消化道惡性腫瘤化療藥物相關(guān)基因檢測(cè)臨床應(yīng)用價(jià)值

姚家奎,王曉鈴,柏斗勝,孫長(zhǎng)江

(揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,江蘇揚(yáng)州,225001)

消化道惡性腫瘤是我國(guó)腫瘤患者死亡的主要原因之一,嚴(yán)重危害人民健康,其主要治療手段是外科手術(shù),但大多數(shù)患者就診時(shí)已屬中晚期,化療和放療技術(shù)的發(fā)展提高了腫瘤外科根治切除術(shù)后的療效,又為不能實(shí)施手術(shù)切除患者提供了一個(gè)新的治療途徑。目前盡管腫瘤化療取得了一些進(jìn)展,但由于在不同種族人群中,不同個(gè)體間仍有顯著的化療有效率、毒性反應(yīng)的異質(zhì)性。據(jù)有關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),目前應(yīng)用的抗腫瘤藥物對(duì)至少70%的患者療效有限,20～40%患者甚至有可能接受了錯(cuò)誤的藥物治療;據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)估計(jì),90%以上的患者死于不同程度的腫瘤細(xì)胞耐藥性,因此逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性,提高化療藥物的敏感性對(duì)癌癥的治療具有積極意義[1]。隨著藥物基因組學(xué)以及在此基礎(chǔ)上發(fā)展的蛋白組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等高通蛋白和超高通技術(shù)的出現(xiàn),使臨床醫(yī)師和分子生物學(xué)家很快就找到了共同的關(guān)注點(diǎn),即從個(gè)體基因組中分析和鑒定患者之間存在的疾病相關(guān)的個(gè)體差異,并利用這些差異來(lái)合理地篩選藥物指導(dǎo)臨床治療。本文就消化道腫瘤患者化療藥物基因組學(xué)基因型進(jìn)行了分析,以便對(duì)選擇化療藥物個(gè)性化治療進(jìn)行指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

病例選擇2007年1月～2010年10月在本院住院就診患者共35例,其中胃癌15例;腸癌6例;食道癌4例;胰腺癌6例;膽管癌2例;膽囊癌2例。男性19例,女性 16例;最大年齡 70歲,最小年齡45歲,平均59歲。所有手術(shù)后標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)檢查確診。

1.2 試劑與TaqMan等位基因檢測(cè)及分型方法

所有患者化療前抽取血液標(biāo)本2.0 mL注入EDTA抗凝管,充分混勻后待測(cè)相關(guān)基因型。應(yīng)用血液基因組DNA快速抽提純化試劑盒(Promega,USA)提取基因組DNA,基因分型采用美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(ABI)生產(chǎn)的SNP基因分型試劑盒及TaqMan PCR混合試劑盒。PCR反應(yīng) 體 系 為 25 μ L,包 括:TaqMan UniversaL PCR Master Mix(AppLied Biosystems,Foster City,CA,USA)12.5 μ L,20 ×TaqMan SNP Genotyping Assay Mix 1.25 μ L,25 μ g/mL 的基因組 DNA 2 μ L,超 純 水 9.25 μ L。 在ABI7000PCR儀擴(kuò)增:95℃10 min激活Mix里的金牌DNA擴(kuò)增酶;繼而92℃15 s變性,60℃1 min退火及延伸,共40個(gè)循環(huán)。ABI3130DNA測(cè)序儀分析SNP分型結(jié)果。為保證基因分型的準(zhǔn)確性,所有檢測(cè)標(biāo)本均由另一操作者進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn),結(jié)果與第1次完全一致。

2 結(jié) 果

基因分型及突變類(lèi)型35例消化道惡性腫瘤患者檢測(cè)結(jié)果:T/T基因型11例(11/35);G/A基因型5例(5/35);A/A基因型8例(8/35);I/V基因型3例(3/35);V/V基因型4例(4/35);R/R基因型4例(4/35)。

3 討 論

隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的完成以及對(duì)腫瘤化療藥物應(yīng)用研究的發(fā)展,人們逐漸認(rèn)識(shí)到個(gè)體基因的差異,最為常見(jiàn)的差異就是單核苷酸多態(tài)性(SNP)。發(fā)現(xiàn)一些藥物的毒副作用和這些位點(diǎn)緊密相關(guān),其主要機(jī)理是若干位點(diǎn)的變化使藥物代謝基因的活性下降,有些則直接造成該基因活性的喪失,從而使藥物代謝產(chǎn)生障礙引起一系列嚴(yán)重的化療毒副作用。因此,如果能對(duì)這些基因位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè),預(yù)測(cè)藥物是否將對(duì)病人產(chǎn)生不良作用,實(shí)現(xiàn)化療藥物的針對(duì)性、個(gè)體化用藥,就能從根本上緩解病人痛苦,提高病人在化療過(guò)程中的生存概率。所以,腫瘤治療的個(gè)性化越來(lái)越受到醫(yī)學(xué)界的重視,臨床開(kāi)展治療前基因型篩選更具有重要意義。

