HPLC-UV法測定微生物降解體系中3-苯氧基苯甲酸含量

趙 楠，劉書亮，賴 文，袁懷瑜

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014)

HPLC-UV法測定微生物降解體系中3-苯氧基苯甲酸含量

趙 楠，劉書亮*，賴 文，袁懷瑜

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014)

采用高效液相色譜-紫外(high-performance liquid chromatography with ultraviolet，HPLC-UV)法測定微生物降解體系中3-苯氧基苯甲酸(3-PBA)的含量。以Gemini 100A C18柱(150mm×4.60mm，5.0μm)為色譜柱，乙腈-水(70∶30，V/V)為流動(dòng)相，流速0.7mL/min，用紫外檢測器在210nm處檢測3-PBA。結(jié)果顯示：3-PBA對(duì)照品的保留時(shí)間為4.268min，線性范圍為0.5～50.0mg/L，3-PBA平均回收率為98.919%，RSD為2.78%；運(yùn)用該方法測得4種不同來源的混合菌株發(fā)酵液中3-PBA的殘留量分別為24.467、86.266、2.633、1.921mg/L。本法簡單、快速、準(zhǔn)確、分離度好。

高效液相色譜-紫外(HPLC-UV法)；3-苯氧基苯甲酸(3-PBA)；微生物降解體系；檢測

3-苯氧基苯甲酸(3-PBA)是大多數(shù)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的主要降解產(chǎn)物之一，易在環(huán)境中遷移，半衰期長達(dá)180d[1]，且具有一定生殖毒性[2-4]，與擬除蟲菊酯類農(nóng)藥相比，該物質(zhì)在環(huán)境中的危險(xiǎn)性相對(duì)較大[1]。隨著擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的大量使用，其降解產(chǎn)物3-PBA在造成農(nóng)產(chǎn)品二次污染的同時(shí)[5]，也導(dǎo)致擬除蟲菊酯類農(nóng)藥生物礦化作用受阻，從而切斷該類農(nóng)藥徹底轉(zhuǎn)化為無毒小分子的生物降解途徑[6]，間接地使農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)殘問題更加嚴(yán)峻化。因此為了徹底降解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，避免其降解產(chǎn)物再造成二次污染，3-PBA的降解逐漸成為研究的熱點(diǎn)。

微生物降解法不失為消除有害化合物污染的佳選方法之一[7-8]。在微生物降解3-PBA的研究中，簡單、快速、準(zhǔn)確的檢測方法是能夠獲得理想菌株并進(jìn)一步研究菌株降解特性的基礎(chǔ)，然而針對(duì)微生物降解體系中3-PBA檢測的方法研究未見報(bào)道?，F(xiàn)今對(duì)于3-PBA檢測方法的研究主要集中于人與動(dòng)物血液及尿液方面[9-11]，并以氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)[12-14]法、液相色譜-質(zhì)譜(liquid chromatographymass spectrometry，LC-MS)[15-16]法為主，雖然這些方法靈敏度高、檢測結(jié)果準(zhǔn)確，但對(duì)于微生物降解體系中3-PBA含量較高、成分簡單的基質(zhì)而言，采用這些方法檢測，會(huì)導(dǎo)致其前處理過程相對(duì)復(fù)雜、耗時(shí)，分析成本也相對(duì)較高。高效液色譜-紫外(high-performance liquid chromatography with ultraviolet，HPLC-UV)法由于操作簡單、準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好，廣泛應(yīng)用于定性、定量檢測。Ding等[11]和謝文軍等[17]分別以HPLC-UV法檢測小鼠血液和土壤中的3-PBA殘留量，該法靈敏、準(zhǔn)確，且樣品前處理方法簡單，分析成本相對(duì)較低，但以上方法并非針對(duì)微生物降解體系建立，因此其前處理步驟還是相對(duì)較復(fù)雜、分析時(shí)間相對(duì)較長。本實(shí)驗(yàn)旨在針對(duì)微生物降解體系，建立一種簡單、快速、準(zhǔn)確的HPLC-UV法檢測微生物降解體系中的3-PBA殘留量，為篩選3-PBA降解菌及其進(jìn)一步研究提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基、試劑和菌種

無機(jī)鹽培養(yǎng)基(MM)[18-19]：硫酸銨1.5g，磷酸二氫鉀0.5g，磷酸氫二鉀1.5g，七水硫酸鎂 0.2g，氯化鈉0.5g，去離子水1000mL，pH7.5，121℃滅菌15min。

3-PBA(純度98%) 美國Sigma公司；檢測用乙腈(色譜純) 德國CNW Technologies GmbH公司；提取用乙腈(分析純) 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

