管式磁性微粒子化學發(fā)光免疫分析法測定人尿液中的雌三醇

摘 要待測尿液中的雌三醇、辣根過氧化物酶標記的雌三醇與異硫氰酸熒光素（FITC）標記的兔抗雌三醇抗體在均相體系中發(fā)生競爭性免疫反應，再加入用羊抗FITC抗體包被的磁微粒，反應生成物結合在磁微粒上，在磁場中經分離、洗滌后加發(fā)光底物，檢測發(fā)光強度（RLU），測定尿液中雌三醇的含量。通過對檢測條件的優(yōu)化，建立了磁性微粒子化學發(fā)光免疫分析法測定人尿液中雌三醇的方法，并對正常男性、女性和孕婦的尿液中雌三醇含量進行了測定。結果表明，本方法的線性范圍為1～100 SymbolmA@ g/L，檢出限為0.25 SymbolmA@ g/L，具有很高的靈敏度; 批內相對標準偏差＜14%; 批間相對標準偏差＜7%，具有良好的穩(wěn)定性和重現性。

關鍵詞 雌三醇; 化學發(fā)光免疫分析; 磁性微粒子; 尿液

1 引 言

雌三醇（Estriol， E3）是重要的內源性雌性激素之一。人體內存在游離雌三醇和結合雌三醇，男性及未孕女性體內的雌三醇含量很低。正常孕齡女性體內雌三醇的主要來源是雌二醇和雌酮的代謝產物；孕婦體內雌三醇的主要來源是嬰兒和胎盤，且含量一般較高。通過檢測孕婦血清或尿液中雌三醇的含量，可以判斷胎兒的發(fā)育狀況。因此，快速、準確地檢測血清或尿液中雌三醇的含量對于科研和臨床應用都具有重要意義。目前，檢測游離雌三醇或總雌三醇的常用方法有高效液相色譜法（HPLC）[1，2]、液相色譜-質譜（LC-MS）法[3]、酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）[4]、放射免疫法（RIA）[5～7]、時間分辨熒光免疫分析法（TRFIA）[8]和化學發(fā)光免疫分析法（CLIA）[9～11]等。本實驗應用化學發(fā)光免疫分析法（CLIA）高靈敏度和高特異性的特點，利用磁性微粒子的分離特性，快速、準確地對人體尿液中的雌三醇含量進行了化學發(fā)光免疫檢測。

雌三醇（E3）是一種半抗原小分子，有免疫反應性。實驗中采用競爭法對尿液中的雌三醇進行分析，使待測雌三醇、辣根過氧化物酶標記的雌三醇（E3-HRP）在均相體系中與異硫氰酸熒光素（FITC）標記的兔抗雌三醇抗體（FITC-E3抗體）發(fā)生競爭性免疫反應。再加入用羊抗FITC抗體包被的磁微粒，反應生成物結合在磁微粒上，在磁場中經分離、洗滌后加發(fā)光底物，用冷光分析儀檢測發(fā)光強度（RLU），測定尿液中雌三醇的含量。檢測原理如圖1所示。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Flash′n glow LB955 30管全自動進樣冷光分析儀（Berthold公司）；高速離心機（Beckman公司），實驗中分離溫度為4和25 ℃，轉速13000 r/min；磁性分離器（北京科美東雅生物技術有限公司定制，磁場強度2800 Gs）；XW80旋渦混合器（上海精科實業(yè)有限公司）；試管12×60 mm（浙江拱東醫(yī)用塑料廠）；磁性微粒子（磁性分離劑，Adaltis公司）。

雌三醇標準品（Sigma公司）；兔抗E3抗血清、羊抗FITC抗體包被的磁性微粒子（5 g/L）、FITC標記的兔抗雌三醇抗體、HRP標記的E3抗原、發(fā)光底物及PBST洗滌液，均由北京科美東雅生物技術有限公司提供；其它試劑均為分析純。標準品稀釋液為50 mmol/L PBS緩沖溶液（pH＝7.4，含2.0% BSA及05%水解明膠，0.1% Proclin）。

圖1 尿液中雌三醇的檢測原理

Fig．1 Principle of determination of estriol in human urine

2.2 實驗步驟

2.2.1 PBS-BSA緩沖液、E3標準溶液、E3-HRP溶液、FITC-E3抗體溶液的配制PBS-BSA緩沖液的配制：用50 mmol/L KH2PO4-Na2HPO4配制PBS-BSA緩沖溶液（pH＝7.4，含2.0%BSA及0.5%水解明膠，0.1%的 Proclin）。E3標準溶液的配制：稱取E3標準品0.0042 g，加420

SymbolmA@ L無水乙醇溶解得10 g/L的E3溶液，取該E3溶液100 mL，加4.9 mL無水乙醇、5 mL蒸餾水，配成0.1 g/L的E3標準溶液。取此E3標準液，用PBS-BSA緩沖液梯度稀釋，配制100， 30， 10， 3和1 SymbolmA@ g/L的E3標準溶液，4 ℃保存。E3-HRP溶液的配制：取E3-HRP溶液，以PBS-BSA緩沖液為梯度稀釋，配制1∶100， 1∶200， 1∶500， 1∶800和1∶1000（V／V）的E3-HRP溶液，

