Alpha-亞麻酸對(duì)HepG2細(xì)胞脂肪酸合成關(guān)鍵基因的影響

李 微，張 濤，解現(xiàn)星，孟 威，劉慧芳，肖霖力，李春風(fēng)，劉 源

(1.中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京 100071；2. 吉林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，長春 130062；3. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 青島 266109；4. 北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)院，北京 102206)

隨著社會(huì)的發(fā)展、人們生活水平的提高和生活方式的改變，熱量攝入增加、體力活動(dòng)減少及肥胖不斷流行，脂代謝紊亂發(fā)生率逐年攀升。流行病學(xué)調(diào)查資料顯示我國目前有高血壓患者1.6～2億。脂代謝紊亂已成為重大衛(wèi)生問題，引起了世界各國的廣泛關(guān)注。長期飽和脂肪酸飲食是脂代謝紊亂發(fā)生的重要原因之一，飽和脂肪酸攝入量過高可導(dǎo)致血清中膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇升高，繼而引發(fā)脂肪肝、動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病等疾病。

研究表明飽和脂肪酸抑制SREBP1活性，從而抑制脂肪酸的合成[1]，SREBP1C是固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白家族成員，屬核轉(zhuǎn)錄因子，是脂肪酸合成關(guān)鍵調(diào)控基因之一，前體SREBP經(jīng)過剪切成為成熟SREBP[2]，核內(nèi)SREBP的穩(wěn)定性受泛素化[3]、磷酸化和乙?；恼{(diào)節(jié)[4]。成熟型SREBP1C調(diào)節(jié)ACC及FAS表達(dá)，乙酰輔酶A羧化酶(ACC) 催化乙酰輔酶A生成丙二酰輔酶A，是脂肪酸合成限速酶，脂肪酸合成酶(FAS)是脂肪酸合成的主要限制酶，催化丙二酰輔酶A生成軟脂酰輔酶A的全部過程。大量研究表明多不飽和脂肪酸(PUFA)不僅是細(xì)胞的能量來源及組成成分，同時(shí)也是重要的調(diào)節(jié)物質(zhì)，調(diào)控營養(yǎng)代謝疾病(如糖尿病、冠心病等)的發(fā)展過程[5]，臨床試驗(yàn)證明高甘油三酯血癥患者(≥500 mg/dl)每天服用n-3PUFA約4 g能夠使血清甘油三酯水平降低45%[6]。ALA為由食物提供的植物來源n-3PUFA，主要存在于植物的種子、果實(shí)及其油脂中，在體內(nèi)可經(jīng)生物化學(xué)途徑合成EPA和DHA。ALA可降血脂但不引起肝臟積累脂質(zhì)，對(duì)脂代謝紊亂引起的疾病有重要預(yù)防和治療意義。本研究旨在探討不同劑量ALA對(duì)飽和脂肪酸處理后的肝細(xì)胞脂肪酸合成的影響，對(duì)闡明ALA在脂肪酸合成及脂肪肝形成的作用有重要意義。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及分組

人肝癌母細(xì)胞HepG2細(xì)胞由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物所細(xì)胞庫贈(zèng)予。細(xì)胞分組：不加替代物的對(duì)照組(NC)，加含0.5 mmol/L硬脂酸的培養(yǎng)液培養(yǎng)的高脂組(HF)，和以ALA代替硬脂酸，代替比例分別為10%、20%、50%、70%、100%的ALA替代組。

1.2 儀器及試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco,USA)；胎牛血清(Hyclone,USA)；硬脂酸、ALA(sigma aldrich,USA)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa DRR037A，Japan)；BIO-RAD IQ5 real-time PCR儀；蛋白酶抑制劑(Roche, Switzerland)；小鼠抗人β-actin(abcam, UK)、兔抗人SREBP1c(abcam, UK)、小鼠抗人FAS抗體(abcam, UK)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體(中衫金橋,China)、山羊抗兔抗體(中衫金橋,China)；Western blotting發(fā)光檢測試劑盒(英格恩,China)；蛋白質(zhì)預(yù)染 marker(Fermentas)；X光膠片、顯影液、定影液(Kodak,USA)。

