā)夾（Hairpin-loop）結(jié)構(gòu)DNA探針修飾納米孔，發(fā)現(xiàn)在電場的作用下與探針DNA完全匹配的單鏈DNA能夠迅速通過孔道，形成狹深的電譜。而即使只有一個(gè)堿基不匹配的錯(cuò)配DNA通過速度緩慢，無特征峰谷形成。

4.4 微排列檢測(cè)法

關(guān)于微排列研究，需要將已知序列的單鏈DNA探針分子固定在一個(gè)特定區(qū)域表面，然后再與目標(biāo)DNA或另外的探針分子進(jìn)行雜交。通常，可以利用熒光等方法對(duì)該雜交體系進(jìn)行檢測(cè)。另外還可以應(yīng)用納米機(jī)械裝置測(cè)量各種納米級(jí)變化的表觀現(xiàn)象進(jìn)行測(cè)定[70]。例如其表面應(yīng)力的改變[71]、目標(biāo)分子質(zhì)量的增加[72]、電力的變化[73]、由自組裝條碼核酸探針排列產(chǎn)生的表面構(gòu)型的變化[74]以及水合作用導(dǎo)致的表面張力的變化[75]等，都可以作為測(cè)量DNA微排列表面雜交狀況的表征手段。

最近，Husale等[76]報(bào)道了簡單快捷且能夠檢測(cè)超低濃度DNA的新方法。到目前為止，DNA檢測(cè)技術(shù)大都需要對(duì)樣品進(jìn)行放大或者標(biāo)記，在這項(xiàng)研究中，實(shí)驗(yàn)人員所采用的一個(gè)新方法能夠避免這樣的樣品準(zhǔn)備步驟。首先在金基板表面裝置一層單鏈DNA微排列，然后與目標(biāo)DNA進(jìn)行雜交。由于雜交后的雙鏈DNA的硬度比單鏈DNA小，因此，利用原子力顯微鏡直接測(cè)量單鏈DNA和雙鏈DNA的硬度，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的檢測(cè)（圖8）。該方法利用了雜合型DNA和RNA分子的一個(gè)獨(dú)特機(jī)械性能，該性能使它們能夠充當(dāng)一種內(nèi)在的分子標(biāo)簽，并且在純樣品中能夠?qū)崿F(xiàn)fmol級(jí)的檢測(cè)靈敏度。

圖8 DNA雜交體系的納米機(jī)械檢測(cè)示意圖

Fig.8 Nanomechanical detection of DNA hybridization

a: 實(shí)驗(yàn)過程示意圖（Scheme of experiment）；b: 由原子力顯微鏡測(cè)得的DNA雜交體系微排列的硬度圖（Stiffness map mearsured by AFM for the surface of DNA hybridization array spot）[75]。

5 結(jié)論與展望

以上綜述了基于納米材料的DNA檢測(cè)方法的發(fā)展現(xiàn)狀。然而，與傳統(tǒng)的PCR檢測(cè)方法進(jìn)行比較，還必須衡量該類方法實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。例如利用分子探針的電化學(xué)分析法，由于它的低消耗與簡便性，而備受關(guān)注。表現(xiàn)出了格外的吸引力。另外通過具有電活性分子微珠的嵌入將信號(hào)進(jìn)行間接放大，它的靈敏度可以達(dá)到約100 amol/L，這可以和PCR技術(shù)相媲美。而且在選擇性和實(shí)用性方面也優(yōu)于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法。為達(dá)到最后的檢結(jié)果，并且真正實(shí)現(xiàn)其在現(xiàn)實(shí)的實(shí)驗(yàn)室、臨床或醫(yī)護(hù)工作中應(yīng)用，需要繼續(xù)優(yōu)化一些實(shí)驗(yàn)因素。另外，PCR技術(shù)仍是現(xiàn)代DNA分析最流行的核心技術(shù)之一，將納米材料引入到PCR技術(shù)中，結(jié)合了PCR的優(yōu)點(diǎn)以及納米材料對(duì)DNA的表面富集能力，能夠提高PCR的靈敏度和特異性，極大地拓寬PCR技術(shù)的應(yīng)用范圍。目前，應(yīng)用于PCR體系中的納米材料主要包括：金納米粒子、銀納米粒子、磁性納米粒子、納米碳管、納米碳粉、富勒烯（C60）、半導(dǎo)體納米材料等。通過以上論述可以看出，今后有關(guān)DNA檢測(cè)的研究主要側(cè)重于兩個(gè)方面：（1）結(jié)合現(xiàn)代分析手段，不斷深化基于納米材料特性的檢測(cè)方法；（2）尋找新的納米材料，推進(jìn)其在PCR體系中的應(yīng)用。同時(shí)，該領(lǐng)域未來的發(fā)展方向，是需要化學(xué)家能與醫(yī)學(xué)或生物學(xué)方面的專家進(jìn)行更深入的合作，推進(jìn)納米材料應(yīng)用于DNA檢測(cè)研究上的創(chuàng)新與發(fā)展。