4 ℃保存。FITC-E3抗體溶液的配制：取FITC-E3抗體，以PBS-BSA緩沖液梯度稀釋，配制1∶100， 1∶200和1∶500（V／V）的FITC-E3抗體溶液，4 ℃保存。

2.2.2 尿樣的采集和處理 采集3份男性尿樣，3份女性尿樣，1份13周孕婦尿樣、1份17周孕婦尿樣。處理方法：分別取原尿0.5 mL于10 mL具塞離心管中，加2.0 mL蒸餾水， 2.5 mL 2.0 mol/L HCl，置沸水浴中，使結合態(tài)E3完全水解為游離E3，加熱30 min后取出，冷卻至室溫，用2 mol/L Na2CO3溶液調至pH≈7.4。再用蒸餾水將溶液稀釋到7.5 mL。原尿液被稀釋了15倍，4 ℃保存?zhèn)溆?。使用時與PBS-BSA緩沖液等體積混和。

2.2.3 尿液中E3含量的分析過程 （1）取試管28支，分成14組，每組2支，各加入E3-HRP SymbolmA@ L，第一組加PBS-BSA緩沖液50 SymbolmA@ L，2～6組加1， 3， 10， 30和100 SymbolmA@ g/L的E3標準溶液50 SymbolmA@ L，7～14組加1～8號尿樣50 SymbolmA@ L，混勻后于每支試管中加入FITC-E3抗體溶液50 SymbolmA@ L，37 ℃水浴中加熱15 min；（2）在每支試管中加入羊抗FITC包被的磁微粒（5 g/L）50 SymbolmA@ L ，37 ℃水浴加熱10 min；（3）試管置于磁性分離器上，磁微粒沉于試管底部，傾去溶液，試管脫離磁分離器，振搖試管，每管中加入600 SymbolmA@ L PBST洗滌液，試管再次置于磁性分離器上，磁微粒沉于試管底部，傾去溶液，如此洗滌5次，每次需將試管靜置在磁分離器上3 min，使磁微粒沉降完全；（4）在每支試管中加入300 SymbolmA@ L發(fā)光底物（發(fā)光底物A和B需等體積混合），37 ℃水浴加熱20 min；（5）擦干試管外壁的水，置于冷光分析儀中，測定RLU，經線性擬合，進行定量分析（包括靈敏度、線性范圍和檢出限等）。

3 結果與討論

3．1 分析條件的優(yōu)化

3．1．1 E3-HRP和FITC-E3抗體稀釋濃度的優(yōu)化通過棋盤實驗對E3-HRP和FITC-E3抗體稀釋濃度進行選擇，在其它條件不變的情況下，B0為加入PBS-BSA緩沖液時的RLU，B1和B5分別為加入1和100 SymbolmA@ g/L E3標準溶液時的RLU，實驗結果見表1。在標準品抗原存在下，B/B0值可反映酶標抗原與抗體的結合率。由于本實驗采用了競爭法，酶標抗原與標準品抗原競爭抗體，標準品抗原濃度越大，結合到抗體上的酶標抗原越少，ＲＬＵ越小，B/B0值越小；反之則越大。為確保標準曲線上每個濃度點的結合率之間有足夠的落差，保證檢測的靈敏度和準確度，曲線上最小劑量點的B1/B0＞80%和最大劑量點的B5/B0＜20%，較為適宜。從結果分析，選擇FITC-E3抗體（1∶100）和E3-HRP（1∶500）較為合適。

表1 棋盤滴定實驗

Table 1 Chessboard titration

FITC-E3抗體稀釋度

Dilution of FITC-anti-estriol

antibodyE3-HRP稀釋度

Dilution of horsradish

peroxidase （HRP）- estriol

3.1.3 溫育時間的優(yōu)化 溫育溫度為37 ℃時， FITC-E3抗體與E3-HRP在發(fā)生免疫反應時，由于反應在均相體系中進行，反應很快達到平衡。溫育15 min后，ＲＬＵ接近最大值，溫育時間與ＲＬＵ的關系見圖3a，E3測定實驗中溫育時間選擇為15 min。羊抗FITC抗體包被的磁微粒與FITC-E3抗體抗原結合物發(fā)生免疫反應時，由于反應在近于均相的體系中進行，反應很快達平衡。溫育時間與ＲＬＵ的關系見圖3b。E3測定實驗中溫育時間為10 min即可。加入發(fā)光底物后，平臺期維持時間很長，溫育時間與RLU的關系見圖3c，E3測定實驗中溫育時間為20 min。

圖3 溫育反應時間對發(fā)光強度的影響

Fig． 3 Effect of reaction time on luminescence intensity

Incubation on addition： （a） FITC-E3 antibody; （b） goat anti-FITC antibody coated magnetic micropartide; （c） luminescence

substrate.

