化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)人血清中的癌胚抗原

摘 要 基于辣根過氧化物酶（HRP）催化H2O2氧化3-（4-羥苯基）丙酸（PHPPA），生成能發(fā)熒光的3-（4-羥苯基）丙酸二聚體，在乙腈介質(zhì)中，在增強(qiáng)劑咪唑參與下，與雙[2，4，6-三氯苯基]草酸酯（TCPO）和H2O2反應(yīng)產(chǎn)生強(qiáng)化學(xué)發(fā)光。用辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記癌胚抗原（CEA）單克隆抗體，通過CEA的雙抗夾心免疫反應(yīng)，建立了簡(jiǎn)單、靈敏和快速檢測(cè)人血清中的癌胚抗原（CEA）含量的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。CEA在1.0～80.0 SymbolmA@ g/L范圍具有良好的線性關(guān)系; 檢出限為0.3 SymbolmA@ g/L（S/N＝3），相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n＝11）為3.9%。已成功用于人血清樣品中CEA含量的測(cè)定。

關(guān)鍵詞 癌胚抗原；酶催化熒光反應(yīng)；化學(xué)發(fā)光免疫分析

1 引 言

癌胚抗原（Carcinoembryonic antigen，CEA）是存在于細(xì)胞表面的富含多糖的蛋白復(fù)合物，分子量約為15000～20000，多在結(jié)腸、乳房、肺腺癌和大多數(shù)上皮來源的腫瘤中表達(dá)。對(duì)血清中CEA進(jìn)行定量檢測(cè)，在惡性腫瘤的診斷、評(píng)估病變范圍、預(yù)測(cè)評(píng)估療效、監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)等方面發(fā)揮著重要的作用。檢測(cè)CEA的常用方法有放免法（RIA）[1]和酶聯(lián)免疫法（ELISA）[2]。RIA法敏感性高，但存在放射性同位素?fù)p傷和污染、不穩(wěn)定等弊端，容易對(duì)操作人員造成傷害。ELISA法穩(wěn)定性好且簡(jiǎn)便易操作，但敏感性不及RIA法。近年來發(fā)展了熒光免疫分析法[3] 、化學(xué)發(fā)光免疫分析法[4，5]、脂質(zhì)體免疫分析法[6，7]等，這些方法操作簡(jiǎn)便，靈敏度高。

化學(xué)發(fā)光分析方法與免疫分析相結(jié)合已經(jīng)成為化學(xué)與醫(yī)學(xué)交叉的研究熱點(diǎn)，它具備了化學(xué)發(fā)光的高靈敏度，也擁有免疫分析方法高特異性的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)提高目標(biāo)物質(zhì)定量分析的檢出能力具有重要意義［8］。其檢測(cè)反應(yīng)多采用辣根過氧化物酶（HRP）催化對(duì)碘苯酚增強(qiáng)的魯米諾同H2O2的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。已有多種試劑盒用于臨床檢測(cè)。與魯米諾化學(xué)發(fā)光體系相比，過氧化草酸酯化學(xué)發(fā)光體系具有更高的發(fā)光量子產(chǎn)率，通?？筛哌_(dá)30%，且發(fā)光持續(xù)穩(wěn)定時(shí)間長(zhǎng)，能夠通過較長(zhǎng)時(shí)間成像或者在一定時(shí)間內(nèi)對(duì)發(fā)光進(jìn)行積分， 進(jìn)一步提高測(cè)定靈敏度。文獻(xiàn)[9]采用異硫氰酸熒光素或8-苯氨基-1-萘磺酸作為抗體的標(biāo)記物，對(duì)過氧化草酸酯（TCPO）化學(xué)發(fā)光體系進(jìn)行免疫分析。由于標(biāo)記物的測(cè)定不存在催化放大作用，反應(yīng)介質(zhì)為水溶液，使TCPO化學(xué)發(fā)光體系的量子產(chǎn)率降低，靈敏度低于熒光免疫分析法。HRP能催化3-（4-羥苯基）丙酸（PHPPA）與H2O2的反應(yīng)， 可將其作為電子的供體來構(gòu)建電位免疫傳感器[10]。本實(shí)驗(yàn)用HRP標(biāo)記CEA抗體，通過雙抗夾心法，在免疫反應(yīng)完成后，二抗上的HRP催化H2O2氧化PHPPA生成熒光物質(zhì) 3-（4-羥苯基）丙酸二聚物（PHPPA Dimer）。在乙腈介質(zhì)中，利用咪唑增強(qiáng)的TCPO-H2O2-PHPPA Dimer化學(xué)發(fā)光反應(yīng)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光測(cè)定。此方法簡(jiǎn)便、快速、儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，靈敏度高于ELISA法和魯米諾化學(xué)發(fā)光免疫法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

MPI-A型多功能化學(xué)發(fā)光分析儀（西安瑞邁分析儀器有限公司）；ACQ-600超聲波發(fā)生器（西安翔達(dá)超聲技術(shù)工程部）；HC-3018R高速冷凍離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；精密pH計(jì)（上海雷池儀器廠）；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠）；XK96型微量振蕩器（姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司）。