5-氟尿嘧啶(5-FU)是尿嘧啶的類(lèi)似物在人體內(nèi)代謝成5-氟去氧尿嘧啶(F-dump)后,與胸腺嘧啶合成酶(TS)形成穩(wěn)定化合物,抑制TS功能,由于該酶負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)的去氧單磷酸尿苷(dUMP)轉(zhuǎn)化成去氧單磷酸腺苷(dTMP),一旦它的功能被抑制,將細(xì)胞內(nèi)的唯一dTMP合成途徑被截?cái)?導(dǎo)致其含量不足,影響細(xì)胞復(fù)制DNA的合成,進(jìn)而將細(xì)胞生長(zhǎng)抑制在細(xì)胞周期中的DNA合成前期(即G1期、S期之間),以達(dá)到殺死癌細(xì)胞的目標(biāo)。通過(guò)MTHFR(C677T)多態(tài)性基因檢測(cè),預(yù)測(cè)5-FU治療的療效,T/T等位基因較其他基因型要敏感,療效好;與腫瘤化療藥物代謝相關(guān)的二氫嘧啶脫氫酶(DPD),是另一種主要參與嘧啶分解代謝的酶,DPD是常用化療藥物5-FU以及口服嘧啶類(lèi)化療藥物的代謝限速酶,其活性在人群中存在個(gè)體差異,進(jìn)入體內(nèi)的5-FU80%是經(jīng)由DPD代謝清除,在5-FU分解代謝中起關(guān)鍵作用。該酶失活影響5-FU這種藥物的分解代謝,造成治療過(guò)程中有毒藥物在體內(nèi)的積累,引起嚴(yán)重的毒副反應(yīng)。該基因突變型的癌癥患者接受5-氟尿嘧啶治療即會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的毒副作用甚至死亡。許多研究表明臨床上可以見(jiàn)到DPD酶活性部分或完全缺乏的患者接受5-FU化療后療效明顯,但出現(xiàn)嚴(yán)重毒副作用,DPD酶活性受DPD酶基因(DPYD)多態(tài)性的影響,而基因多態(tài)性>90%的表現(xiàn)形式為單核苷酸多態(tài)性(SNP)[2]。SaLgueiro等[3]的研究表明,DPYD基因14外顯子的突變與相當(dāng)部分5-FU相關(guān)嚴(yán)重毒副反應(yīng)的發(fā)生有關(guān)。為提高這類(lèi)藥物的療效同時(shí)預(yù)防和減少其毒副反應(yīng),更好地實(shí)現(xiàn)5-FU及嘧啶類(lèi)藥物的個(gè)體化治療.通過(guò)DPD＊2A多態(tài)性基因檢測(cè),預(yù)測(cè)對(duì)患者毒副作用,G/G型不增加毒副作用,G/A及A/A增加患者發(fā)生不良反應(yīng)的危險(xiǎn)性。DPYD的SNP檢測(cè)具有重要的臨床意義。據(jù)有關(guān)研究報(bào)道使用5-FU治療而發(fā)生毒性副作用的腸癌患者中約有17%～57%帶有DPD＊2A基因型,可見(jiàn)此SNP影響了DPD活性表現(xiàn),DPD活性高低直接決定了5-FU進(jìn)入合成代謝和產(chǎn)生核苷酸類(lèi)似物的量,藥代動(dòng)力學(xué)研究也顯示DPD活性缺乏可導(dǎo)致5-FU體內(nèi)清除受阻,半衰期顯著延長(zhǎng),分解減弱而合成增加,細(xì)胞毒性也相應(yīng)增強(qiáng)。因此若能在5-FU治療前先行檢測(cè)患者是否帶有DPD＊2A,將可以預(yù)測(cè)5-FU治療的副作用,若是檢測(cè)發(fā)現(xiàn)患者帶有此SNP,則可避免使用5-FU治療,若無(wú)法避免則應(yīng)于患者接受治療后密切追蹤其治療反應(yīng)。作者還通過(guò)MTHFR(C677T)多態(tài)性基因檢測(cè)了解MTX(甲氨喋呤)毒副作用,T/T等位基因較其他基因型毒副作用增加。

