冬凌草抗菌霜劑的制備和局部抗感染實(shí)驗(yàn)

梁 菊，陳 姍，劉秋偉

(河南科技大學(xué)化工與制藥學(xué)院，河南洛陽471003)

0 前言

冬凌草又名冰凌草，為唇形科香茶屬多年生草本植物，主要分布于中國中部和南部，主產(chǎn)區(qū)位于河南、安徽、湖北及貴州等地。其中以河南濟(jì)源產(chǎn)的冬凌草品相最佳［1］。傳統(tǒng)醫(yī)藥學(xué)認(rèn)為:冬凌草具有清熱解毒、消炎止痛及健胃活血之功效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn):冬凌草全草含有單萜、倍半萜和二萜等多種萜類化合物，以及黃酮類化合物、少量揮發(fā)油和生物堿。其中，二萜類化合物冬凌草甲素和冬凌草乙素被報道具有顯著的抗癌活性［2］，一直是藥學(xué)界的研究熱點(diǎn)。近年來，冬凌草抗菌活性的研究也初現(xiàn)端倪［3］。

文獻(xiàn)［4］報道顯示，冬凌草甲素和冬凌草乙素均具有抑菌作用。冬凌草的醇提物有抗菌消炎的功效，冬凌草醇劑對金黃色葡萄球菌及甲型溶血性鏈球菌有明顯抗菌作用，對上述細(xì)菌的最低抑菌濃度(MIC)分別為1∶128及1∶256，去鞣酸不影響其抗菌作用，冬凌草煎劑亦有一定抗菌作用，但作用較弱［5］。文獻(xiàn)［6］報道巴東冬凌草鮮葉的水提物對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有抑制作用，對革蘭氏陽性菌的抗菌活性要比對革蘭氏陰性菌的高，對枯草芽孢桿菌和綠膿桿菌具有殺滅作用。文獻(xiàn)［7］稱二帖類化合物冬凌草甲素和冬凌草乙素對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌這3種革蘭氏陽性細(xì)菌有較好的抑菌活性，其MIC值為15.63～31.25 mg/L。

到目前，冬凌草的劑型主要有片劑、滴丸、膠囊劑、注射劑和糖漿劑等［8－10］，冬凌草皮膚外用制劑的研究未見報道。本文旨在用乙醇回流提取得到冬凌草醇提物，制備冬凌草外用抗菌霜劑，通過體外抑菌實(shí)驗(yàn)、急性皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)及局部皮膚抗感染實(shí)驗(yàn)，評價該霜劑的安全性和抗感染活性，為開發(fā)冬凌草皮膚外用抗菌霜劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑和儀器

濟(jì)源產(chǎn)冬凌草(購于洛陽市張仲景大藥房)，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蘇云金桿菌、枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌和白色念珠菌由武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。其他試劑均為分析純，購自天津化學(xué)試劑廠。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，生化培養(yǎng)箱(上海佳勝實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，SW-CJ-2G型雙人凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)，DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

1.2 生藥浸膏制備

稱取冬凌草藥材20.0 g，粉碎，加入20倍量體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇回流提取1 h，過濾。藥渣用10倍量體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇在相同條件下再次回流提取1 h，過濾，并洗滌藥渣至洗液無色。最后，將得到的洗液與濾液合并，在45℃條件下減壓濃縮得濃縮液，并向其中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的活性碳，水浴回流脫色，抽濾。將所得濃縮液置于蒸發(fā)皿上，干燥箱(45℃)中干燥至恒重。

1.3 醇提物的體外抑菌實(shí)驗(yàn)

(1)LB固體培養(yǎng)基的配制:用電子天平分別稱取酵母提取物2.5 g、蛋白胨5 g、氯化鈉7.5 g，瓊脂粉7.5 g，傾入500 mL容量瓶中，用去離子水進(jìn)行定容，轉(zhuǎn)入錐形瓶中，超聲混合均勻，并經(jīng)過121℃高溫滅菌后放入超凈化工作臺中備用。

(2)紙片的制備:用5 mm型號的打孔器在雙圈牌濾紙上打孔獲得，將制好的紙片放入小燒杯中，并經(jīng)121℃高溫滅菌后放入超凈化工作臺內(nèi)備用。

(3)涂布平板:分別吸取20μL細(xì)菌，滴到不同的含有LB固體培養(yǎng)基平板上，用涂布器將其平鋪均勻。將各平板分區(qū)標(biāo)記，并將紙片用鑷子貼在不同的分區(qū)內(nèi)。分別吸取5μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.5%、1.0%、5.0%、10%的浸膏溶液，陽性對照物(15μg/mL的氨芐西林)以及陰性對照物(甲醇∶水=3∶2)，滴于紙片的正中央。

(4)恒溫培養(yǎng):將做好的各個平板放入37℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)，恒溫培養(yǎng)12 h后，記錄抑菌圈的大小。

1.4 霜劑的制備(生藥浸膏質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%)

(1)油相:1.25 g二甲硅油、1.75 g液體石蠟、2.0 g白油和1.0 g透皮促進(jìn)劑。

(2)水相:0.2 g卡波姆ultra-10融入9.8 g水中，加入甘油1.0 g、PEG-400 1.0 g和1.0 g生藥浸膏，最后加入1.0 g乳化劑。

(3)油相和水相分別放到60℃水浴中加熱。勻漿后，將水相慢慢倒入油相中，攪拌冷卻到25℃。調(diào)pH至中性。30 min后霜劑制成。

1.5 霜劑的急性皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)