1.3 細(xì)胞處理方法

HepG2 細(xì)胞、培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)生長期HepG2細(xì)胞，以0.25%胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，并接種于10 cm培養(yǎng)皿中，5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后加入含0.5 mmol/L硬脂酸的培養(yǎng)液培養(yǎng)36 h，收集細(xì)胞用于基因表達(dá)檢測。之后加入不同替代濃度ALA代替硬脂酸培養(yǎng)36 h后收集細(xì)胞用于基因和蛋白表達(dá)檢測。

1.4 測定指標(biāo)

1.4.1 實(shí)時(shí)定量PCR：每皿細(xì)胞加入1 mL Trizol后用細(xì)胞鏟鏟下細(xì)胞，收集于2 mL離心管，室溫放置10 min，充分裂解后按照Trizol操作說明步驟提取細(xì)胞總RNA。反轉(zhuǎn)錄體系為20 μL，每管加入總RNA 1 μg，按照TaKaRa DRR037A反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作，37℃反應(yīng)30 min，85℃ 5 s。反轉(zhuǎn)錄后的cDNA用于實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，引物由北京博邁德公司合成，其中SREBP1C上游引物：5′-GTGGCGGCTGC ATTGAGAGTGAAG-3′，下游引物：5′-AGGTACC CGAGGGCATCCGAGAAT-3′，產(chǎn)物長度：362 bp，退火溫度：66℃；FAS上游引物：5′-CAAGAACTGCA CGGAGGTGT-3′，下游引物：5′-AGCTGCCAGAG TCGGAGAAC-3′，產(chǎn)物長度：569 bp，退火溫度：60℃；ACC上游引物：5′-GCTGCTCGGATCACTA GTGAA-3′，下游引物：5′-TTCTGCTATCAGTCTGT CCAG-3′，產(chǎn)物長度：339 bp，退火溫度：56℃；β-actin上游引物：5′-TTCTGCTATCAGTCTGTCCAG-3′，下游引物：5′-TTAGTTGCGTTACACCCTTTC-3′，產(chǎn)物長度：156 bp，退火溫度：56℃。反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×) 12.5 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL(10 pmol)，加入dH2O至25 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性30 s，各退火溫度退火30 s，72℃延伸1 min；然后72℃反應(yīng)10 min，95℃作用30 s，60℃作用1 min；60℃作用20 s，該步進(jìn)行70個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，同時(shí)空白對(duì)照及5倍梯度稀釋進(jìn)行反應(yīng)。引物擴(kuò)增效率分別為107.6%(SREBP1C)，122.7%(FAS)，98.7%(ACC)，106.2%(β-actin、56℃)，99.4%(β-actin、66℃)，104.1%(β-actin、60℃)。

1.4.2 Western Blotting檢測：分別提取各組細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行10% SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5% 脫脂奶粉封閉，分別用β-actin、SREBP1C，F(xiàn)AS，ACC抗體檢測蛋白表達(dá)。其中β-actin作為內(nèi)參。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SAS 9.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)照組與高脂組應(yīng)用成組設(shè)計(jì)T檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)，高脂組與ALA處理組間差異采用單因素多水平方差分析。

2 結(jié)果

2.1 基因表達(dá)

2.1.1 硬脂酸培養(yǎng)細(xì)胞基因表達(dá)

與對(duì)照組相比，高脂組SREBP1C、FAS、ACC均出現(xiàn)顯著升高(P< 0.001)(表1)。

表1 HepG2細(xì)胞脂肪酸合成基因相對(duì)表達(dá)量

2.1.2 ALA替代基因表達(dá)

ALA替代各組SREBP1C表達(dá)均顯著低于高脂組(P< 0.001)，且呈現(xiàn)濃度依賴性，即ALA替代比例越高對(duì)SREBP1C表達(dá)抑制作用越強(qiáng)；0.5 mmol/LALA組及0.35 mmol/L組FAS表達(dá)顯著低于高脂組(P< 0.001)，其余各組均低于高脂組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；0.1 mmol/L ALA替代ACC基因表達(dá)略增強(qiáng)，其余各組呈現(xiàn)抑制趨勢，但ACC表達(dá)則無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖1)。