從不同農(nóng)藥廠采集土壤或污水樣品(表1)，在含有150mg/L 3-PBA的MM培養(yǎng)基中馴化后，待進(jìn)一步測定確定其3-PBA降解率后進(jìn)行分離、篩選的混合菌株發(fā)酵液。

表1 樣品采集地Table 1 Information about 4 different microbial degradation systems

1.2 儀器與設(shè)備

LC-10A2010C HT型液相色譜系統(tǒng)[配有可變波長紫外檢測器(UV)和LC-solution1.1色譜工作站] 日本島津公司；UV-3200(PC)紫外-可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；AS10200A超聲波清洗器 天津奧特賽恩斯公司；BT 124S型電子天平 德國塞多利斯公司；BR4i 型冷凍離心機(jī) 美國熱電公司；Mill-Q 超純水儀德國密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Gemini 100A C18柱(150mm×4.60mm，5.0μm)；流動(dòng)相：以乙腈和水作流動(dòng)相，用磷酸將水pH值調(diào)為2.5，比較不同乙腈比例組成(40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%)的流動(dòng)相、不同流速(0.6、0.7、0.8mL/min)對(duì)3-PBA測定的影響；檢測波長：210nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：5μL。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取0.01g 3-PBA標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈定容于10mL棕色容量瓶中，得質(zhì)量濃度為1000mg/L的對(duì)照品儲(chǔ)備液，再精確吸取1mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，定容至10mL，得質(zhì)量濃度為100mg/L的對(duì)照品儲(chǔ)備液(4℃貯存)。

1.3.3 樣品處理

取經(jīng)過反復(fù)馴化后的混合菌株發(fā)酵液1mL接種于30mL含有100mg/L 3-PBA的MM培養(yǎng)基中。30℃、120r/min 培養(yǎng)5d，然后取1mL菌液用2mol/L的鹽酸酸化到pH2，用乙腈定容至10mL。取4mL定容后的樣品13000r/min離心10min，將上清液用0.45μm的有機(jī)相濾膜過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液供液相色譜分析用。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長的確定

以流動(dòng)相將3-PBA的對(duì)照品溶解，制成質(zhì)量濃度約10mg/L的溶液，在200～400nm的波長范圍進(jìn)行紫外光全波長掃描(圖1)。從圖1可看出，3-PBA的最大吸收波長為208.9nm，故選擇210nm作為檢測波長。

圖1 3-PBA對(duì)照品吸收光譜Fig.1 UV scanning spectrum of 3-PBA standard

2.2 流動(dòng)相的確定

以40%～80%的不同乙腈比例組成，每次增加5%乙腈的方式探討了流動(dòng)相對(duì)3-PBA分析的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著乙腈比例的增加，3-PBA出峰時(shí)間相應(yīng)提前，信號(hào)強(qiáng)度增高，但與培養(yǎng)基中的非目標(biāo)峰分離變差。當(dāng)乙腈與水比例為70∶30時(shí)，拖尾因子最小其峰形最佳，與非目標(biāo)峰分離較好，并且當(dāng)乙腈與水比例為70∶30時(shí)，增加乙腈在流動(dòng)相中的比例，信號(hào)強(qiáng)度、保留時(shí)間的增加和提前相對(duì)變緩，因此最終確定乙腈與水組成比例為70∶30(V/V)為最終的流動(dòng)相組成。同時(shí)，對(duì)不同流速(0.60、0.70、0.80mL/min)條件下的分離情況進(jìn)行考察。隨著流速的提高，出峰時(shí)間提前，柱壓上升，但其與非目標(biāo)峰的分離也相應(yīng)變差。當(dāng)流速在0.7mL/min時(shí)，3-PBA保留時(shí)間較0.6mL/min明顯縮短；而與0.8mL/min相比，其與非目標(biāo)峰的分離較好，保留時(shí)間略長。綜合以上各方因素，最終選擇流動(dòng)相流速為0.7mL/min。在該色譜條件下3-PBA標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間為4.249min，峰形良好，無拖尾(圖2A)；而在樣品中目標(biāo)物質(zhì)保留時(shí)間為4.268min，峰形良好，與非目標(biāo)物質(zhì)的分離也很好(圖2B)。整個(gè)樣品檢測可在5min內(nèi)完成，提高了檢測效率。

圖2 3-PBA對(duì)照品(A)和3-PBA樣品(B)溶液色譜圖Fig.2 Chromatogram of 3-PBA standard and sample

