離子對反相高效液相色譜法同時測定大鼠血漿和紅細胞中外源性磷酸肌酸及其代謝產(chǎn)物和相關(guān)三磷酸腺苷

摘 要 建立了離子對反相高效液相色譜（IP-RPHPLC）同時測定大鼠血漿和紅細胞（RBC）中磷酸肌酸（PCr）及其代謝產(chǎn)物肌酸（Cr）以及相關(guān)三磷酸腺苷（ATP）濃度的方法。采用Kromasil-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 SymbolmA@ m），流動相A: 0.2% KH2PO4＋0.08% 四丁基硫酸氫銨混合溶液（pH 3.0）; 流動相B： 0.2% KH2PO4＋0.08% 四丁基硫酸氫銨混合溶液（以1 mol/L NaOH調(diào)至pH 7.5）; 流動相C: 甲醇。梯度洗脫，同時改變流速和檢測波長。血漿及RBC樣品以HClO4沉淀蛋白予以凈化。選用甲氧芐啶（TMP）為內(nèi)標，以峰面積比內(nèi)標法進行定量分析，以基線扣除法計算外源性PCr、Cr和相關(guān)ATP濃度。在上述色譜條件下，血漿及RBC中PCr、Cr、ATP及TMP達基線分離，不受基質(zhì)干擾，PCr在10～7500 mg/L（血漿）、10～2500 mg/L（RBC），Cr和ATP在10～1500 mg/L（血漿）、10～750 mg/L（RBC）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r2＞0.99）；3種分析物QC樣品的日內(nèi)和日間精密度（RSD）均小于10％; 回收率均大于92％。采用本方法測定了靜脈和口服給藥PCr后大鼠血漿和RBC中3種分析物濃度，結(jié)果滿意。

關(guān)鍵詞 離子對高效液相色譜; 磷酸肌酸; 肌酸; 三磷酸腺苷; 血漿; 紅細胞；藥物代謝動力學

1 引 言

磷酸肌酸（Phosphocreatine，PCr）是機體化學能量的儲備形式，用于高能磷苷三磷酸腺苷（ATP）的再合成，在體內(nèi)能量代謝中發(fā)揮重要作用。外源性PCr可穿透缺血細胞直接供能，從而產(chǎn)生心肌保護作用和運動強度耐力增強作用[1～3]。PCr是一種高效低毒的心肌保護藥，臨床用于治療心梗、心衰以及心臟手術(shù)時停搏液中附加成分[4]。此外，PCr還是不違反興奮劑規(guī)則的力量和速度運動比賽項目的首選運動補劑。

盡管PCr已有大量非臨床和臨床藥理研究，但其藥代動力學研究卻較少[1，4，5]，且均采用分光光度法和化學發(fā)光法等非特異方法檢測血漿中的PCr，這些測定方法準確性有限。近年研究發(fā)現(xiàn)，PCr的代謝產(chǎn)物肌酸（Creatine Cr）具有較好的生理和藥理活性，PCr在體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化為Cr的動力學過程的研究迄今處于空白狀態(tài)。本研究組的前期工作發(fā)現(xiàn)，靜脈注射PCr后，血液流變性能明顯改善，全血粘度、血漿粘度以及紅細胞（RBC）滲透脆性明顯降低。理論分析，這與PCr參與能量穿梭代謝促使高能磷苷ATP的再合成，導致RBC中ATP水平升高有關(guān)。

本研究建立了離子對反相高效液相色譜（IP-RPHPLC）同時測定給予PCr大鼠血漿及RBC中PCr、Cr以及ATP濃度的方法，以基線扣除法（Baseline subtraction）[6] 計算外源性PCr及其代謝產(chǎn)物Cr以及相關(guān)ATP的濃度，為PCr及其代謝處置的研究提供了生物分析方法。

2 實驗部分

2.1 儀器、試劑及材料

1100高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）， 包括四元泵、在線脫氣裝置、低溫自動進樣器、紫外檢測器、色譜工作站；TDZ5-WS臺式高速冷凍離心機（湘儀離心機儀器有限公司）；XW-80A型旋渦混合器（上海精科實業(yè)有限公司）；CSF-18超聲波發(fā)生器（上海超聲波儀器廠）；PHS-3C型pH計（上海精密科學儀器有限公司）。