圖1 ALA替代培養(yǎng)HepG2細(xì)胞SREBP1C、FAS及ACC基因表達(dá)

2.2 蛋白表達(dá)

ALA替代各組脂肪酸合成基因SREBP1C、FAS蛋白表達(dá)降低，且呈現(xiàn)濃度依賴作用，即隨著替代比例上升，蛋白表達(dá)抑制作用也上升；而ACC則無明顯差異。

圖2 ALA替代培養(yǎng)HepG2細(xì)胞SREBP1C、FAS及ACC蛋白表達(dá)

3 討論

飽和脂肪酸可導(dǎo)致脂質(zhì)代謝相關(guān)基因異常，并一定程度上損害肝細(xì)胞，研究顯示飽和脂肪酸可通過激活Caspase-3和Caspase-9引起L02細(xì)胞凋亡[7]。飽和脂肪酸影響肝細(xì)胞脂肪沉積，肝細(xì)胞中脂肪沉淀過多可能導(dǎo)致脂肪肝。研究表明飽和脂肪酸可通過抑制AMPKa-2 mRNA表達(dá)，調(diào)整HL mRNA的表達(dá)來抑制HepG2細(xì)胞內(nèi)肝脂肪酶HL活性，減少肝細(xì)胞脂肪分解作用，使脂肪在HepG2細(xì)胞內(nèi)堆積[8]。本實(shí)驗(yàn)中硬脂酸處理HepG2細(xì)胞后FAS、ACC及SREBP1C基因mRNA水平升高顯著，可見硬脂酸促進(jìn)HepG2細(xì)胞脂肪酸合成基因表達(dá)，促使HepG2細(xì)胞脂肪酸合成增加，而脂肪酸合成增加可加重肝細(xì)胞脂肪沉積，進(jìn)而形成脂肪肝。

Mater, M. K等[8]研究表明PUFA能夠降低肝臟SREBP1C基因mRNA水平，同時(shí)可抑制SREBP1C蛋白表達(dá)。Fukumitsu.S等[9]利用ALA干預(yù)3T3-L1脂肪細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，300 μmol/L ALA干預(yù)后SREBP1C及FASmRNA表達(dá)顯著降低，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合，本實(shí)驗(yàn)中ALA各組SREBP1C表達(dá)均顯著低于飽和脂肪酸組(P< 0.001)，蛋白表達(dá)表現(xiàn)出相同的濃度敏感性，可見ALA可以緩解由飽和脂肪酸導(dǎo)致的脂肪酸合成基因SREBP1C表達(dá)上調(diào)，且SREBP1C對(duì)ALA替代存在濃度依賴。SREBP1是固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白家族成員，屬核轉(zhuǎn)錄因子，Yahagi.N等[10]通過過表達(dá)SREBP1基因小鼠與野生型小鼠進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，飼喂不飽和脂肪酸能夠使野生型小鼠成熟型SREBP1減少，而前體未見減少，F(xiàn)AS、ACC表達(dá)降低，但轉(zhuǎn)基因小鼠則無此反應(yīng)，該現(xiàn)象證實(shí)成熟型SREBP1調(diào)控著FAS、ACC的表達(dá)。

脂肪酸合成酶(FAS)是脂肪酸合成限制酶，催化棕櫚酸酯從頭合成的所有步驟[11]。0.5 mmol/L ALA組、0.35 mmol/L ALA組FAS表達(dá)顯著低于飽和脂肪酸組(P< 0.001)，各濃度ALA組蛋白表達(dá)呈現(xiàn)濃度依賴性降低，這說明ALA可緩解由飽和脂肪酸導(dǎo)致的FAS升高，替代濃度越高緩解作用越明顯。另有研究表明ALA 能夠使高脂飲食或者添加肝臟X受體LXR激動(dòng)劑的大鼠肝臟脂肪沉積減輕，并抑制SREBP1C表達(dá)[12]，SREBP1C能夠被LXR調(diào)節(jié)，二者均能夠調(diào)節(jié)FAS表達(dá)[13]，故ALA可緩解飽和脂肪酸促進(jìn)作用，能夠通過不同途徑抑制SREBP1C及FAS表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)中HepG2細(xì)胞ALA各濃度組結(jié)果顯示ACC基因和蛋白表達(dá)表達(dá)均無明顯差異，即ALA對(duì)于緩解由硬脂酸導(dǎo)致的ACC基因表達(dá)增強(qiáng)作用不明顯。Shen.Q.W等[14]用ALA處理 C2C12細(xì)胞發(fā)現(xiàn)ALA可通過促進(jìn)AMPKα磷酸化間接激活A(yù)CC，使后者表達(dá)加強(qiáng)，與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果不同可能與選取的細(xì)胞類型及處理方式有關(guān)。

