骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療椎間盤退變的研究進(jìn)展

李梓瑞，徐宏光

(皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院脊柱外科 安徽蕪湖 241001)

骨髓中除含有造血干細(xì)胞外，還含有另一類由中胚層發(fā)育的早期細(xì)胞［1］，稱之為間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)。造血干細(xì)胞是血細(xì)胞和破骨細(xì)胞的起源，而間充質(zhì)干細(xì)胞是成骨細(xì)胞的起源，間充質(zhì)干細(xì)胞具有強(qiáng)大的增殖能力及多向分化潛能，MSCS主要存在于結(jié)締組織和器官基質(zhì)中，以骨髓中含量最多。在不同的誘導(dǎo)條件下，可以向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分化的能力［2］。

1 BMSC的發(fā)現(xiàn)及特點

140年前德國的Cohnheim就提出骨髓內(nèi)存在有非造血系統(tǒng)的干細(xì)胞，并首次提出了這些干細(xì)胞參與組織損傷修復(fù)的假設(shè)［1］，他在損傷修復(fù)的實驗中用一種可溶性的染料analine注入動物的靜脈，經(jīng)過一段時間，就能夠在傷口的周圍找到一些被染色的細(xì)胞，這些細(xì)胞不僅含有炎性細(xì)胞，也包括一些纖維細(xì)胞樣的細(xì)胞。1976年，F(xiàn)riedenstein［3］發(fā)現(xiàn)了一類易于粘附于塑料培養(yǎng)板表面的細(xì)胞，并以充分的證據(jù)證明了這些細(xì)胞在體內(nèi)處于睡眠狀態(tài)。而在體外，在一定條件的刺激下，可以誘導(dǎo)生成類似于軟骨碎片的細(xì)胞集落，1984年Owen［4］首先將這種貼壁生長的細(xì)胞，定義為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。MSCs是呈成纖維樣形態(tài)，貼壁成長為三角形和梭形。細(xì)胞間呈漩渦狀排列，是間充質(zhì)干細(xì)胞特有的排列方式，電鏡下可見細(xì)胞核大，呈圓形，染色質(zhì)豐富，核漿多，細(xì)胞器較少。

2 椎間盤退變機(jī)制

椎間盤由髓核、纖維環(huán)和軟骨終板構(gòu)成。椎間盤細(xì)胞包括脊索細(xì)胞、類軟骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。椎間盤退變所引發(fā)的腰腿痛是臨床的常見病，是以軟骨終板、髓核、纖維環(huán)的組成成分的改變?yōu)榛A(chǔ)，導(dǎo)致其力學(xué)性能的降低。主要病理改變?yōu)樗韬思?xì)胞減少，使髓核組織中Ⅱ型膠原和蛋白多糖含量也減少。目前，椎間盤退變的確切機(jī)制仍未完全清楚，An等［5］認(rèn)為，生物學(xué)和生物力學(xué)是引起椎間盤退變的首要因素，其次是細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)化生長因子、基質(zhì)降解酶等通過旁分泌或自分泌的形式調(diào)控椎間盤的細(xì)胞活性，導(dǎo)致基質(zhì)的合成和分解完全失衡，也就是合成Ⅱ型膠原和蛋白多糖減少，不能滿足椎間盤細(xì)胞的需要，從而引起椎間盤退變。

3 椎間盤退變的治療

目前椎間盤退變的治療方法主要有手術(shù)治療、細(xì)胞移植治療、組織工程學(xué)治療等。

3.1 手術(shù)治療 現(xiàn)在臨床上椎間盤退變大多數(shù)采取手術(shù)治療，手術(shù)治療雖然能夠有效的緩解臨床癥狀，但還是不能從根本上修復(fù)退變的椎間盤，反而可能會因為手術(shù)創(chuàng)傷，使椎間盤結(jié)構(gòu)遭到進(jìn)一步的破壞，癥狀加重，使病人更加痛苦。

3.2 細(xì)胞移植治療 細(xì)胞移植治療是將自體的椎間盤細(xì)胞再移植到退化的椎間盤，延緩椎間盤的進(jìn)一步退化。Gruber［6］研究證明將自體髓核細(xì)胞植入能有效的緩解椎間盤退變，但是自體來源的椎間盤細(xì)胞非常有限，無法滿足自體椎間盤細(xì)胞再植入的要求。