CEA診斷試劑盒（鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司）；乙腈（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；5.0 mmol/L TCPO（自制）的乙腈溶液；1.0 mol/L H2O2-乙腈溶液；1.0 mmol/L咪唑（天津市遠(yuǎn)航化學(xué)品有限公司）乙腈溶液；0.05 mol/L H2O2緩沖溶液；0.05 mol/L 3-（4-羥苯基）丙酸（PHPPA， Acros Organics公司）緩沖溶液；H2O2，Na2CO3，NaHCO3，NaH2PO4，Na2HPO4，NaOH，H3BO3、Na2B4O7，CH3COONa，三羥甲基氨基甲烷（Tris），HCl，檸檬酸均購(gòu)自西安化學(xué)試劑廠。TCPO和H2O2的乙腈溶液使用時(shí)再用相同溶劑稀釋至所需濃度；PHPPA 和H2O2水溶液用pH 6.0磷酸鹽緩沖溶液稀釋至所需濃度。所有試劑均為分析純。水為離子交換水，再經(jīng)石英蒸餾器亞沸蒸餾制得。

2.2 人血清樣品預(yù)處理

樣品來自于新鮮的人體靜脈血液。用干凈的塑料收集新鮮的人血液，在不加入任何絮凝劑的狀態(tài)下，在室溫中沉降30 min后，以3000 r/min離心10 min，上層血清用小的樣品收集器收集，儲(chǔ)存在4 ℃冰箱中待用。

2.3 免疫分析方法

采用雙抗體夾心法，將待測(cè)樣本或CEA標(biāo)準(zhǔn)抗原加入到已包被有CEA單克隆抗體的96孔反應(yīng)板中，經(jīng)過孵育洗滌后，加入HRP標(biāo)記的抗CEA單克隆抗體。再次孵育，洗滌，拍干。再加入H2O2溶液和PHPPA溶液，振蕩混勻1 min，37 ℃溫育10 min。 圖1 實(shí)驗(yàn)過程

Fig．1 Procedures of proposed method此時(shí)二抗上的HRP催化H2O2氧化PHPPA生成發(fā)熒光的PHPPA的二聚體。用微量加樣器從各反應(yīng)孔中各吸取50 SymbolmA@ L反應(yīng)后的溶液于另一96孔反應(yīng)板中，加入H2O2（含咪唑）后放入發(fā)光檢測(cè)器，再加入TCPO乙腈溶液，8 s開始記錄化學(xué)發(fā)光信號(hào)。實(shí)驗(yàn)流程見圖1。

分 析 化 學(xué)第39卷

第1期薛 盼等： 化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)人血清中的癌胚抗原

3 結(jié)果與討論

在免疫反應(yīng)完成后的化學(xué)發(fā)光過程是基于二抗上標(biāo)記的HRP催化H2O2氧化PHPPA，生成具有熒光的3-（4-羥苯基）丙酸二聚體，然后H2O2將TCPO氧化成高能量的活性中間體，熒光物質(zhì)3-（4-羥苯基）丙酸二聚體從活性中間體吸收能量而被激發(fā)，當(dāng)從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。此定量檢測(cè)過程依賴于酶催化反應(yīng)程度和化學(xué)發(fā)光反應(yīng)條件。 圖2 HRP酶催化反應(yīng)和化學(xué)發(fā)光分析機(jī)理

Fig．2 Procedures of HRP-catalyzed reaction and chemiluminescence（CL）mechanism因此，TCPO，H2O2，咪唑和PHPPA的濃度以及溶液條件等因素在實(shí)驗(yàn)中被優(yōu)化。酶催化反應(yīng)[11]和化學(xué)發(fā)光反應(yīng)機(jī)理[12]見圖2。

3.1 HRP酶催化反應(yīng)條件優(yōu)化

3.1.1 酶催化反應(yīng)中緩沖溶液pH值對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響 在HRP酶催化反應(yīng)中，緩沖溶液的pH值對(duì)生成的熒光物質(zhì)3-（4-羥苯基）丙酸二聚體的濃度有較大的影響。在pH 4.0～11.0范圍內(nèi)， 考察了CH3COOH-CH3COONa （0.05 mol/L），Tris-HCl （0.05 mol/L），磷酸鹽等緩沖溶液的影響。酶催化反應(yīng)在磷酸鹽緩沖溶液中具有最好的穩(wěn)定性和最佳發(fā)光信噪比。pH 6.0時(shí)，具有最大的發(fā)光強(qiáng)度。

3.1.2 孵育時(shí)間和孵育溫度對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響 HRP的活性受到酶催化反應(yīng)孵育時(shí)間和孵育溫度的影響，研究表明，孵育溫度以37 ℃為最佳，當(dāng)溫度較高和較低時(shí)，HRP都表現(xiàn)出了較差的生物活性，所生成的熒光物質(zhì)3-（4-羥苯基）丙酸二聚體的濃度減小，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度降低。孵育時(shí)間則以10 min為宜，低于10 min化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度較低，孵育時(shí)間長(zhǎng)于10 min，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度增加緩慢。