2.33 -PBA標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別吸取100mg/L 3-PBA 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液5.0、4.0、3.0、2.5、2.0、1.5、1.0、0.5、0.2、0.1、0.05mL以乙腈-水(70∶30，V/V)定容至10mL，配制得質(zhì)量濃度分別為50.0、40.0、30.0、25 .0、20.0、15.0、10.0、5.0、2.0、1.0、0.50mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。按1.3.1節(jié)色譜條件測定，以質(zhì)量濃度X/(mg/L)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，3-PBA進(jìn)樣量在0.50～50.0mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，得回歸方程為Y=104372X＋5427，相關(guān)系數(shù)R2=0.9991。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

在以上確定的色譜條件下，對(duì)同一3-PBA對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，進(jìn)行HPLC分析。測得吸收峰面積分別為527812、526469、542823、531724和540123，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.37%，表明實(shí)驗(yàn)精密度高。

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一樣品，按1.3.3節(jié)樣品處理方法，分別提取制備5份樣品液，HPLC 測定3-PBA含量考察方法重現(xiàn)性，結(jié)果見表2。從表2可以看出，發(fā)酵液中3-PBA的平均質(zhì)量濃度為24.470mg/L，RSD為0.63%，表明樣品前處理步驟簡單，重復(fù)性好，符合分析要求。

表2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果Table 2 Results of reproducibility test

2.6 回收率實(shí)驗(yàn)

在已知質(zhì)量濃度的3-PBA發(fā)酵液中分別加入一定量的3-PBA對(duì)照溶液進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，具體加標(biāo)水平及結(jié)果見表3。分別按1.3.3節(jié)樣品處理方法定容至10mL制備成3份樣品溶液，精密吸取10μL 進(jìn)樣測定3-PBA峰面積。由表3可見，3-PBA平均回收率為98.919%，RSD為2.78%。

表3 回收率實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果Table 3 Results of spike recovery test

2.7 樣品測定

按上述方法和色譜條件對(duì)4種不同來源的混合菌株發(fā)酵液中的3-PBA殘留量進(jìn)行測定(每個(gè)樣品抽取3 瓶)，結(jié)果如表4所示。所有樣品中3-PBA的質(zhì)量濃度均較發(fā)酵液中的3-PBA原始添加質(zhì)量濃度(100mg/L)均有不同程度的減少，4種發(fā)酵液中殘留的3-PBA分別24.467、86.266、2.633、1.921mg/L，這為4種不同來源混合菌株發(fā)酵液中微生物的分離、純化和進(jìn)一步研究提供參考依據(jù)。

表4 4種發(fā)酵液中3-PBA殘留情況Table 4 3-PBA residues in different microbial degradation systems

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以3-PBA混合菌發(fā)酵液為研究對(duì)象，探討了在篩選3-PBA降解菌和3-PBA降解菌特性研究工作中，利用HPLC-UV法檢測微生物降解體系中3-PBA的殘留量。該方法操作簡單、分析快速、且結(jié)果準(zhǔn)確，所選流動(dòng)相能將微生物降解體系中殘留的3-PBA和其他非目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行有效分離，測定微生物降解體系中3-PBA的分析時(shí)間只需5min，分析時(shí)間短，降低了分析的成本，為高效篩選和研究3-PBA降解菌提供了方法保障。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)在4種不同來源混合菌發(fā)酵液中添加的3-PBA均有減少，具有進(jìn)一步分離研究的價(jià)值。

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Determination of 3-Phenoxybenzoic Acid in Microbial Degradation Systems by HPLC-UV Detection

ZHAO Nan，LIU Shu-liang*，LAI Wen，YUAN Huai-yu
(College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

A HPLC method with UV detection was proposed to determine the concentration of 3-phenoxybenzoic acid (3-PBA) in microbial degradation systems. The chromatographic separation was performed on a Gemini 100A C18 column (5.0μm, 150 mm × 4.60 mm, i.d.) using a mobile phase made up of acetonitrile and water (70∶30, V/V) at a flow rate of 0.7 mL/min, and 3-PBA was detected at 210 nm using a UV detector. The retention time of 3-PBA was 4.268 min. The linear range of the method was 0.5-50.0 mg/L. The average spike recovery for 3-PBA was 98.919%, with a relative standard deviation (RSD) of 2.78%. The residues of 3-PBA in 4 different microbial degradation systems were 24.467, 86.266, 2.633 mg/L and 1.921 mg/L, respectively. The developed method demonstrated the benefits of simplicity, rapidity, high accuracy and good separation.

HPLC-UV；3-phenoxybenzoic acid；microbial degradation system；determination

TS201.3

A

1002-6630(2011)14-0181-04

2010-09-25

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(21072137)

趙楠(1986—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c檢測。E-mail：zhaonan19861115@yahoo.cn

*通信作者：劉書亮(1968—)，男，副教授，碩士，研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c發(fā)酵工程。E-mail：lsliang999@163.com