人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在心肌梗塞移植治療中的研究進(jìn)展

趙先鋒，徐 予，宿 昕，張雪亞

(1.河南省人民醫(yī)院心血管內(nèi)科 河南 鄭州 450003;2.武漢大學(xué) 經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院 湖北 武漢 430072)

隨著社會的發(fā)展及人類生活方式的轉(zhuǎn)變，冠狀動脈粥樣硬化造成的心肌梗塞發(fā)病率、死亡率、致殘率居高不下，給國家及個人造成巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前早期心肌梗塞的治療手段包括藥物治療、經(jīng)冠狀動脈介入治療(PCI)、冠狀動脈旁路移植術(shù)(CABG)等，但這些治療只能改善頓抑心肌、冬眠心肌的功能，對壞死心肌組織的恢復(fù)作用有限，只能有限改善臨床癥狀和預(yù)后。隨著心肌梗塞心肌重塑的發(fā)生，最終會導(dǎo)致心力衰竭，患者的生活質(zhì)量逐漸下降，只能以藥物，心臟輔助裝置及心臟移植延長患者壽命。

近年來，干細(xì)胞研究使人們看到了新的曙光。干細(xì)胞來源于胚胎、胎兒組織、成體組織、臍帶血、臍帶、骨髓等，是一類能自我更新、有較強(qiáng)分化和再生能力、并可產(chǎn)生各種類型成熟組織的原始細(xì)胞。根據(jù)其發(fā)育階段，干細(xì)胞分為胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞三類。但胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞定向分化和增殖、調(diào)控的條件還沒有完全弄清楚，且來源不足，臨床應(yīng)用受到限制。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是中胚層發(fā)育的早期細(xì)胞，因能在體內(nèi)外特定環(huán)境下，分化為骨、軟骨、肌肉、脂肪等間葉組織而得名。MSCs具有自我擴(kuò)增和多向分化性，在發(fā)育的不同階段和特定環(huán)境條件下，可以分化為多種組織細(xì)胞，越來越引起重視。心臟的細(xì)胞移植治療旨在通過再生的心肌組織替代纖維組織，從而改善心臟收縮和舒張功能，為心肌梗塞治療提供新的治療方法。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞是一種來源廣泛、再生能力強(qiáng)、有較強(qiáng)分化潛能、免疫原性低的干細(xì)胞，近年來已經(jīng)進(jìn)行很多基礎(chǔ)和臨床研究，現(xiàn)將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在心肌梗塞細(xì)胞移植治療中的研究進(jìn)展概述如下。

1 人臍帶間充干細(xì)胞的基礎(chǔ)研究

1.1 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的來源和分離 臍帶是胎兒時期連接母體與胎兒的索狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)含2條臍動脈和1條臍靜脈，在動靜脈之間含有特殊的胚胎粘液樣結(jié)締組織——華爾通氏膠(Wharton’s jelly WJ)。從華爾通氏膠分離得到的基質(zhì)細(xì)胞即為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells hUcMSCs)。胎兒分娩后6 h內(nèi)切除夾痕和淤血的部分，用含雙抗的PBS緩沖液充分沖洗臍帶外周以及臍靜脈內(nèi)腔，將臍帶剪切成4～5 cm長的小段，排凈血管內(nèi)血液，用眼科剪沿血管將包裹著血管的Wharton氏膠剪下，于小培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)一步剪碎培養(yǎng)。

1.2 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng) 采用植塊培養(yǎng)法［1］及膠原酶消化臍靜脈內(nèi)膜法［2］培養(yǎng)6～10 d均可見成纖維樣細(xì)胞從植塊邊緣爬出，形態(tài)與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似，散在分布或形成小克隆，3周左右細(xì)胞達(dá)70%～80%融合呈平行或漩渦狀排列。原代可獲得(5.2±1.7)×103個貼壁細(xì)胞/0.5 cm 臍帶組織，細(xì)胞至少可穩(wěn)定傳15代，均每代擴(kuò)增6.2倍。按照每根臍帶中位長30 cm計算，原代平均可獲3.12×107個貼壁細(xì)胞。傳代后細(xì)胞呈均一的梭形，平行或漩渦狀排列。