藥物 PCr（注射用粉針劑：內(nèi)含磷酸肌酸二鈉鹽四水合物，按無水物計含量為磷酸肌酸鈉1 g/支，哈爾濱博萊制藥有限公司惠贈，批號070823，純度＞97%）；PCr對照品（磷酸肌酸二鈉鹽四水合物，德國MERCK公司，純度99%）；Cr對照品（美國MERCK公司，純度99%）；ATP對照品（美國MERCK公司，純度99%）；甲氧芐啶（Trimethoprim，TMP，內(nèi)標）對照品（中國藥品生物制品檢定所，純度99%）；四丁基硫酸氫銨（Tetrabutylammonium hydrogen sulfate，TBA，美國JK公司）；甲醇（色譜純，美國TEDIA公司）；KH2PO4， NaOH， HClO4， K2CO3等試劑均為分析純。

健康SD大鼠，體重180～230 g，由大連醫(yī)科大學動物實驗中心提供，動物合格證號：SCXK（遼）2008-0002。

分 析 化 學第39卷

第1期鄒玲莉等： 離子對反相高效液相色譜法同時測定大鼠血漿和紅細胞中外源性磷酸肌酸及其代謝產(chǎn)物和相關(guān)三磷酸腺苷

2.2 實驗方法

2.2.1 色譜條件 分析柱為Kromasil-C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 SymbolmA@ m），預柱為Kromasil- C18 保護柱（20 mm×4.6 mm，10 SymbolmA@ m）（大連依利特分析儀器有限公司）; 柱溫為室溫; 流動相由0.2% KH2PO4＋0．08% 四丁基硫酸氫銨混合溶液（pH 3.0）（A）、0.2% KH2PO4＋0.08% 四丁基硫酸氫銨混合溶液（以1 mol/L NaOH調(diào)pH 7.5）（B），以及甲醇（C）組成。采用梯度洗脫，同時改變流速和檢測波長（表1），進樣量20 SymbolmA@ L，自動進樣器溫度為2～4 ℃。

2.2.2 溶液的配制 將75 g/L PCr，15 g/L Cr和15 g/L ATP的儲備液分別進行梯度稀釋，得到100～75000 mg/L PCr， 100～15000 mg/L Cr， 100～15000 mg/L ATP的系列對照品工作溶液。另準確稱取適量TMP，加MeOH溶解并稀釋，制得5 g/L的儲備液。上述儲備液均于－20 ℃低溫保存，系列對照品工作液臨用當天配制，4 ℃保存。

2.2.3 血漿/紅細胞（Red blood cell，RBC）樣品的收集 于大鼠給藥前后不同時間從內(nèi)眥靜脈收集400 SymbolmA@ L血樣，置于肝素化離心管中，4 ℃離心（3000 r/min）10 min; 取上層血漿100 SymbolmA@ L；將剩余血樣中的上層盡可能吸盡棄去后，加500 SymbolmA@ L預冷的生理鹽水，輕輕顛倒5～6 次，4 ℃低溫離心（3000 r/min）10 min，棄去上層， 同法再進行2 次，取出下層100 SymbolmA@ L，加等體積蒸餾水，4 ℃離心（3000 r/min）10 min，取上層100 SymbolmA@ L，此為RBC樣本。

2.2.4 樣品預處理 取大鼠血漿或RBC樣品100 SymbolmA@ L，加入10 SymbolmA@ L TMP溶液、30 SymbolmA@ L H2O，漩混0.5 min， 加入預先冰冷的360或100 SymbolmA@ L 6% HClO4，漩混0.5 min，置冰浴中10 min，4 ℃離心（10000 r/min）2 min，取上清液300 SymbolmA@ L或15入預冷的40或20 SymbolmA@ L 2 mol/L K2CO4，至pH中性，離心后取上清液20 SymbolmA@ L進行HPLC測定。

