電針對(duì)非酒精性脂肪性肝炎大鼠血清及肝組織SOD和MDA的影響

程井軍(湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸基礎(chǔ)教研室，湖北 武漢430061）

李德順(湖北中醫(yī)藥大學(xué)方劑學(xué)教研室，湖北 武漢430061）

馬 駿，沈 峰(湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)教研室，湖北 武漢430061）

齊鳳軍(湖北中醫(yī)藥大學(xué)推拿學(xué)教研室，湖北 武漢430061）

孫國(guó)杰(湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)教研室，湖北 武漢430061）

非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic Steatohepatitis，NASH）與肥胖、高脂血癥和糖尿病高度相關(guān)[1]，但其發(fā)病機(jī)制不明。我們應(yīng)用電針刺激SD大鼠肝俞、足三里、豐隆、太沖，觀察電針對(duì)高脂飲食所致的非酒精性脂肪性肝炎(NASH）大鼠血清及肝組織超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD）和丙二醛(malondialdehyde，MDA）的影響，為臨床治療非酒精性脂肪性肝炎提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

SPF級(jí)雄性SD大鼠(南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，批號(hào)2004A068）40只，體質(zhì)量(190±20）g；上海產(chǎn)G-6805針灸治療儀；熊去氧膽酸片(UDCA，成都市湔江制藥廠）；血清超氧化物歧化酶和丙二醛試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1．2 方法

1．2．1 動(dòng)物分組與模型建立 選用SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，采用清潔級(jí)架式分籠飼養(yǎng)。所有大鼠均正常喂養(yǎng)1周，再隨機(jī)分為4組。正常對(duì)照組10只，普通飼料喂養(yǎng)；模型組10只，電針組10只，藥物組10只，均采用高脂飼料喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)依據(jù)范建高經(jīng)典造模方法[2]，自由攝食和飲水，飼料和水每日更換1次。針刺組取穴參照全國(guó)協(xié)編 《動(dòng)物實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》標(biāo)準(zhǔn)穴位圖譜定肝俞、足三里、豐隆、太沖，電針治療，選用0．5寸長(zhǎng)毫針(1cm）電針穴位，上海產(chǎn)G-6805針灸治療儀(疏密波8～80Hz，疏密波轉(zhuǎn)換14次／min，電壓1．5V，強(qiáng)度1mA）通電治療20min，自第12周開(kāi)始每天治療1次，連續(xù)6d后休息1d，共治療4周。藥物組自第12周開(kāi)始每天以西藥UDCA 250mg／（kg·d）的水溶液為唯一飲料，繼前高脂食物喂養(yǎng)共4周。正常組和模型對(duì)照組不進(jìn)行電針和藥物治療，喂養(yǎng)共16周。各組在16周后隔夜空腹以2%戊巴比妥鈉麻醉，經(jīng)下腔靜脈采血，并頸椎脫臼處死動(dòng)物，摘取肝臟。

1．2．2 觀察項(xiàng)目與測(cè)定方法

1）一般情況。觀察動(dòng)物體質(zhì)量(分別于實(shí)驗(yàn)前至第16周末用電子秤稱量各組大鼠的體質(zhì)量）、食欲、行為、狀態(tài)、毛發(fā)及死亡情況，計(jì)算肝指數(shù)(肝臟濕質(zhì)量／體質(zhì)量×100%）。

2）血清ALT、AST測(cè)定。檢測(cè)血清ALT、AST采用Olympus Au560全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。

3）血清SOD、MDA含量測(cè)定。分別采用鄰苯三酚自氧化抑制法、硫代巴比妥熒光法測(cè)定血清SOD、MDA含量。

4）肝組織SOD、MDA含量測(cè)定。按試劑盒操作說(shuō)明用生物化學(xué)法分別測(cè)定SOD、MDA含量。

5）肝組織病理變化觀察。將肝組織用4℃生理鹽水沖洗，在肝臟最大葉距邊緣5mm處取小塊肝組織，中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察肝組織普通病理變化。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS11．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，兩樣本均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 各組大鼠一般情況變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)模型組和西藥組分別有2只和1只動(dòng)物因相互撕咬而死亡，模型組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)最迅速，食欲好，且動(dòng)物性情較溫順，活動(dòng)減少；第13～16周，電針組體質(zhì)量增加明顯減慢。體質(zhì)量及肝指數(shù)模型組比正常組顯著增高(P＜0．01）；模型組比電針組顯著增高(P＜0．01）；西藥組較之電針組增高(P＜0．05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、肝指數(shù)的變化

2．2 各組大鼠肝功能比較

模型組比正常組顯著增高(P＜0．01）；模型組比電針組顯著增高(P＜0．01）；電針組較之西藥組有下降趨勢(shì)，但兩者比較無(wú)明顯差異(P＞0．05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠肝功能比較

2．3 各組大鼠血清SOD活性、MDA含量的變化

模型組血清MDA顯著高于正常組(P＜0．05），SOD活性顯著低于正常組(P＜0．05）；電針組與模型組比較，MDA含量顯著降低(P＜0．05），而SOD活性明顯升高(P＜0．05）；電針組與藥物組比較，MDA含量有下降趨勢(shì)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0．05）；而SOD活性有下降趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）。見(jiàn)表3。

2．4 各組大鼠肝勻漿SOD活性、MDA含量的變化

模型組肝組織MDA顯著高于正常組(P＜0．05），SOD活性顯著低于正常組(P＜0．05）；電針組與模型組比較，MDA含量顯著降低(P＜0．05），而SOD活性明顯升高(P＜0．05）；電針組與藥物組比較，MDA含量有下降趨勢(shì)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0．05）；而SOD活性亦有下降趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0．05）。見(jiàn)表4。