References

1 Stromberg M， Torre T Z G， Goransson J， Gunnarsson K， Nilsson M， Svedlinh P， Stromme M. Anal. Chem.， 2009， 81（9）: 3398～3406

2 Peng H， Zhang L J， Kjallman T H M， Soeller C， Travas-Sejdic J. J. Am. Chem. Soc.， 2007， 129（11）: 3048～3049

3 Thompson D G， Enright A， Faulds K， Smith E W， Graham D.Anal. Chem.， 2008， 80（8）: 2805～2810

4 Hong M， Zhou X， Tian Y， Zhu J.Angew. Chem. Int. Ed.， 2009， 48（50）: 9503～9506

5 Zhao W， Brook M A， Li Y F. Bio. Chem.， 2008， 9（15）: 2363～2371

6 Ghosh S K， Pal T. Chem. Rev.， 2007， 107（11）， 4797～4867

7 Lee J， Ulmann P A， Han M， Mirkin C A. Nano Lett.， 2008， 8（2）: 529～533

8 Saiki R K， Scharf S， Faloona F， Mullis K B， Horn G T， Erlich H A， Arnheim N. Science， 1985， 230: 1350～1354

9 Elghanian R， Storhoff J J， Mucic R C，Letsinger R L， Mirkin C A. Science， 1997， 277: 1078～1081

10 Drexhage K H. Sci. Am.， 1970， 222: 108～118

11 Maxwell D J， Taylor J R， Nie S. J. Am. Chem. Soc.， 2002， 124（32）: 9606～9607

12 Song S P， Liang Z Q， Zhang J， Wang L H， Li G X， Fan C H. Angew. Chem. Int. Ed.， 2009， 48（46）: 8670～8674

13 He S J， Song B， Li D， Zhu C F， Qi W P， Wen Y Q， Wang L H， Song S P， Fang H P， Fan C H. Adv. Funct. Mater.， 2010， 20（3）: 453～459

14 Gerion D， Chen F Q， Kannan B， Fu A H， Parak W J， Chen D J， Majumdar A， Alivisatos A P. Anal. Chem.， 2003， 75（18）: 4766～4772

15 Ho Y P， Kung M C， Yang S， Wang T H. Nano Lett.， 2005， 5（9）: 1693～1697

16 Wang Z X， Lu M L， Wang X L， Yin R C， Song Y L， Le C X， Wang H L. Anal. Chem.， 2009， 81（24）: 10285～10289

17 Taton T A， Mirkin C A. J. Am. Chem. Soc.， 2001， 123（21）: 5164～5165

18 Bao P， Frutos A G， Greef C， Lahiri J， Muller U， Peterson T C， Warden L， Xie X Y. Anal. Chem.， 2002， 74（8）: 1792～1797

19 He W， Huang C Z， Li Y F， Xie J P， Yang R G， Zhou P F， Wang J. Anal. Chem.， 2008， 80（22）: 8424～8430

20 Wark A W， Lee H J， Qavi A J， Corn R M. Anal. Chem.， 2007， 79（17）: 6697～6701

21 Fang C， Agarwal A， Buddharaju K D， Khalid N M， Salim S M， Widjaja E， Garland M V， Balasubramanian N， Kwong D L. Biosens. Bioelectron.， 2008， 24（2）: 216～221