1.3 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的生長曲線和細(xì)胞周期

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞接種后0～3 d處于潛伏期，細(xì)胞無明顯增殖;第4天進(jìn)入對數(shù)增長期，維持至第8天;之后進(jìn)入平臺期，倍增時間為45 h，且基本保持穩(wěn)定。對處于對數(shù)增長期的細(xì)胞進(jìn)行周期檢測，大部分細(xì)胞處于G0/G1期，約20%細(xì)胞處于增殖的S+G2+M期，與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長周期相似。

1.4 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫表型 流式細(xì)胞術(shù)分析表明:hUcMSCs表達(dá)粘附分子和基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記CD13，CD29，CD44，CD73(SH3)，CD90，CD105(SH2)，CD166和HLA－I，更高水平表達(dá)CD146，代表間充質(zhì)干細(xì)胞的多向分化能力的標(biāo)志物，不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)記(CD14，CD34，CD45，CD38)，不表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記CD31和HLA－2DR，2DR，與骨髓源細(xì)胞相比兩者表達(dá)大多數(shù)表型一致，但是臍帶源細(xì)胞CD106，HLAABC的表達(dá)低于骨髓源細(xì)胞，說明hUcMSCs有相似或更低骨髓源干細(xì)胞的免疫原性，細(xì)胞移植后無免疫排斥反應(yīng)。

1.5 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化 人臍帶源間充質(zhì)干細(xì)胞利用5－氮雜胞苷(5－Aza)或二甲基亞砜誘導(dǎo)分化后免疫組化檢測到心肌樣細(xì)胞所特有的cTNI、cTNT、和心肌結(jié)蛋白。RT－PCR可以檢測到心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子(GATA－4)等說明人臍帶源間充質(zhì)干細(xì)胞能向心肌樣細(xì)胞分化［3］。

2 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在心肌梗塞臨床研究

1994年，Soonpaa 等［4］將小鼠胚胎心肌細(xì)胞(CDC)移植到正常小鼠心臟獲得成功。隨后，胚胎CDC在大鼠壞死心肌模型上獲得分化成功，開始了干細(xì)胞移植的先河。以后大量實驗證實在適宜的條件下，干細(xì)胞不僅可分化為心肌細(xì)胞，表達(dá)心肌特異的基因及蛋白質(zhì)成分，而且還可分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，參與新生血管的形成，同時干細(xì)胞還可分泌一些促進(jìn)細(xì)胞分化及血管形成的細(xì)胞因子，并認(rèn)為可以減少細(xì)胞凋亡。Scorsin等［5］證實干細(xì)胞移植后心臟在體功能改善。胚胎干細(xì)胞來源于種植前胚胎的細(xì)胞，可在體外生長，并能在原始未分化狀態(tài)無限繁殖，具有多能性，核型保持正常。人類干細(xì)胞體外生長繁殖和分化的潛能，為急性心肌梗死(AMI)組織再生與修復(fù)提供了新的途徑［6］。但由于自體胚胎干細(xì)胞很難得到，而同種異體間移植存在排異反應(yīng)，且應(yīng)用免疫抑制劑的副作用較大。因此人類進(jìn)行干細(xì)胞移植考慮自體骨髓干細(xì)胞、周圍血干細(xì)胞、臍血或臍帶源干細(xì)胞［7］。