1.5.1 備皮

取干凈白豚鼠12只，體重為(250±10)g，背部兩側(cè)剃毛，硫化鈉快速脫毛，溫水沖洗干凈，待皮膚干燥后，涂抹甘油，保持皮膚油潤光滑。將12只豚鼠隨機(jī)分為兩組，其中一組用小砂輪輕磨腿部兩側(cè)皮膚至破皮滲血，制造破損皮膚模型。

1.5.2 涂藥

24 h后，兩組同時開始給藥。每天定時給藥3次，每次0.2 g。每只豚鼠一側(cè)涂抹含藥霜劑，另一側(cè)對稱位置涂抹霜劑基質(zhì)。給藥面積20 mm×30 mm。連續(xù)給藥3 d后，清洗給藥處皮膚，觀察皮膚情況，拍照取樣。

1.6 局部皮膚抗感染實(shí)驗(yàn)

1.6.1 制造動物模型

18只干凈白豚鼠，體重為(250±10)g，脫毛，待皮膚干燥后涂抹甘油。24 h后用注射器向豚鼠腹部兩側(cè)的皮內(nèi)分別注射金黃色葡萄球菌，每側(cè)注射點(diǎn)為6個(區(qū)域面積20 mm×30 mm)，使豚鼠感染金黃色葡萄球菌，如若第2天出現(xiàn)紅腫，取其組織塊進(jìn)行體外微生物培養(yǎng)，若檢測到金黃色葡萄球菌，則表示造模型成功。

1.6.2 涂藥

將造模成功豚鼠隨機(jī)分為兩組，每組9只。其中一組為霜劑治療組，另一組不接受任何治療，兩組均正常進(jìn)食。給藥組，每天定時給藥3次，每次給藥0.2 g(給藥面積20 mm×30 mm)，連續(xù)給藥1周，觀察并記錄結(jié)果。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 醇提浸膏提取率

用70%的乙醇對冬凌草進(jìn)行熱回流提取，經(jīng)過脫色、濃縮及恒溫干燥，恒重后稱得生藥浸膏為(1.2 ±0.1)g。所得醇提物浸膏為深綠色黏膏狀物質(zhì)。由生藥投料20.0 g計算可知:醇提浸膏的得率為(6.0±0.5)%。

2.2 醇提物浸膏的體外抑菌活性

表1 醇提物浸膏的抑菌圈值 mm

將醇提物浸膏配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.5%、1.0%、5.0%和10.0%的浸膏溶液進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1所示:由表1數(shù)據(jù)可知:冬凌草的醇提浸膏溶液對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和蘇云金桿菌均有明顯的抑制活性，并且隨著濃度的增大，抑菌效果增強(qiáng)。而對藤黃微球菌、白色念珠菌及大腸桿菌無抑菌效果。表明該醇提取物的抑菌活性具有高選擇、強(qiáng)效的特點(diǎn)。

2.3 霜劑的性能

用所得的冬凌草浸膏按照一定的配方制成霜劑，所制得的霜劑呈黃綠色稠膏狀物質(zhì)，而空白基質(zhì)呈白色稠膏狀物質(zhì)。

利用干凈白色豚鼠進(jìn)行3 d急性皮膚刺激實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示:給藥3 d后，正常皮膚未見皮膚紅斑及腫脹等不良反應(yīng)產(chǎn)生，而破損的皮膚區(qū)域也未出現(xiàn)紅斑及腫脹等癥狀，并且破損皮膚已快愈合。說明該霜劑無論是對正常的皮膚還是破損的皮膚均安全無刺激。

豚鼠的皮膚炎癥模型的建立表明:已感染金黃色葡萄球菌的豚鼠局部皮膚出現(xiàn)紅腫，輕觸痛叫。取紅腫部位小塊皮膚經(jīng)體外組織培養(yǎng)，檢測到金黃色葡萄球菌感染，表明造模成功。經(jīng)1周定時定量的連續(xù)涂藥后，霜劑治療組局部皮膚紅腫現(xiàn)象消失，且無紅色斑點(diǎn)，注射點(diǎn)愈合較好。再次取小塊注射點(diǎn)皮膚經(jīng)體外微生物培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):注射部位皮膚已無細(xì)菌感染。

3 結(jié)束語

本實(shí)驗(yàn)將濟(jì)源產(chǎn)的冬凌草用乙醇回流法制得冬凌草醇提浸膏，此浸膏溶液對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和蘇云金桿菌具有明顯的抑菌效果，并且隨著濃度的增大，抑菌效果增強(qiáng)。以此提取物制備的霜劑對金黃色葡萄球菌所致的豚鼠局部皮膚感染具有明顯的治療效果，且該霜劑無論對正常皮膚還是破損皮膚均無刺激性。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)冬凌草醇提物具有很好的抑菌活性，結(jié)合文獻(xiàn)［7，11］可知:冬凌草乙醇提取物的主成分為冬凌草甲素與冬凌草乙素，它們各自都具有很好的殺菌抗炎作用。所以本文所制霜劑中起抑菌作用的可能是醇提物的主成分冬凌草甲素與冬凌草乙素，但也可能是很多復(fù)雜成分的綜合作用，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

本文實(shí)驗(yàn)表明:冬凌草的醇提取霜劑具有很好的抗菌消炎功效，并且無論對正常皮膚還是破損皮膚均安全無刺激，為今后開發(fā)含冬凌草成分的外用抗菌霜劑提供了很好的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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