22 Cao Y W C， Jin R C， Mirkin C A. Science， 2002， 297: 1536～1540

23 Li X M， Zhan Z M， Ju H Q， Zhang S S. Oligonucleotides， 2008， 18（4）: 321～328

24 Xu L J， Du J J， He N Y， Deng Y， Li S， Wang T. J. Nanosci. Nanotechnol.， 2009， 9（4）: 2698～2703

25 Castaneda M T， Alegret S， Merkoci A. Methods in Molecular Biology， 2009， 554: 127～143

26 Zhang J， Song S P， Wang L H， Pan D， Fan C H. Nat. Protoc.， 2007， 2（11）: 2888～2895

27 Wang J， Xu D， Polsky R， Kawde A. Anal. Chem.， 2001， 73（22）: 5576～5581

28 Authier L， Grossiord C， Brossier P， Liimoges B. Anal． Chem.， 2001， 73（18）: 4450～4456

29 Ozsoz M， Erdem A， Kerman K， Ozkan D， Tugrul B， Topcuoglu N， Ekren H， Talyan M. Anal. Chem.， 2003， 75（9）: 2181～2187

30 Wang J， Xu D， Polsky R. J. Am. Chem. Soc.， 2002， 124（16）: 4208～4209

31 Liu G D， Lee T M H， Wang J. J. Am. Chem. Soc.， 2005， 127（1）: 38～39

32 Numuam A， Chumbimuni-Torres K Y， Xiang Y， Bash R， Thavarungkul P， Kanatharana P， Pretsch E， Wang J， Bakker E. J. Am. Chem. Soc.， 2008， 130（2）: 410～411

33 Wang J， Liu G， Merkoci A. J. Am. Chem Soc.， 2003， 125（11）: 3214～3215

34 Liu G， Lee T M H， Wang J. J. Am. Chem Soc.， 2004， 127（1）: 38～39

35 Park S J， Taton T A， Mirkin C A. Science， 2002， 295: 1503～1506

36 Steel A B，Herne T M， Tarlov M J. Anal. Chem.， 1998， 70（22）: 4670～4677

37 Zhang J， Song S P， Zhang L， Wang L， Wu H， Pan D， Fan C H. J. Am. Chem. Soc.， 2006， 128（26）: 8575～8580

38 Dass C. Principles and Practices of Biological Mass Spectrometry， Wiley:New York， 2001

39 Kong X， Huang L C L， Liau S C V， Han C C， Chang H C. Anal. Chem.， 2005， 77（13）: 4273～4277

40 Qiu F， Jiang D W， Ding Y B， Zhu J， Huang L Q L. Angew. Chem. Int. Ed.， 2008， 47（27）: 5009～5012

41 Zhou X，Cao P， Tian Y， Zhu J. J. Am. Chem. Soc.， 2010， 132（12）: 4161～4168

42 Hong M， Zhou X， Tian Y， Zhu J. Anal. Chem.， 2009， 81（21）: 8839～8845

43 Zhang C， Zhang Z， Yu B， Shi J， Zhang X. Anal. Chem.， 2002， 74（1）: 96～99

44 Merkocüi A， Aldavert M， Tarrason G， Eritja R， Alegret S. Anal. Chem.， 2005， 77（19）: 6500～6503

45 Wu L L， Qiu L W， Shi C S， Zhu J. Biomacromolecules， 2007， 8（9）: 2795～2800

46 Hahm J I， Lieber C M. Nano Lett.， 2004， 4（1）: 51～54

47 Cattani-Scholz A， Pedone D， Dubey M， Neppl S， Feulner P， Schwartz J， Abstreiter G， Tornow M. ACS Nano， 2008， 2（8）: 1653～1660

48 Woolley A T， Guillemette C， Cheung C L， Housman D E， Lieber C M. Nat. Biotechnol.， 2000， 18: 760～763

49 Gao Z Q， Agarwal A， Trigg A D， Singh N， Tung C H， Fan Y， Buddharaju K D， Kong J M. Anal. Chem. 2007， 79（9）: 3291～3297

50 Wang J， Kawde A N， Musameh M. Analyst， 2003， 128（7）: 912～916

51 Wang J， Liu G， Jan M R. J. Am. Chem. Soc.， 2004， 126（10）: 3010～3011

52 Heller D A， Jeng E S， Yeung T K， Martinez B M， Moll A E， Gastala J B， Strano M S. Science， 2006， 311: 508～511

53 Heller D A， Jin H， Martinez B M， Patel D， Miller B M， Yeung T K， Jena P V， Hobartner C， Ha T， Silverman S K， Strano M S. Nature Nanotech.， 2009， 4: 114～120