2.2.5 標準曲線的制備 準確吸取100 SymbolmA@ L空白血漿或空白RBC樣品8份，分別加上述3個分析物的系列對照品工作液和內(nèi)標（TMP）儲備液各10 SymbolmA@ L，混勻，制得含7500，2500，500，100，50，20和10 mg/L PCr，含1500，750，300，100，50，20和10 mg/L Cr和ATP的血漿標準樣品，以及含2500，500，100，50，20，10和5 mg/L PCr，含750，300，100，50，20，10和5 mg/L Cr和ATP的RBC標準樣品，然后按2.2.4節(jié)操作，記錄樣品色譜圖及PCr、Cr、ATP和TMP的峰面積，如上重復3次，按基線扣除法，由血漿（或RBC標準樣品）與空白血漿（或RBC樣品）的峰面積之差與/TMP的比值，計算得其平均值Y，對樣品中外加分析物濃度X（mg/L）按加權(quán)最小二乘法作線性回歸，權(quán)重因子為1/C2（C為藥物濃度），得出線性回歸方程。

3 結(jié)果與討論

3.1 IP-HPLC方法學的建立和優(yōu)化

3.1.1 色譜條件優(yōu)化 PCr、Cr和ATP均為極性化合物，在C18柱上不被保留，故不能直接采用常規(guī)反相HPLC法測定。測定心肌中高能磷酸鹽多采用離子交換色譜法[1]，但該法因繁雜、耗費大而不適用。本研究采用IP-HPLC分析上述化合物。PCr和Cr分子中缺少生色基團，紫外吸收很差，只能采用末端吸收波長，但血漿和RBC基質(zhì)會產(chǎn)生干擾，必須予以排除；ATP和TMP不僅在210 nm處有吸收，在260 nm也有吸收，故本研究采用變波長方法，以210 nm測定PCr和Cr，以260 nm測定TMP和ATP。PCr和Cr的保留時間短，而ATP的保留時間長，等度洗脫將長達2 h，為縮短時間，在PCr和Cr出峰后增大流速和加入MeOH，使每次色譜時間縮短至30 min。流動相中反離子TBA和緩沖液KH2PO4濃度對上述化合物的色譜行為有顯著影響，隨其濃度升高，保留時間延長。結(jié)果表明，以008％ TBA和0.2％ KH2PO4最為適宜。流動相pH值也有影響3種化合物的色譜行為，先采用pH 3.0的流動相，利于PCr和Cr檢測；再采用pH 7.5的流動相，利于ATP的檢測。如只采用pH 3.0的流動相，則ATP的保留時間大于2 h；僅采用pH 7.5的流動相，則PCr和Cr峰嚴重拖尾，且保留時間延長。文獻[7]采用外標法測定心肌中高能磷酸鹽，文獻[8]以AP4為內(nèi)標，但AP4的保留時間比ATP更長，且價格昂貴，不易得。本研究以TMP為內(nèi)標物，其保留時間正介于PCr和ATP之間，定量分析更準確可靠。

3.1.2 樣品制備 由于分析物均為極性化合物，樣品的制備難以用有機溶劑萃取富集，只能采用加酸沉淀蛋白的方法制備血漿和RBC樣品。但PCr在酸中不穩(wěn)定，室溫下即分解，故樣品制備時各步均需在低溫（冰浴中）下進行，試管及HClO4和K2CO3溶液均應預先冷卻。且去蛋白后應立即以堿中和至pH中性。此樣品預處理方法具有稀釋效應，加之PCr、Cr和ATP克分子消光系數(shù)低，故本方法的LOQ較高（mg/L級），但由于PCr LD50高至3 g/kg，毒性低，臨床用藥劑量大，此LOQ亦能滿足PCr藥動學研究的要求。

3.1.3 外源性PCr、Cr及相關(guān)ATP的定量 本研究測定的3種化合物均為內(nèi)源性生理活性物質(zhì)，而本研究的目的是定量分析血漿和RBC中外源性PCr及其代謝物Cr和通過內(nèi)源性機制生成的ATP。目前，內(nèi)源性化合物的藥動學研究仍是藥動學領(lǐng)域的難題，即如何與內(nèi)源性化合物相區(qū)分，最好的方法是將外源性藥物進行同位素標記，但由于同位素標記技術(shù)復雜，又帶來污染，以及耗費大，特別是這種方法不適用于人體藥動學研究，故很少用。目前尚無法獲得不含PCr、Cr和ATP的空白血漿/RBC樣品，因此只可采用基線扣除法（Baseline subtraction），即將給藥后測得的內(nèi)源性和外源性化合物的總量減去給藥前測得的內(nèi)源性化合物的量，這種方法已用于VitC、β-胡蘿卜素、肌酸等藥動學的研究[6，9~11]。由于內(nèi)源性生理活性物質(zhì)有時受時辰節(jié)律的影響，故本研究均在每日固定的時間給藥，盡管內(nèi)源性肌酸的含量在日內(nèi)是相當穩(wěn)定，機體的高能磷酸鹽水平也是相當穩(wěn)定[12]。