中國人民解放軍海軍總醫(yī)院高連如等教授利用臍帶華通膠來源的間充質(zhì)干細(xì)胞治療1月內(nèi)新發(fā)生的STEMI和NSTEMI患者中，于發(fā)病6 h之內(nèi)實施血管重建術(shù)后，4～6 d做冠狀動脈灌注及其他擇期實施血管重建術(shù)者，與手術(shù)同時實施臍帶源干細(xì)胞移植，結(jié)果優(yōu)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植。天津昂賽細(xì)胞基因工程有限公司已經(jīng)開發(fā)出臍帶源間充質(zhì)干細(xì)胞注射液，每支1×106cells無污染，表達(dá)多種間充質(zhì)干細(xì)胞特異標(biāo)記，具有良好的增殖和分化潛能，經(jīng)動物實驗證明，對于衰老和損傷引起的多種疾病，如終末期心臟病、嚴(yán)重的神經(jīng)損傷等具有顯著的治療效果，應(yīng)用于科學(xué)、臨床研究。

2.1 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植的最佳劑量及時機(jī)

目前關(guān)于干細(xì)胞移植的最佳時機(jī)國際上還沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，但國內(nèi)外報道的看法比較一致。因為在AMI發(fā)生前5天的炎性反應(yīng)以及2周后的瘢痕化過程均可能不利于移植細(xì)胞的生存，所以在AMI發(fā)生后7 d左右即炎性反應(yīng)消退之后、瘢痕擴(kuò)展之前進(jìn)行干細(xì)胞移植效果較佳。Soekit等發(fā)現(xiàn)心肌梗死后1～2周，缺血心臟自身促血管新生因子如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)等的分泌。此時心臟自身促血管生成因素能夠放大移植的骨髓干細(xì)胞促血管生成效應(yīng)，更有利于缺血心臟的修復(fù)，而在心肌梗塞晚期細(xì)胞移植容易形成纖維瘢痕，效果不佳。但也有人認(rèn)為早期細(xì)胞移植炎癥反應(yīng)強(qiáng)，炎癥因子可促進(jìn)干細(xì)胞分化和歸巢，因此細(xì)胞移植越早越好。我們采用心肌梗塞后1周左右進(jìn)行細(xì)胞移植，移植間充質(zhì)干細(xì)胞劑量為106～108:劑量過低(＜105)不起作用，過高(＞108)不增加干細(xì)胞的分化效應(yīng)，反而增加微血栓形成、心律失常機(jī)率，我們臨床上單次用量2 ×107。

2.2 hUcMSCs的移植方式

2.2.1 經(jīng)冠狀動脈內(nèi)注射:操作簡單易行，可在PCI的手術(shù)過程中進(jìn)行，目前多數(shù)動物實驗和臨床研究都采用這一方法。但是把高濃度的細(xì)胞液直接注入靶區(qū)容易引起細(xì)胞栓塞及心律失常。另外，經(jīng)冠狀動脈內(nèi)注射的組織選擇性較差，細(xì)胞可分散到血流經(jīng)過的任何部位，并不能都到達(dá)阻塞血管支配的心肌壞死區(qū)域最需要細(xì)胞移植的部位中，有形成畸胎瘤風(fēng)險。

2.2.2 直接心內(nèi)膜下注射:此法通過股動脈或橈動脈將特制導(dǎo)管送達(dá)左心室，在X線透視下進(jìn)行心內(nèi)膜下注射。心內(nèi)膜電機(jī)械標(biāo)測系統(tǒng)(NOGA)提供心腔內(nèi)心電圖和室壁運(yùn)動信息，顯示異常區(qū)域(如心肌梗死部位)電激動順序圖，為心內(nèi)膜下注射導(dǎo)管提供精確的定位，具有良好的應(yīng)用前景。Ped等應(yīng)用NOGA對患者進(jìn)行HuMSCs心肌細(xì)胞移植，效果顯著，無明顯并發(fā)癥發(fā)生。然而，由于創(chuàng)傷性，操作有一定難度，且高壓下注射細(xì)胞液會造成細(xì)胞的損傷，此外還會引起心律失常，臨床應(yīng)用受到限制。