54 Hu P， Huang C Z， Li Y F， Ling J， Liu Y L， Fei L R， Xie J P. Anal. Chem.， 2008， 80（5）: 1819～1823

55 Ginger D S， Zhang H， Mirkin C A. Angew. Chem. Int. Ed.， 2004， 43（1）: 30～45

56 Demers L M， Ginger D S， Park S J， Li Z， Chung S W， Mirkin C A. Science， 2002， 296: 1836～1838

57 Li S D， Szegedi S， Goluch E， Liu C. Anal. Chem.， 2008， 80（15）: 5899～5904

58 Lee K B， Park S J， Mirkin C A， Smith J C， Mrksich M. Science， 2002， 295: 1702～1705

59 Nam J M， Han S W， Lee K B， Liu X G， Ratner M A， Mirkin C A. Angew. Chem. Int. Ed.， 2004， 43（10）: 1246～1249

60 Schwartz P V. Langmuir， 2001， 17（19）: 5971～5977

61 Bergman A A， Buijs J， Herbig J， Mathes D T， Demarest J J， Reimann C T， Baragiola R A， Hu R， Oscarsson S O. Langmuir， 1998， 14（24）: 6785～6788

62 Hagan M F， Majumdar A， Chakraborty A K. J. Phys. Chem. B， 2002， 106（39）: 10163～10173

63 Su M， Li S， Dravid V P. Appl. Phys. Lett.， 2003， 82（1）: 20～23

64 Butler T Z， Pavlenok M， Derrington I M， Niederweis M， Gundlach J H. PANS， 2008， 105: 20647～20652

65 Kececi K， Sexton L T， Buyukderin F， Martin C R. Nanomedicine， 2008， 3（6）: 787～796

66 Healy K. Nanomedicine， 2007， 3（4）: 459～481

67 Ashkenasy N， Sanchez-Quesada J， Bayley H， Ghadiri M R. Angew. Chem. Int. Ed.， 2005， 44（9）: 1401～1404

68 Branton D， Deamer D W， Marziali A， Bayley H， Benner S A， Butler T， Wiggin M. Nature Biotech.， 2008， 26: 1146～1153

69 Iqbal S M， Akin D， Bashir R. Nature Nanotech.， 2007， 2: 243～248

70 Cheng M M C， Cuda G， Bunimovich Y L， Gaspari M， Heath J R， Hill H D， Mirkin C A， Nijdam A J， Terracciano R， Thundat T， Ferrari M. Curr. Opin. Chem. Biol.， 2006， 10（1）: 11～19

71 Fritz J， Baller M K， Lang H P， Rothuizen H， Vettiger P， Meyer E， Guntherodt H J， Gerber C， Gimzewski J K. Science， 2000， 288: 316～318

72 Ilic， B， Yang Y， Aubin K， Reichenbach R， Krylov S， Graighead H G. Nano Lett.， 2005， 5（5）: 925～929

73 Sinensky A K， Belcher A M. Nature Nanotechnol.， 2007， 2: 653～659

74 Ke Y， Lindsay S， Chang Y， Liu Y， Yan H. Science， 2008， 319: 180～183

75 Mertens J， Rogero C， Calleja M， Ramos D， Martin-Gago J A， Briones C， Tamayo J. Nature Nanotechnol.， 2008， 3: 301～307

76 Husale S， Persson H H J， Sahin O. Nature， 2009， 462: 1075～1078

Research Progress in Application of Nanomaterial for

Deoxyribonucleic Acid Detection

HONG Min*1， ZHU Jin2， YIN Han-Dong1

1（School of Chemistry and Chemical Engineering， Liaocheng University， Liaocheng 252059）

2（School of Chemistry and Chemical Engineering， Nanjing University， Nanjing 210093）

Abstract Recent progress in application of nanomaterial for DNA detection except for PCR systems is reviewed. Nanomaterial-（nanoparticles and nanowires/tubes） or nanofabrication-based DNA detection methods are introduced. Studies reveal that nanomaterial-based DNA detection methods offer several advantages over the traditional PCR systems in the orientation， visualization and multiplexing. Especially， in the research of nanomaterial-based detection， methods with nanoparticle are studied， including colorimetrical detection， fluorescent detection， resonance light scattering detection， scanometric detection， surface-enhanced Raman scattering detection， bio-bar-code detection， electrochemical detection， MALDI-TOF MS detection， and elemental analysis detection. For the nanofabrication-based DNA detection， four methods are presented: nanopatterning， nanoelectromechnical devices， nanopore， and microarray detection methods.

Keywords Nanomaterial; Deoxyribonucleic acid detection; Sensitivity; Selectivity; Review

（Received 5 May 2010; accepted 26 August 2010）