3.2 方法學驗證

3.2.1 方法專屬性 由圖1可見，在優(yōu)化的色譜條件下，PCr， Cr， ATP和TMP的保留時間分別為58， 3.4， 27.2和17.8 min，四者之間達基線分離;空白血漿中雜質(zhì)峰不干擾測定; 給藥后血漿樣品的HPLC圖譜中未見代謝物干擾（RBC樣品色譜圖與血漿樣品色譜圖類同，圖略）。

3.2.2 PCr， Cr和ATP的血漿/RBC標準曲線、線性范圍及定量限 血漿中PCr在10～7500 mg/L，Cr和ATP在10～1500 mg/L范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，其回歸方程分別為Y＝0.00236X－0.00696（R2＝0.9987， n＝3）、 Y＝0.00305X－0.00492（R2＝0.9969， n＝3）和Y＝0.00335X＋0.00404（R2＝09981， n＝3）。血漿中的PCr， Cr和ATP的定量限（LOQ）均為10 mg/L。

RBC中PCr在10～2500 mg/L，Cr和ATP在10～750 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其回歸方程分別為Y＝0.00488X－0.00049（R2＝0.9997， n＝3）、 Y＝0.00487X－0.00027（R2＝0.9998， n ＝3）和Y ＝0.00394X＋000130（R2＝0.9989， n ＝3）。RBC中的PCr， Cr和ATP的定量限（LOQ）均為5 mg/L。

3.2.3 精密度 由表2和表3可知，采用本方法測定，QC樣品中PCr、Cr和ATP的日內(nèi)精密度和日間精密度較高（＜10％）。

圖1 PCr， Cr和ATP的高效液相色譜圖

Fig．1 Chromatograms of phosphocreatine（PCr）， creatine（Cr） and adenosine triphosphate（ATP）

（a） 空白血漿樣品（Blanck plasma sample）；（b）空白血漿中加入Cr、PCr、TMP和ATP對照品（Blanck plasma sample spiked with standard PCr， Cr， trimethoprim（TMP） and ATP）；（c）大鼠靜注PCr 1000 mg/kg 20 min后加入TMP的血漿樣品（Plasma sample， collected at 20 min after intravenous administration of PCr 1000 mg/kg）；（d）大鼠口服PCr 1000 mg/kg 60 min后加入TMP的血漿樣品（plasma sample， collected at 60 min after oral administration of PCr 1000 mg/kg）。1. Cr;2. PCr; 3. TMP; 4. ATP。

3.2.4 提取回收率 以血漿和RBC的質(zhì)控樣品（QC）測得的峰面積與未經(jīng)處理的相應濃度對照品溶液直接進樣測得峰面積進行比較，得提取回收率。由表4可知，本方法的提取回收率高于92％。

3.2.5 樣品的穩(wěn)定性 血漿和RBC QC樣品－20 ℃凍存1個月內(nèi)穩(wěn)定；PCr 血漿和RBC樣品室溫保存2 h后，含量即降至90％以下；Cr和ATP樣品室溫保存 4 h后，含量降至90％以下，說明血漿和RBC樣品在室溫下穩(wěn)定性較差，故操作過程嚴格控制在低溫下進行。其儲備液在－20 ℃凍存， 至少2個月穩(wěn)定。樣品經(jīng)HClO4處理后，在2～4 ℃保存，24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.3 方法學在藥代動力學和代謝處置研究中的應用

取大鼠5只，自尾靜脈注射PCr 1000 mg/kg，于給藥前及給藥后2，4，6，10，15，20，30，40，60，90，120和150 min從內(nèi)眥靜脈收集400 SymbolmA@ L血樣， 圖2 大鼠靜注PCr 1000 mg/kg后血漿和RBC中PCr， Cr和ATP的平均C-t曲線（n＝5）