2.2.3 心肌內(nèi)注射:在冠狀動脈搭橋和換瓣等開胸手術(shù)在直視狀態(tài)下直接心肌內(nèi)注射，定位準(zhǔn)確、便于檢測、量化準(zhǔn)確。但臨床的開胸條件主要是冠狀動脈搭橋，而冠狀動脈搭橋只適用于少數(shù)心肌梗死患者，所以心肌內(nèi)注射移植應(yīng)用受限。

2.2.4 經(jīng)靜脈系統(tǒng)注射:這個技術(shù)最易實施，但由于存在肺、脾等臟器的首過效應(yīng)，僅有少量的移植細(xì)胞達(dá)到靶區(qū)，因此，對移植細(xì)胞的數(shù)量要求大，而且靜脈移植的歸巢作用不及冠狀動脈內(nèi)移植，目前已很少應(yīng)用。

2.3 hUcMSCs移植后的心功能評價 方法主要有心肌超聲造影、門控心肌斷層顯像、組織多普勒成像、核素心臟顯像，磁共振評價等。由于示蹤劑對活體組織有致癌性，不能跟蹤活體干細(xì)胞在人體成活的時間及直接評價干細(xì)胞在心肌內(nèi)的具體功能，與正常心肌的同步收縮、舒張功能的量化手段不足，只能通過間接心臟超聲射血分?jǐn)?shù)、左室收縮、舒張末期內(nèi)徑的大小及腦鈉肽的變化來監(jiān)測。

3 問題和展望

HUcMSCs來源于胎盤，在臨床上為廢棄物，但具有分化潛力大，增殖能力強(qiáng)，取材方便，來源廣泛等特點，征得同意后不涉及倫理問題，與捐獻(xiàn)骨髓或采集動員外周血相比，無痛苦，感染機(jī)會少，數(shù)量大，方便并能長期穩(wěn)定表達(dá)且免疫原性較低等特點。在創(chuàng)傷修復(fù)、局部缺血組織的血管再生和組織工程方面發(fā)揮不可估量的作用。

hUcMSCs作為心肌梗塞后壞死心肌移植新的種子細(xì)胞，細(xì)胞移植的簡單途徑、最佳數(shù)量、最佳時機(jī)、移植后分化、歸巢、評估還沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，以及細(xì)胞移植后心肌再生的機(jī)制可能為向心肌樣細(xì)胞分化，促進(jìn)血管生成，旁分泌功能，促進(jìn)內(nèi)源性干細(xì)胞等功能具體機(jī)制還沒有完全清楚，真正廣泛應(yīng)用于臨床還有很多工作要做。

［1］ Ma L，F(xiàn)ena XY，Cui BL，et al.Human umbilical cord Wharton’s jelly derived mesenchymal stem cells differentiation into nerve-like cells［J］.Chin Med(Engl)，2005，118(23):1987-1993.

［2］ Lu LL，Liu YJ，Yang SG，et al.Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiese-supportive function and other potentials［J］.Haematologica，2006，91(8):1017-1026.

［3］ 林曉波，何紅燕，羅敏潔，等.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的研究［J］.實用兒科臨床雜志，2007，22(13):971-973.

［4］ Soonpaa MH，Koh GY，Klug MG，et al.Formation of nascent intercalated disks between grafted fetal cardiomyocytes and host myocardium［J］.Science，1994，26(4):98-101.

［5］ Scorsin U，Hagege A，Marotte P，et al.Does transplantation ocardiomyocytes improve function of infarcted myocardium［J］.Circulation，1997，96(9Suppl):188-193.

［6］ Kadner A ，Zund G ，Maurus C，et al.Human umbilical cord cells for Cardiovascular tissue engineering:a comparative study［J］.EurJ Cardio-thorac Surg，2004，25(4):635-641.

［7］ Kadner A，Hoerstrup SP，Tracy J.Human umbilical cord cells:a new cell source for cardiovascular tissue engineering［J］.Ann Thorac Surg，2002，74(4):S1422-S1428.