植物β-淀粉酶研究進(jìn)展

孫俊良,梁新紅,賈彥杰,唐玉,郭祖峰

（河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

淀粉酶是水解淀粉和糖原酶類的統(tǒng)稱,按水解淀粉方式不同,淀粉酶可分為α-淀粉酶、β-淀粉酶、脫枝酶及葡萄糖淀粉酶4大類[1].按照結(jié)構(gòu)的差異,又可將其分為α、β型兩大類.β-淀粉酶（1,4-α-D-glucan maltohydrolase,EC 3.2.1.2）是一種外切酶,其作用于淀粉時(shí),從α-1,4糖苷鍵的非還原性末端順次切下一個(gè)麥芽糖單位,產(chǎn)物為麥芽糖和大分子的β-界限糊精.因?yàn)樵撁缸饔糜诘孜飼r(shí),發(fā)生沃爾登轉(zhuǎn)化（Walden inversion）,使產(chǎn)物由α型變?yōu)棣滦望溠刻?釋放的β-麥芽糖在C1位上有一個(gè)自由H基,為β型,故名β-淀粉酶[2-4].近年來,植物β-淀粉酶的研究引起了酶制劑行業(yè)的廣泛關(guān)注.本文對(duì)植物β-淀粉酶的作用原理、來源、應(yīng)用及分離純化等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述,最后對(duì)植物β-淀粉酶在酶制劑行業(yè)的研究及應(yīng)用進(jìn)行了展望.

1 β-淀粉酶的作用機(jī)理

β-淀粉酶的活性中心至少包含3個(gè)特種基團(tuán)X、A、B,這些基團(tuán)不僅參與酶和底物的結(jié)合,也參與酶-底物絡(luò)合物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的反應(yīng)過程,例如X基團(tuán)能夠識(shí)別出淀粉分子的非還原性末端C4上的-OH結(jié)構(gòu).當(dāng)X基團(tuán)和C4上的-OH反應(yīng)時(shí),底物分子中的第三個(gè)糖苷鍵能夠精確地反應(yīng)在催化基團(tuán)A和B之間,具有反應(yīng)力的酶-底物絡(luò)合物就此形成[2-3].當(dāng)X基團(tuán)沒有相對(duì)發(fā)揮作用及環(huán)狀糊精對(duì)酶進(jìn)行抑制時(shí),就會(huì)形成無反應(yīng)力的絡(luò)合物.β-淀粉酶不能夠在淀粉分子的內(nèi)部發(fā)揮作用,只能在β-淀粉酶的非還原性末端依次切掉麥芽糖,屬于“外切”型淀粉酶.當(dāng)β-淀粉酶水解直鏈淀粉時(shí),它會(huì)使直鏈淀粉分子逐漸縮短,麥芽糖的生成速度較慢；而當(dāng)其水解支鏈淀粉時(shí),因?yàn)橹ф湹矸鄯种Ρ容^多,非還原性末端就會(huì)多,所以麥芽糖生成速度要比水解直鏈淀粉時(shí)快得多.β-淀粉酶不能水解淀粉分支處的α-1,6糖苷鍵,淀粉的分解會(huì)在1,6鍵前的2～3個(gè)葡萄糖殘基處停止,所以分解直鏈淀粉的產(chǎn)物理論上主要是麥芽糖[4],分解支鏈淀粉的產(chǎn)物主要是麥芽糖及大分子的β-界限糊精.直鏈淀粉產(chǎn)生的麥芽糖相當(dāng)于支鏈淀粉產(chǎn)生麥芽糖總量的50%～60%.而當(dāng)β-淀粉酶對(duì)高度分支的糖原作用時(shí),只有40%～50%的糖原能轉(zhuǎn)變?yōu)辂溠刻?

2 植物β-淀粉酶的來源及分布

β-淀粉酶主要來源于高等植物（如甘薯、大豆、大麥、小麥等）和少數(shù)微生物.很多微生物通過發(fā)酵能產(chǎn)生β-淀粉酶,如蠟狀芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌、假單胞菌等[5].但通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)的β-淀粉酶耐熱性差,且成本較高,要達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)還需一定距離.植物中β-淀粉酶酶活力高、耐熱性好、作用pH范圍較廣,適合于高麥芽糖漿的生產(chǎn)要求.