3.3 組織工程學(xué)治療 組織工程學(xué)治療就是利用MSCs具有多向分化潛能的特點，在體外培養(yǎng)擴(kuò)增，并在一定的環(huán)境和因素的誘導(dǎo)下，使其分化成類髓核細(xì)胞，同時骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞還可以為髓核細(xì)胞提供一個適宜的外環(huán)境，營養(yǎng)髓核細(xì)胞，使軟骨基因改變和繼續(xù)保持其分化增殖［7］，使軟骨修復(fù)成為可能。BMSCs獲取較方便，且能夠在體外培養(yǎng)迅速增殖，連續(xù)傳代而保持分化潛能不變，是組織工程中理想的種子細(xì)胞。Sakai等［8，9］在動物體內(nèi)就骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞如何修復(fù)椎間盤的退化進(jìn)行試驗，結(jié)果顯示，移植過BMSCs的椎間盤內(nèi)，其蛋白多糖的含量明顯恢復(fù)，且細(xì)胞外基質(zhì)的基因高度表達(dá)，分化的BMSCs也表現(xiàn)出髓核細(xì)胞的表型。Risbud等［10］研究也證明，在適宜的環(huán)境條件下，BMSCs能分化成髓核細(xì)胞，并且合成蛋白多糖和Ⅱ型膠原，從而達(dá)到修復(fù)軟骨，延緩椎間盤進(jìn)一步退變的目的。因此可以認(rèn)為間充質(zhì)干細(xì)胞是組織工程研究的主要細(xì)胞來源，利用MSCs分化功能的組織工程學(xué)治療目前漸漸成為治療椎間盤退變的重要手段。

4 BMSCs分化的影響因素

4.1 低氧環(huán)境對 BMSCs的影響 Risbud等［10］在對BMSCs向髓核細(xì)胞分化的實驗中，模擬了椎間盤的低氧環(huán)境，結(jié)果表明在低氧的環(huán)境下，分化后的干細(xì)胞在基因水平和蛋白水平都表達(dá)了髓核細(xì)胞外基質(zhì)，如蛋白多糖和Ⅱ型膠原。

4.2 支架材料對BMSCs的影響 較理想的支架材料應(yīng)該與椎間盤基質(zhì)成分類似，能夠體現(xiàn)體內(nèi)椎間盤三維環(huán)境，具有生物降解性，生物相容性和力學(xué)特性等特點。目前研究最多的是多聚左旋乳酸支架，Richardson等［11］在多聚左旋乳酸支架上用腺病毒(Ad)－sox－9基因來誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，結(jié)果表明BMSC分化后有蛋白多糖和Ⅱ型膠原的表達(dá)，證明了人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在多聚左旋乳酸支架上可以向髓核細(xì)胞方向分化。劉建華等［12］也通過實驗證明了左旋乳酸共聚物支架可作為軟骨組織工程支架。當(dāng)然，不同的支架材料，所起到的作用也有所不同，有的促進(jìn)BMSCs增殖，有的使BMSCs向類軟骨細(xì)胞分化，這給BMSCs的分化提供了很好的指導(dǎo)方向。

4.3 細(xì)胞生長因子對BMSCs的影響 軟骨組織中含有多種生長因子，他們通過自分泌或旁分泌的方式，在軟骨分化中起到非常重要的作用。在體外培養(yǎng)中使BMSCs向髓核細(xì)胞增殖分化［13］，其中包括 TGF－β(細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子)，BMP(骨形態(tài)發(fā)生蛋白)，IGF(胰島素樣生長因子)等。TGF－β是一族廣泛存在、具有多種功能的多肽類生長因子，在人體中已發(fā)現(xiàn)了5種類型的 TGF－β，即 TGF －β1、TGF－ β2 、TGF－β3、TGF－β4、TGF－β5。TGF－β能使軟骨細(xì)胞合成蛋白多糖增加，而且還能維持基質(zhì)中蛋白多糖的濃度。Dounchis等［14］研究還證明了TGF－β能刺激BMSCs增殖分化成軟骨細(xì)胞，并表達(dá)Ⅱ型膠原。骨形態(tài)發(fā)生蛋白主要是通過TGF－β/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)BMSC向成骨細(xì)胞增殖分化［15］。胰島素樣生長因子是一種很強(qiáng)的合成代謝刺激因子，不僅促進(jìn)BMSC向軟骨細(xì)胞分化，還能夠抑制因為TGF－β引起的細(xì)胞外焦磷酸鹽的過多聚集，防止形成焦磷酸鹽結(jié)晶［16］?？偟膩碚f，如果單獨應(yīng)用BMP、IGF、FGF等，并不能誘導(dǎo)BMSC向軟骨細(xì)胞分化，它們主要是輔助TGF－β來發(fā)揮作用，與TGF－β之間具有協(xié)同作用。TGF－β仍然是最強(qiáng)的細(xì)胞促生長因子，并且Indrawattana等［17］研究證明TGF－β3是誘導(dǎo)BMSC分化為軟骨細(xì)胞最主要生長因子。

4.4 信號傳導(dǎo)調(diào)控對BMSCs的影響 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化和增殖是需要通過一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來實現(xiàn)。目前研究較多的是轉(zhuǎn)化生長因子/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，它由轉(zhuǎn)化生長因子，具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的轉(zhuǎn)化生長因子受體及受體底物Smad蛋白組成，絲裂原活化蛋白激酶介導(dǎo)的通路是誘導(dǎo)BMSC分化增殖成成骨的主要途徑。Wnt信號通路是當(dāng)前骨代謝研究的新方向［18］，研究表明，Wnt分泌蛋白對細(xì)胞分化、遷移等具有調(diào)節(jié)的作用，并且在wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，Wnt配體與Frizzled受體相結(jié)合，激活成骨細(xì)胞形成［19］。