Fig．2 Mean plasma and RBC concentration-time profiles derived after intravenous administration of 1000 mg/kg of PCr to rats（n＝5）

（） Cr plasma; （◆） PCr plasma; （△） ATP RBC; （□） Cr RBC.按2.2.3和2.2.4項操作，收集血漿和RBC樣品并進行樣品預處理和HPLC測定，按內(nèi)標峰面積法進行定量分析，并以基線扣除法以相應標準曲線回歸方程得外源性PCr及其代謝物Cr和相關(guān)ATP濃度，繪制濃度（C）-時間（t）曲線（圖2）。

由圖2可見，PCr的C-t曲線呈雙指數(shù)衰減，經(jīng)藥代動力學軟件3p97程序處理屬于二室模型藥物，其代謝產(chǎn)物Cr的C-t曲線類似于血管外給藥一室模型。由3p97藥代動力學程序計算得PCr的消除半衰期僅為24.7～26.8 min，說明PCr在體內(nèi)消除快速，但其代謝物Cr的消除半衰期相對較長，為406～427 min。由圖2還可看出，在靜注PCr后2 min即可測出代謝物Cr，且濃度較高，很快（20 min）達峰值。但靜注PCr后血漿中未測出ATP，這可能與血漿不是耗能組織有關(guān)。靜注1000 mg/kg PCr后，RBC中未測出原藥PCr，但RBC中很快（給藥2 min）出現(xiàn)代謝產(chǎn)物Cr及相關(guān)ATP，達峰時間分別為120和82 min，高峰濃度分別達33.8和123 mg/L。

4 結(jié) 論

本研究建立的IP-RPHPLC-UV法，方法學驗證表明，本方法特異性強，精密度、準確度和回收率高，適合于大鼠血漿和RBC中外源性PCr及其代謝物Cr和相關(guān)ATP的檢測，以及外源性PCr藥代動力學和代謝處置的研究。本方法不僅為PCr的上述研究提供了生物分析方法學，亦為PCr靜注后血粘度的降低提供了支持性證據(jù)。

致 謝 哈爾濱博萊制藥公司惠贈磷酸肌酸藥物。

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Simultaneous Determination of Exogenous Phosphocreatine and

Its Metabolite Creatine and Related Adenosine Triphosphate in

Rat Plasma and Red Blood Cell by Ion-Pair High Performance

Liquid Chromatography-Ultraviolet-Visible Assay

ZOU Ling-Li， LI Qiu-Sha， HAN Guo-Zhu*， L Li

（College of Pharmacy， Dalian Medical University， Dalian 116044）

Abstract To provide a bio-analytical methodology for study of pharmacokinetics and metabolic disposition of exogenous PCr in rats， ion-pair HPLC-UV method was developed for the simultaneous determination of exogenous phosphocreatine（PCr） and its metabolite creatine（Cr） and related ATP in plasma and RBC of rats. By changing flow rate and detection wavelength， the analytes were separated and detected on a Kromasil C18 column with a tertiary gradient mobile phase composed of（A） 02% KH2PO4 ＋0.08% tetrabutylammonium hydrogen sulphate（pH 3.0），（B） the abovementioned solution whose pH value was adjusted to 7.5 with 1 mol/L NaOH， and（C） MeOH. The blank plasma and RBC sample was initially run for baseline subtraction. For quantification， TMP was used as internal standard. Plasma and RBC were deproteinized with 6% PCA prior to HPLC. The method was shown to be specific without interference from matrix. A good linearity was obtained over a wide range of 10－7500 mg/L（plasma） and 10－2500 mg/L（RBC） for PCr， and 10－1500 mg/L（plasma） and 10－750 mg/L（RBC） for both Cr and ATP（R2＞099）. The samples of 3 analytes showed that intra-day and inter-day precisions（RSD） were ＜10 %， and the extraction recovery was ＞92%. The method was successfully used to determine plasma and RBC of the 3 analytes after intravenous administration of PCr to rats simultaneously. The results indicated this method meet the requirement of PCr pharmacokinetics study and metabolic disposition of rats.

Keywords Ion-pair high performance liquid chromatography; Phosphocreatine；Creatine；Adenosine triphosphate；Plasma；Red blood cell；Pharmacokinetics

（Received 30 April 2010; accepted 12 July 2010）