3.1.3 催化反應(yīng)中H2O2 和PHPPA的濃度對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響 PHPPA和 H2O2用 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）稀釋。 圖3 PHPPA濃度對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響

Fig．3 Effect of 3-（4-hydroxyphenyl propioate）（PHPPA） concentration on CL Intensity分別在0.1～8.0 mmol/L 和0.1～50 mmol/L范圍內(nèi)考察了PHPPA和 H2O2濃度對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明，當(dāng)PHPPA濃度為5.0 mmol/L時(shí)，能獲得最大的發(fā)光信噪比。PHPPA的濃度高于5.0 mmol/L 時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度下降。信噪比降低（圖3）。H2O2最佳濃度為5.0 mmol/L。

3.2 化學(xué)發(fā)光條件優(yōu)化

3.2.1 溶劑對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響 TCPO在水相環(huán)境中溶解度較小，且實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)有水存在時(shí)，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度會(huì)降低。對(duì)幾種有機(jī)溶劑（如乙腈、乙醇、丙酮、四氫呋喃、正丁醇、叔丁醇、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二甲酯、乙酸乙酯等）的考察表明，以90％（V／V）乙腈為溶劑，可獲得最大發(fā)光信噪比和最佳的重現(xiàn)性。

3.2.2 TCPO，H2O2和咪唑的濃度對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響 在乙腈介質(zhì)中，咪唑?qū)CPO化學(xué)發(fā)光體系有很強(qiáng)的增強(qiáng)作用（圖4），考察了TCPO，H2O2和咪唑的濃度分別在0.5～5.0 mmol/L，0.05～1.0 mol/L和0.1～50 mmol/L范圍時(shí)，其濃度對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明，當(dāng)TCPO，H2O2和咪唑的濃度分別為5.0×10－3， 0.5和1.0×10－3 mol/L時(shí)，可以獲得最大的發(fā)光強(qiáng)度信噪比。

圖4 咪唑濃度對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響

Fig．4 Effect of Glyoxaline concentration on CL intensity

3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，CEA含量在1.0～80 SymbolmA@ g/L范圍內(nèi)具有線性關(guān)系，ΔI(xiàn)＝6.4331c＋28774（r＝0.9989）; 檢出限為0.3 SymbolmA@ g/L（3σ）。對(duì)20 SymbolmA@ g/L CEA平行測(cè)定11次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為39％。與ELISA法和魯米諾化學(xué)發(fā)光免疫法相比，此方法具有更高的靈敏度（ELISA法和魯米諾化學(xué)發(fā)光免疫法的檢出限分別為1.7和0.5 SymbolmA@ g/L）。

3.4 樣品分析和回收實(shí)驗(yàn)

分別用ELISA法和本方法對(duì)人血清樣品（采自陜西師范大學(xué)醫(yī)院）中CEA含量進(jìn)行測(cè)定，并用本方法進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1， 結(jié)果令人滿意。

表1 樣品回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Table 1 Results of recovery test of carcinoembryonic antigen（CEA） in human scrum samples

樣品

SampleCEA （SymbolmA@ g/L）ELISA法

ELISA method本方法

Present method加入濃度

Added（SymbolmA@ g/L）測(cè)得濃度

Found（SymbolmA@ g/L）回收率

Recovery

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Chemiluminescent Analysis of Carcinoembryonic

Antigen in Serum Samples

XUE Pan， ZHANG Zhu-Jun*， ZHANG Xiao-Ming

（School of Chemistry and Material Science， Shaanxi Normal University，

Key Laboratory of Analytical Chemistry for Life Science of Shaanxi Province， Xi′an710062）

Abstract Based on the catalyzed oxidation of horseradish peroxidase （HRP） to the hydrogen peroxide and 3-（4-hydroxyphenyl propionate） （PHPPA） reaction， the fluorescent product， 3-（4-hydroxyphenyl propionate） dimer， can react with bis（2，4，6-trichlorophenyl）oxalate（TCPO） and hydrogen peroxide to enhance chemical luminescence by the participation of imidazole enhancer in acetonitrile medium. With horseradish peroxidase（HRP） labeled Carcinoembryonic Antigen（CEA） monoclonal antibody， by “sandwich type” CEA immune response， a simple， sensitive， and rapid chemiluminescence immunoassay method for the determination of Carcinoembryonic Antigen （CEA） in human serum samples has been developed. There was a very good linear correlation between response and amount of CEA in the range of 1.0－80.0 SymbolmA@ g/L （r＝0.9989）. The detection limit was 0.3 SymbolmA@ g/L （S/N＝3）. The relative standard deviation （n＝11） was 3.9%. The proposed method has been used for the determination of CEA in human serum.

Keywords Carcinoembryonic antigen; Horseradish peroxidase-catalyzed fluorescent reaction; Chemiluminescence immunoassay

（Received 21 June 2010; accepted 15 August 2010）