5 展望

椎間盤的退行性變，一直困擾著醫(yī)學(xué)界，隨著對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的研究，為椎間盤退化的治療提供更好的方法和途徑。但是目前的研究還只是在動物實驗?zāi)Ｐ椭幸浦睲SC取得較好的進(jìn)展，要進(jìn)入臨床治療還有許多問題需要解決:①動物的椎間盤模型與人的椎間盤在結(jié)構(gòu)和功能上，還是有一定的差異，且與人的椎間盤退化的機(jī)制也不完全相同。②BMSC分化成髓核細(xì)胞的精確顯型還不是十分清楚。③由于各個細(xì)胞的復(fù)雜性和廣泛性，如何使各個細(xì)胞處于最佳狀態(tài)，使相互間的協(xié)同作用得到最大的發(fā)揮，還需要我們更深入的研究。雖然我們還面臨這些難題，但是我堅信隨著人們對BMSCs更深入的研究，那么應(yīng)用BMSCs治療椎間盤退變必定成為現(xiàn)實。

［1］Prockop DJ.Marrow Stromal Cells as Stem Cells for Nonhematopoietic Tissues［J］.Science，1997，276(5309):71-74.

［2］Minguell JJ，Erices A，Corget P.Mesenchymal Stem Cells［J］.Experimental Biology and Medicine，2001，226(6):507-520.

［3］Fridenstein.Precursor cells of mechanocytes［J］.Int Rev Cytol，1976，47(5):327-359.

［4］Ashton BA，Eaglesom CC，Bob I，et al.Distribution of fibroblastic cotony-forming cells in rabbit bone marrow and assay of their osteogenic potential by an in vivio diffusion chamber method［J］.Calcifled Tissue International，1984，36(1):83-86.

［5］An HS，Masuda K，Inoue N.Intervertebral disc degeneration biological and biomechanical factors［J］.J Orthop Sci，2006，11(5):541-552.

［6］Gruber HE，Johnson TL，Lesliek K，et al.Autologous Intervertebral Disc Cell Implantation:A Model Using Psammomys obesus，the Sand Rat［J］.Spine，2002，27(15):1626-1633.

［7］Umeda M，Kushida T，Sasal K，et al.Activation of rat nucleus pulposus cells by coculture with whole bone marrow cells collected by the perfusion method［J］.J OrthopRes，2009，27(2):222-228.

［8］Sakai D，Mochida J，Iwashina T，et al.Differentiation of Mesenchymal Stem Cells Transplanted to a Rabbit Degenerative Disc Model:Potential and Limitations for Stem Cell Therapy in Disc Regeneration［J］.Spine，2005，30(21):2379-2387.

［9］Sakai D，Mochida J，Iwashina T，et al.Regenerative effects of transplanting mesenchymal stem cells embedded in atelocollagen to the degenerated intervertebraldisc ［J］.Biomaterials，2006，27(3):335-345.

［10］Risbud MV，Albert TJ，Vresilovic EJ，et al.Differentiation of Mesenchymal Stem Cells Towards a Nucleus Pulposus-like Phenotype In Vitro:Implications for Cell-Based Transplantation Therapy［J］.Spine，2004，29(23):2627-2632.

［11］Richardson SM，Curran JM，Chen R，et al.The differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into chondrocyte-like cells on poly-L-lactic acid(PLLA)scaffolds［J］.Biomaterials，2006，27(22):4069-4078.

［12］劉建華，王國海，徐棟梁.聚己內(nèi)酯與左旋聚乳酸共聚物支架的細(xì)胞相容性測定及與軟骨細(xì)胞體外復(fù)合的實驗研究［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2009，22(2):131-138.

［13］Chen WH，Liu HY，Lo WC，et al.Intervertebral disc regeneration in an ex vivo culture system using mesenchymal stem cells and plateletrich plasma［J］.Biomaterials，2009，30(29):5523-5533.

［14］Dounchis JS，Goomer RS，Harwood FL，et al.Chondrogenic phenotype of perichondrium-derived chondroprogenitor cells is influenced by transforming growth factor-beta 1［J］.J Orthop Res，1997，15(6):803-807.

［15］Li B.Bone Morphogenetic Protein-Smad Pathway as Drug Targets for Osteoporosis and Cancer Therapy［J］.Endoct Metab Immune Disord Drug Targets，2008，8(3):208-219.

［16］Madry H，Kaul G，Cucchiarini M，et al.Enhanced repair of articular cartilage defects?in vivo?by transplanted chondrocytes overexpressing insulin-like growth factor I(IGF-I)［J］.Gene Ther 2005，12(5):1171-1179.

［17］Indrawattana N，Chen G，Tadokoro M，et al.Growth factor combination for chondrogenic induction from human mesenchymal stem cell［J］.Biochem Biophys Res Commum，2004，320(3):914-919.

［18］Kubota T，Michigami T，Ozono K.Wnt signaling in bone metabolism［J］.J Bone Miner Metab，2009，27(3):265-271.

［19］Philipp I，Anfschnaiter R，Ozbek S，et al.Wnt/β-Catenin and noncanonical Wnt signaling interact in tissue evagination in the simple eumetazoan Hydra［J］.Proc Natl Acad，2009，106(11):4290-4295.