3.1.4 影響發(fā)光強度和測定結果的其它因素 免疫反應、化學發(fā)光反應的溫度對RLU有影響，37 ℃溫浴能縮短反應達平衡的時間。洗滌磁微粒時，洗滌次數、洗滌劑用量和磁微粒沉降時間對測定結果有影響，洗滌5次，洗滌劑用量600 SymbolmA@ L，磁微粒沉降時間3 min。空白實驗表明，空白值低，測定值的精密度好。

3.2 方法的分析特性

3.2.1 標準曲線 在最佳反應條件下， E3標準品濃度分別為0， 1， 3， 10， 30和100 SymbolmA@ g/L， 以logY對logX 作圖，線性回歸方程為logY＝1.5029logX－1.6849，線性相關系數r＝0. 9975，線性范圍為1～100 SymbolmA@ g/L，可用于準確定量分析。實驗中用了與儀器相配的軟件計算。該線性方程采用的是logY－logX的線性回歸數學模型，其線性方程表達式為： logY＝a＋b logX。其中， X為標準品（或待測樣品）濃度，logit（Y）＝ln（Ｙ′1－Y′），Y′＝B－NSBB0－NSB，式中，B為標準品（或待測樣品）的ＲＬＵ，B0為不加標準品（或待測樣品）的ＲＬＵ，NSB為不加抗體時的ＲＬＵ，很低，可忽略，Y′≈B／B0。

3.2.2 檢出限 E3標準品濃度為0 SymbolmA@ g/L時，平行測定10管的RLU，計算平均值及其標準偏差（SD），發(fā)光平均值減去兩倍標準偏差后的值代入線性方程，所得濃度即為方法的檢出限，本方法的檢出限為025

3.2.3 回收率 在測定樣品中加入已知量的被測物質，測定其含量，并與已知量相比較，其結果用回收率表示。分別向稀釋60倍的13周孕婦尿樣中加入E3，使樣品中增加的E3濃度為5.0， 25.0和50 SymbolmA@ g/L，然后用本方法對加標樣品和稀釋60倍的13周孕婦尿樣中的E3含量進行測定。重復實驗3次，計算得到

RSD （%）14125.96.7

平均回收率分別為98%，103%和105%。

3.2.4 精密度 對稀釋60倍的13周孕婦尿樣和稀釋240倍的18周孕婦尿樣進行分析，每次每個樣品做10管平行，連續(xù)測定3次，分別計算批內變異和批間變異。如表2所示，批內相對標準偏差小于14%，批間相對標準偏差均＜7%。

3．3 尿液中Ｅ3的測定

用PBS-BSA緩沖液倍比稀釋經處理的13周孕婦尿樣，得到稀釋度分別為1/2， 1/4和1/8的樣品。用本方法測定E3含量，稀釋度作為X 軸，樣品E3含量測值為Y軸，作圖。得到擬合直線方程: Y＝92.3428X＋03300；線性相關系數: r＝0.9993。

對隨機選取的3份男性尿樣，3份女性尿樣和2份孕期在13 ～18周的孕婦尿樣進行了測定，測定結果列于表3。孕婦尿樣的E3含量高于非孕女性和男性，孕期18周的孕婦尿樣的E3含量高于孕期13周，說明本方法具有很好的臨床應用前景。

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Magnetic Microparticle Chemiluminescence Immunoassay

Method for Determination of Estriol in Human Urine

ZHENG Guo-Jin1，4， FANG Lu-Qiu2，4， CHEN Hui4， LI Zhen-Jia3， YING Xi-Tang3， LIN Jin-Ming4

1（Department of Chemistry， Chuxiong Medical College， Chuxiong 675000）

2（Department of Chemical Engineering and Yangtze Normal University， Chongqing 408100）

3（Beijin Chemclin Biotech Co.， Ltd， Beijing 100012）

4（Department of Chemistry， Tsinghua University， Beijing100084）

Abstract A magnetic microparticle chemiluminescence immunoassay method was developed for the determination of estriol in human urine. The sample of estriol and horseradish peroxidase （HRP） labeled estriol with fluorescein isothiocyanate （FITC） labeled rabbit anti-estriol antibodies were mixed in homogeneous system. The reaction product in homogeneous system can be combined onto the goat anti-FITC antibody-coated magnetic particles. After the magnetic field separation of bond and free， the light-emitting substrate was added to magnetic particles. Under the optimization conditions， this methods can be used to detect estriol in a linear range of 1－100 SymbolmA@ g/L， detection limit of 0.25

SymbolmA@ g/L， relative standard deviation less than 14% and between-relative standard deviation less than 7%. The method has been applied for the determination of estriol in real samples， and the results are satisfactory.

Keywords Estriol; Chemiluminescence immunoassay; Magnetic particles; Urine

（Received 5 April 2010; accepted 8 July 2010）