植物體中的β-淀粉酶主要存在于質(zhì)體內(nèi),而在其他亞細(xì)胞區(qū)域內(nèi)β-淀粉酶的分布都較少.甘薯在自然栽培的條件下,只有塊根中存在β-淀粉酶,其余的部位幾乎檢測(cè)不出β-淀粉酶的存在,但是只有存在于質(zhì)體外的β-淀粉酶才具備活性.Zieglar[5]認(rèn)為β-淀粉酶在液泡中也有所分布,并且在多糖代謝中起到作用.單子葉植物中β-淀粉酶存在于胚乳細(xì)胞中,在其他器官中很少有分布,當(dāng)種子萌發(fā)時(shí),β-淀粉酶與其他相關(guān)酶一起協(xié)同完成淀粉的降解.而在高等植物中,存有兩種不同酶活力的β-淀粉酶,它們分別存在于植物的不同組織器官中：一種是以高活力存在的β-淀粉酶,主要存在于禾本科植物的胚乳中,當(dāng)這類植物的種子開始發(fā)芽時(shí),β-淀粉酶的酶活力會(huì)顯著升高；而另一種則是以相對(duì)酶活性較低的形式,普遍存在于植物的各個(gè)組織器官中的β-淀粉酶.這兩種形式的β-淀粉酶雖然在抗原性上較相似,但在其他方面存在著較大的區(qū)別,而且它們的生成方式也不盡相同,推測(cè)得出,前一種β-淀粉酶可能是由后一種β-淀粉酶的基因轉(zhuǎn)變而來的.β-淀粉酶在高等植物體內(nèi)是以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)兩種形式存在的,用水提的方法可以將植物中游離態(tài)的β-淀粉酶提取出來,而以結(jié)合態(tài)形式存在的β-淀粉酶的提取還需要添加還原劑或蛋白水解酶,這種結(jié)合態(tài)的β-淀粉酶由于與種子中的其他蛋白結(jié)合會(huì)成為復(fù)雜的不溶物質(zhì).這兩種形態(tài)的β-淀粉酶在大麥種子中占所有蛋白含量的1%左右.

3 植物β-淀粉酶的應(yīng)用

β-淀粉酶在食品加工、糧食加工、發(fā)酵、釀造、醫(yī)藥、紡織品等行業(yè)具有重要作用.β-淀粉酶作為糖化劑,可應(yīng)用于啤酒、飴糖、飲料等工業(yè)生產(chǎn),是食品加工與釀造行業(yè)的重要酶源.

據(jù)報(bào)道,中科院于1993年用微生物β-淀粉酶替代部分大麥芽生產(chǎn)啤酒新工藝,它將大麥芽與大米比例由7∶3改為5∶5,補(bǔ)加微生物β-淀粉酶,于北京啤酒廠20～100 t發(fā)酵罐生產(chǎn)線上試生產(chǎn)成功[7].2002年,周健芹等將Maltogenase和β-淀粉酶協(xié)同作用制取超高麥芽糖漿[8].2005年,徐忠等用β-淀粉酶和普魯蘭酶作用制備淀粉糖漿[9].

在制糖方面,β-淀粉酶通過水解淀粉生產(chǎn)麥芽糖,主要應(yīng)用于生產(chǎn)麥芽糖漿、高純度麥芽糖,麥芽糊精,麥芽糖醇,醫(yī)用針劑麥芽糖等.麥芽糖是自然界中常見的一種雙糖,它是麥芽糖糖漿的主要成分.麥芽糖不但被廣泛用作甜味劑,而且還是醫(yī)用的靜脈輸液糖補(bǔ)充劑.同時(shí),因?yàn)辂溠刻堑牡徒Y(jié)晶度及低吸濕性,它在食品工業(yè)生產(chǎn)中也被廣泛應(yīng)用.玉米、馬鈴薯、甘薯和木薯淀粉都是麥芽糖較好的生產(chǎn)原料.工業(yè)生產(chǎn)中,將淀粉漿濃度調(diào)到10%～20%,可生產(chǎn)醫(yī)用級(jí)麥芽糖；而調(diào)整到20%～40%時(shí),可以生產(chǎn)食品級(jí)麥芽糖[5,9].