GSTs(谷胱甘肽轉(zhuǎn)移S酶類(lèi))為人體內(nèi)最重要的Ⅱ相代謝酶,它是一組超基因家族蛋白,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有 4種類(lèi) 型:α(GSTA)、π(GSTP)、μ(GSTM)、θ(GSTT),其主要分布于消化、呼吸道等處上皮。該酶的作用主要催化還原谷胱甘肽與許多具有遺傳毒性的復(fù)合物結(jié)合,增加水溶性,利于毒物從尿和膽汁排泄,在多數(shù)情況下是一種解毒過(guò)程;具有間接誘導(dǎo)DNA修復(fù),維持細(xì)胞基因組完整性的作用,是細(xì)胞抗損傷、抗癌變的主要解毒系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)GSTs過(guò)度表達(dá)與腫瘤耐藥相關(guān),特別是與鉑類(lèi)藥物的耐藥性關(guān)系密切[1]。GSTs基因多態(tài)性不僅與肺癌、腸癌等腫瘤遺傳易感性有關(guān),其活性變化還與惡性腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性相關(guān),導(dǎo)致GST活性下降的遺傳變異會(huì)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[4-6]。GSTP1是GST家族的主要成員,它在肝臟組織中有較高表達(dá),其基因多態(tài)已被證實(shí)可導(dǎo)致GSTP1酶活性顯著降低;當(dāng)導(dǎo)入外源性GSTP1基因或在誘導(dǎo)癌細(xì)胞耐藥過(guò)程中細(xì)胞表達(dá)GSTP1時(shí),細(xì)胞內(nèi)的化療藥物特別是鉑類(lèi)藥物的貯留量則明顯減少。所以,認(rèn)為GSTP1可能是抗藥性的標(biāo)志之一,與腫瘤細(xì)胞對(duì)抗癌藥耐受性的獲得有關(guān)。STOEHLMACHER等[7]研究結(jié)果證實(shí),GSTP1 ILe105VaL基因多態(tài)性可能與晚期結(jié)直腸癌病人對(duì)鉑類(lèi)化療藥物療效相關(guān)。通過(guò)檢測(cè)GSTM1多態(tài)性,缺失型的較其他基因型要敏感,療效好;GSTP1(I105V)基因,I/V,V/V等位基因較其他基因型要敏感,療效好。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用TaqMan-MGB探針等位基因分型技術(shù)檢測(cè)GSTP1基因I105V的多態(tài)性,分析消化道惡性腫瘤病人基因多態(tài)性與應(yīng)用鉑類(lèi)為基礎(chǔ)的藥物化療后療效的關(guān)系,可用于指導(dǎo)該類(lèi)藥物的個(gè)體化使用,提高臨床治療的針對(duì)性和可預(yù)見(jiàn)性。

XRCC1(X線交錯(cuò)互補(bǔ)修復(fù)基因1)是一種與DNA單鏈損害堿基切除修復(fù)直接相關(guān)的蛋白質(zhì),其至少包括3種常見(jiàn)的遺傳多態(tài)性,其中Arg399※GLn變異在腸癌中最為常見(jiàn),其發(fā)生與DNA損害標(biāo)志物水平上升有關(guān)。作者通過(guò)XRCC1(R399Q)多態(tài)性檢測(cè)到4例R/R等位基因。對(duì)于患者化療藥物療效,R/R等位基因較其他基因型(R/Q、Q/Q)敏感、療效好。近年來(lái)國(guó)內(nèi)相關(guān)研究顯示,胃癌患者XRCC1多態(tài)性與療效有關(guān)[8]。國(guó)外研究表明XRCC1基因的多態(tài)性可預(yù)測(cè)鉑類(lèi)化療藥物治療轉(zhuǎn)移性腸癌療效,StoehLmacher等[9]研究了61例接受奧沙利鉑聯(lián)合5-FU治療的轉(zhuǎn)移性腸癌患者XRCC1基因密碼子399多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。研究發(fā)現(xiàn)了位于10號(hào)外顯子的R399Q的多態(tài)性,在11例有效的病例中,有8例(73%)是RR基因型,3例(27%)是雜合子(RQ);在 10例進(jìn)展的病例中,3例(30%)是QQ變異基因型而5例(50%)是雜合子;穩(wěn)定的病例中,15例(38%)是R等位基因的純合子,23例(58%)是雜合子,2例(4%)是Q等位基因的純合子。

總之,由于藥物在體內(nèi)敏感性影響因素復(fù)雜,目前腫瘤患者化療藥物基因型測(cè)定研究的真正目的可能不在于篩選哪些藥物在體內(nèi)應(yīng)用時(shí)更為敏感,而在于篩選體內(nèi)應(yīng)用時(shí)可能不敏感的藥物,以避免盲目化療可能導(dǎo)致的毒性反應(yīng)。所以化療前及化療過(guò)程中動(dòng)態(tài)檢測(cè)藥物敏感性和抗藥性,是實(shí)現(xiàn)化療個(gè)體化和提高療效的重要基礎(chǔ),合理選擇化療藥物,可有效延長(zhǎng)癌癥患者生存期和避免患者不必要的身體和經(jīng)濟(jì)上的負(fù)擔(dān)。

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