表3 各組大鼠16周時(shí)血清MDA含量、SOD活性比較

表4 各組大鼠16周時(shí)肝組織MDA含量、SOD活性比較

2．5 各組大鼠肝臟組織病理學(xué)檢查

2．5．1 肝臟外觀形態(tài)觀察 正常組肝臟外觀呈鮮紅色，質(zhì)地軟而富有彈性；模型組肝臟體積呈均勻性增大，邊緣銳利，表面光滑，質(zhì)軟。表面及切面呈黃紅色，有油膩感。電針組及西藥組肉眼觀察差別不明顯，色澤較暗，質(zhì)地、彈性均介于模型組和正常組之間。

2．5．2 光鏡下肝臟病理學(xué)改變 正常組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)排列正常，肝小葉清晰規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)均勻，偶見(jiàn)小泡性脂肪滴空泡；模型組所有大鼠均出現(xiàn)程度不等的彌漫性肝細(xì)胞濁腫、脂肪變性，脂變肝細(xì)胞體積增大，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)數(shù)量不等、大小不一的脂肪空泡，胞核被推向周邊；肝組織均存在小葉內(nèi)炎癥，大部分組織可見(jiàn)匯管區(qū)炎癥，且出現(xiàn)肝細(xì)胞點(diǎn)、片狀壞死(見(jiàn)圖1）。電針組肝組織脂肪變程度明顯減輕，肝細(xì)胞形態(tài)趨于正常(見(jiàn)圖2）。西藥組病理學(xué)改變介于模型組和電針組之間。

圖1 模型組大鼠肝細(xì)胞光鏡下形態(tài)(HE，×400）

圖2 電針組大鼠肝細(xì)胞光鏡下形態(tài)(HE，×100）

3 討 論

由單純的脂肪肝發(fā)展至NASH，氧化應(yīng)激或肝中氧化抗氧化平衡失調(diào)，可能是其重要機(jī)制。線粒體是氧化應(yīng)激和活性氧簇(ROS）產(chǎn)生的最大來(lái)源[3-4]。肝內(nèi)過(guò)多的FFA，特別是多不飽和脂肪酸，可損害細(xì)胞生物膜及線粒體呼吸鏈，使線粒體的改變和呼吸鏈功能不全，從而使脂肪酸β氧化及肝氧化增加，不平衡的氧化磷酸化導(dǎo)致自由基形成[5]；氧化應(yīng)激還與FFA誘導(dǎo)CYPⅡE1和CYP4A表達(dá)增強(qiáng)相關(guān)。臨床和實(shí)驗(yàn)表明，CYPⅡE1在脂肪性肝病中表達(dá)增強(qiáng)[6]。CYPⅡE1具有很強(qiáng)的氧化活性，是ROS的重要來(lái)源。高表達(dá)的CYPⅡE1在氧化基質(zhì)的同時(shí)，釋放大量的ROS和自由基。過(guò)多的ROS和自由基耗竭谷胱甘肽、超氧化物歧化酶等抗氧化因子，使促氧化物與抗氧化物之間的動(dòng)態(tài)平衡失調(diào)，即出現(xiàn)氧化應(yīng)激狀態(tài)。

氧化應(yīng)激通過(guò)多種途徑促成肝損害：進(jìn)一步影響呼吸鏈[7-8]，直接或間接氧化損害線粒體基因組，導(dǎo)致更多的ROS產(chǎn)生，如此惡性循環(huán)；降低肝谷胱甘肽水平，增加解偶聯(lián)蛋白-2（UCP-2）的表達(dá)，導(dǎo)致ATP耗竭，降低肝細(xì)胞的應(yīng)激能力[9]；使脂質(zhì)過(guò)氧化，產(chǎn)生大量具有反應(yīng)活性和細(xì)胞毒性的中間產(chǎn)物，導(dǎo)致細(xì)胞死亡、壞死，并通過(guò)細(xì)胞損傷產(chǎn)生炎癥反應(yīng)或吸引炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)肝實(shí)質(zhì)[10]。此外，脂質(zhì)過(guò)氧化還釋放MDA和4-羥基己酸，能刺激Ito細(xì)胞核合成膠原，導(dǎo)致纖維化。4-羥基己酸能趨化中性粒細(xì)胞，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，MDA能使包括細(xì)胞骨架蛋白在內(nèi)的蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)，形成Mallory小體[11]；提高幾種CKs（TNF-alpha，TGF-beta）的表達(dá)，在細(xì)胞死亡、炎癥反應(yīng)和纖維化中發(fā)揮關(guān)鍵作用[12-13]。

針灸對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化有重要影響。倫新等[13]取足三里、關(guān)元穴，對(duì)老年人實(shí)行隔姜灸，結(jié)果體內(nèi)血SOD活性明顯升高?？琢⒓t等[14]取單側(cè)肺俞、脾俞、腎俞穴，對(duì)糖尿病大鼠進(jìn)行針灸，結(jié)果能明顯提高大鼠血清SOD的活性。趙立榮等[15]取內(nèi)關(guān)、太沖，可提高小鼠腦組織CAT活性。另外，孫忠人等[16]研究發(fā)現(xiàn)，針刺足三里穴能顯著降低老齡小鼠血清和肝組織中MDA水平。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)：模型組肝組織MDA顯著高于正常組(P＜0．05），SOD活性顯著低于正常組(P＜0．05）；電針組與模型組比較，MDA含量顯著降低(P＜0．05），而SOD活性明顯升高(P＜0．05）；電針組與藥物組比較，MDA含量有下降趨勢(shì)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0．05）；而SOD活性有下降趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0．05）。結(jié)果提示，電針能夠提高肝組織抗氧化能力，減輕脂質(zhì)過(guò)氧化，可能是其防治NASH的主要機(jī)制之一。

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