在釀造工業(yè)中,β-淀粉酶是主要糖化酶之一.如在啤酒生產(chǎn)中,專用糖漿的生產(chǎn)主要應(yīng)用的酶制劑即為β-淀粉酶,其對(duì)啤酒糖漿質(zhì)量、品種和成本具有關(guān)鍵作用.利用甘薯β-淀粉酶替代麥芽生產(chǎn)啤酒,可提高輔料比到50%～75%,這就節(jié)約了麥芽用量,提高糖化率,降低生產(chǎn)成本,并且生產(chǎn)出的啤酒色淺,泡沫潔白細(xì)膩,清亮透明,品質(zhì)優(yōu)良,口味爽口純正,與常規(guī)工藝生產(chǎn)的啤酒相近.每生產(chǎn)萬噸啤酒,節(jié)約用糧約17萬kg,降低生產(chǎn)成本25萬元左右[10].此外,β-淀粉酶還應(yīng)用于制藥行業(yè)[5].

4 植物β-淀粉酶的分離純化

從微生物中提取的β-淀粉酶,存在著耐熱性差,且提取成本較高等缺點(diǎn),而從植物中提取β-淀粉酶生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、成熟,成本較低,因此,國(guó)內(nèi)外研究者大多偏向于從植物中提取β-淀粉酶.關(guān)于從植物中提取純化β-淀粉酶,國(guó)內(nèi)外已有一些報(bào)道.

Li HS等[11]指出,甘薯中不僅有大量的淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪、維生素和礦物質(zhì),同時(shí)還含有豐富的β-淀粉酶.β-淀粉酶是塊根中僅次于甘薯貯藏蛋白的一種蛋白質(zhì)成分,約占?jí)K根可溶蛋白的5%.Lehmussaari Anti等[12]提出,植物中的β-淀粉酶有很大一部分與谷物蛋白質(zhì)和其他成分結(jié)合在一起,要將β-淀粉酶從植物原料中提取出來,水溶劑中需添加含硫的還原劑,可提高提取率.

從植物中提取β-淀粉酶有水提和油提兩種方法,油提法（甘油）與水提法相比,不僅可以有效地縮短提取時(shí)間,而且能夠延長(zhǎng)酶的保存期,但由于油提法成本較高,生產(chǎn)中常采用水提法提取β-淀粉酶.邱宏端等[13]利用水提法對(duì)植物中β-淀粉酶進(jìn)行了研究,提取出的β-淀粉酶與異淀粉酶協(xié)同作用對(duì)木薯進(jìn)行酶解,產(chǎn)生的麥芽糖含量可達(dá)到70%～75%,而后又利用甘油進(jìn)行提取,這樣得到的β-淀粉酶較易保藏.蔣高松等[14]利用等電點(diǎn)法從甘薯中提取β-淀粉酶,得到的酶純度較高,酶活高,且耐熱性好,無毒,可以應(yīng)用于啤酒發(fā)酵.廖愛君等[15]則采用吸附法提取β-淀粉酶,所得酶活力高,熱穩(wěn)定性好,生產(chǎn)成本低,低溫條件下可長(zhǎng)期保存,應(yīng)用于飴糖加工.周中凱等[16]利用緩沖溶液從麩皮中提取β-淀粉酶,抽提率可達(dá)94%以上,所得酶系較純.李新華等[17]利用水提法提取紫甘薯中的β-淀粉酶,通過單因素及正交試驗(yàn),得到了最佳提取條件.從小麥、甘薯、大麥、大豆、麩皮、微生物等所含有的β-淀粉酶酶活力來看,甘薯中所含的β-淀粉酶酶活力較高,pH作用范圍廣,價(jià)格低廉,淀粉易回收,經(jīng)濟(jì)效益較好,是提取β-淀粉酶的良好原材料.