綜上，硬脂酸處理后HepG2細(xì)胞脂肪酸合成關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)增強(qiáng)，隨著ALA替代硬脂酸濃度升高，ALA對(duì)脂肪酸合成關(guān)鍵基因SREBP1C及FAS表達(dá)的抑制作用增強(qiáng)，ALA能夠緩解硬脂酸的表達(dá)促進(jìn)作用，但ACC表達(dá)無明顯差異。

參考文獻(xiàn)：

[1] You M, Cao Q, Liang X,etal. Mammalian sirtuin 1 is involved in the protective action of dietary saturated fat against alcoholic fatty liver in mice[J]. Nutr, 2008, 138(3): 497-501.

[2] 卓偉華,王繼文,蔣立.固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白在動(dòng)物脂肪代謝中的研究進(jìn)展[J]. 中國畜牧雜志, 2005, 2: 41-43.

[3] Liu TF, Tang JJ, Li PS,etalAblation of gp78 in liver improves hyperlipidemia and insulin resistance by inhibiting SREBP to decrease lipid biosynthesis[J]. Cell Metab, 2012, 16(2): 213-225.

[4] 趙小平,楊法軍. SREBP介導(dǎo)的基因表達(dá)的調(diào)控(英文)[J]. 生物物理學(xué)報(bào), 2012, 4: 287-294.

[5] Clarke SD, Baillie R, Jump DB,etal. Fatty acid regulation of gene expression. Its role in fuel partitioning and insulin resistance[J]. Ann N Y Acad Sci, 1997, 827: 178-187

[6] Samuel S, Peskin B, Arondekar B,etal. Estimating health and economic benefits from using prescription omega-3 fatty acids in patients with severe hypertriglyceridemia[J]. Am J Cardiol, 2011, 108(5): 691-697

[7] 龔受基，劉仲華，黃建安,等.軟脂酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞糖脂代謝紊亂及機(jī)制研究[J]. 中國藥理學(xué)通報(bào), 2011, 10: 1383-1387.

[8] Mater MK, Thelen AP, Pan DA,etal. Sterol response element-binding protein 1c (SREBP1c) is involved in the polyunsaturated fatty acid suppression of hepatic S14 gene transcription[J]. J Biol Chem, 1999, 274(46): 32725-32732.

[9] Fukumitsu S, Villareal MO, Onaga S,etal. alpha-Linolenic acid suppresses cholesterol and triacylglycerol biosynthesis pathway by suppressing SREBP-2, SREBP-1a and -1c expression[J]. Cytotechnology, 2013, 65(6): 899-907.

[10] Yahagi N, Shimano H, Hasty AH,etal. A crucial role of sterol regulatory element-binding protein-1 in the regulation of lipogenic

gene expression by polyunsaturated fatty acids[J]. J Biol Chem, 1999, 274(50): 35840-35844.

[11] 周國利,金海國. 脂肪酸合成酶基因(FASN)的研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 9: 3559-3560+3578.

[12] Park KG, Min AK, Koh EH,etal. Alpha-lipoic acid decreases hepatic lipogenesis through adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK)-dependent and AMPK-independent pathways[J]. Hepatology, 2008, 48(5): 1477-1486.

[13] 王冰. 肝X受體上調(diào)肝臟和腎臟脂肪酸合成酶的表達(dá)及機(jī)制[D], 2007, 大連醫(yī)科大學(xué).

[14] Shen QW, Zhu MJ, Tong J,etal. Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase kinase is involved in AMP-activated protein kinase activation by alpha-lipoic acid in C2C12 myotubes[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2007, 293(4): C1395-C1403.