酶的純化一般都是依據(jù)它的分子量大小、形態(tài)、電荷性質(zhì)、溶解度、沉降系數(shù)、專一結(jié)合位點(diǎn)等規(guī)律所建立起來的純化方法.研究證明,要想得到較高純度的酶,必須同時(shí)應(yīng)用多種純化手段相結(jié)合的方法.而鹽析法是被應(yīng)用最早的純化方法,也是被用作各種提純方法中的第一步粗提方法.田亞平等[18]利用乙醇分級(jí)沉淀及柱層析結(jié)合的方法純化β-淀粉酶,先用1∶0.5除雜,再用1∶2.2乙醇收集沉淀,得到了較純的β-淀粉酶.劉巖等[19]則利用多種純化手段相結(jié)合的方法純化β-淀粉酶,先用疏水色譜分離出具有酶活力的α-淀粉酶和β-淀粉酶,超濾濃縮提取液,再利用凝膠過濾色譜按分子量大小不同將α-淀粉酶和β-淀粉酶分離.而Rushed等[19]先用飽和硫酸銨沉淀,然后過DEAE纖維素色譜柱及交聯(lián)葡萄糖柱,最后利用凝膠電泳和圓盤電泳分析.Teotia等[21]利用海藻酸鈉親和沉淀法,對(duì)甘薯中的β-淀粉酶進(jìn)行分離純化,所得到的酶被純化了44倍,回收率達(dá)到80%,相對(duì)分子質(zhì)量經(jīng)測(cè)定后為50 kDa.Nielsen等[22]采用離子交換柱層析法,分離純化出了一種受低溫誘導(dǎo)的淀粉酶,此酶具有比較寬的中性pH值范圍,根據(jù)底物水解特性得出了該淀粉酶為β-淀粉酶.利用聚丙烯酰胺凝膠電泳活性染色反應(yīng)后的酶譜可以看出,于正常溫度條件下生長(zhǎng)的甘薯的葉子、莖及塊根中,β-淀粉酶活性較低.而當(dāng)儲(chǔ)藏溫度從20℃緩慢降至3～5℃時(shí),β-淀粉酶活性由于低溫誘導(dǎo)作用而增強(qiáng).Lundgard等[23]用層析法純化得出了大麥β-淀粉酶的4個(gè)同功酶,它們的相對(duì)分子質(zhì)量分別為59 700、58 000、56 000和54 000 Da,等電點(diǎn)分別是5.2、5.3、5.5和5.7,而這些同功酶活性的最適pH范圍為4.5～7.5.周裔彬等[24]對(duì)兩種甘薯品種的皮及心層中的β-淀粉酶進(jìn)行了提取研究,得知皮層中的酶含量比心層中的高.對(duì)兩種甘薯品種的酶混合液先進(jìn)行了提純,又對(duì)粗酶和純酶液的熱、酸堿穩(wěn)定性進(jìn)行分析,結(jié)果得出粗酶液的最適反應(yīng)溫度為55℃,在50～60℃區(qū)間酶活較穩(wěn)定；β-淀粉酶最適pH值為6.0,在pH值為4.0～9.0范圍內(nèi)較穩(wěn)定.純化后的酶液最適反應(yīng)溫度及pH值與粗酶液的一樣,但沒有時(shí)段溫度穩(wěn)定性和酸穩(wěn)定性.在強(qiáng)酸強(qiáng)堿條件下,粗酶及純酶液酶活失活較快.

5 展望

隨著淀粉糖行業(yè)的迅猛發(fā)展,高麥芽糖漿和超高麥芽糖漿的產(chǎn)量迅速擴(kuò)大,β-淀粉酶的應(yīng)用范圍越來越廣,運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù),對(duì)有關(guān)植物β-淀粉酶基因表達(dá)規(guī)律、修飾和激活等進(jìn)行深入研究,選育含高活性β-淀粉酶植物,結(jié)合新型分離純化方法研制高酶活力的β-淀粉酶制劑,為促進(jìn)β-淀粉酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論及實(shí)踐依據(jù).

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