響應面法優(yōu)化中性蛋白酶提取牡蠣?；撬崦附夤に嚄l件

劉亞南，張志勝，佟海菊，孫克巖，宋 欣

(河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，河北 保定 071001)

響應面法優(yōu)化中性蛋白酶提取牡蠣?；撬崦附夤に嚄l件

劉亞南，張志勝*，佟海菊，孫克巖，宋 欣

(河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，河北 保定 071001)

利用中性蛋白酶對牡蠣進行酶解，在單因素試驗基礎上，研究加酶量、pH值、溫度3個因素對酶解過程中?；撬崽崛×康挠绊懀ㄟ^三因素三水平Box-Behnken響應面分析法優(yōu)化其酶解工藝。結(jié)果顯示：在加酶量1300U/g、pH7.5、溫度48℃條件下，?；撬崽崛×繉嶋H值可達2.724mg/g。

牡蠣；牛磺酸；響應面法；酶解

牛磺酸是人和動物重要的營養(yǎng)物質(zhì)，具有消炎解毒、保肝利膽、降血脂、促進幼兒大腦發(fā)育及安神健腦等重要的生理活性[1-5]。國內(nèi)外對?；撬岬闹迫≈饕袃煞N，一是化學合成，二是從天然產(chǎn)物中提取?；瘜W合成的生產(chǎn)量雖然高，但成本高、污染嚴重，而且生物活性與天然?；撬岜容^低，因此從天然產(chǎn)物中提取?；撬峋哂袕V闊的前景。?；撬釓V泛存在于除植物外的許多生物體的組織間液或細胞內(nèi)液中，并以小分子的二肽或三肽的形式存在于中樞神經(jīng)系，但不參與蛋白質(zhì)的合成[6]。在水產(chǎn)品中含量最為豐富，如青花魚、墨魚、章魚、牡蠣、蛤蜊、蝦等，而牡蠣、蛤蜊等海洋生物中?；撬崽崛×枯^高，據(jù)文獻報道每千克鮮牡蠣中約含有4～8g的牛磺酸[6-7]。

目前，海洋生物中?；撬岬奶崛《嗖捎盟蠓ǎ萌艹龅陌被崃炕蛩舛葋砗饬颗；撬岬奶崛⌒Ч?。但時間過短?；撬崛艹霾粡氐?，時間過長又會使細胞內(nèi)雜質(zhì)大量溶出[8]?？紤]到后續(xù)分離純化，而采用較溫和的酶解法，既減少雜質(zhì)的溶出，又提高了牛磺酸的溶出量。本實驗利用中性蛋白酶對牡蠣進行酶解，以?；撬崽崛×繛橹笜耍Y(jié)合響應面分析對酶解工藝進行優(yōu)化，得到?；撬崽崛〉倪m宜條件。

1 材料與方法

1.1 原料

牡蠣 唐山豐瑞水產(chǎn)食品有限公司；枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(以下稱中性蛋白酶，實際酶活80000U/g) 索來寶科技有限公司；牛磺酸標準樣(純度≥99%) 上海藍季科技發(fā)展有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV2800H紫外分光光度計 尤尼科(上海)儀器有限公司；HH-4電熱恒溫水浴鍋 金壇市杰瑞爾電器有限公司；DELTA320精密pH計 上海精密科學儀器有限公司；79-1磁力攪拌器 金壇市醫(yī)療儀器廠；JJ-2組織搗碎均漿機 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；GL2G2Ⅱ立式冷凍離心機 上海安亭科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 ?；撬崦附馓崛」に嘯9-10]

將牡蠣肉清洗勻漿，稱取一定量按照試驗設計方案確定的試驗參數(shù)調(diào)整料液比、pH值、溫度、酶解時間等，將勻漿液在水浴鍋中按試驗設計溫度預熱15min，然后按照試驗設計方案添加蛋白酶進行恒溫酶解，期間每10min用玻璃棒攪拌一次，酶解完成后樣品在沸水浴中滅酶10min，冷卻，6000r/min離心15min后取上清液，測定?；撬崽崛×浚瑢嶒炂叫?次。

1.3.2 牛磺酸提取量的測定

1.3.2.1 檢測方法[11]

在醋酸鈉的作用下，牛磺酸與乙酰丙酮和甲醛加熱反應生成黃色配合物，其吸光度與?；撬釢舛仍谝欢ǚ秶鷥?nèi)呈正比。顯色劑：10mL NaAc(1mol/L)、0.6mL乙酰丙酮、0.4mL甲醛用水定容至25mL。測定時精密量取1mL樣品，加入1.5mL顯色劑和2.5mL水，用棉塞封住口，100℃水浴15min，冷卻后在400nm波長處測定?；撬崽崛×?。

1.3.2.2 標準曲線方程的得出

配制不同濃度的?；撬針藴嗜芤海?00nm波長處進行測定吸光度。每次測定所用提取液，用蒸餾水定容至50mL，從中吸取1mL進行測定，按標準曲線進行計算?；貧w方程為y=2.0207χ＋0.0054，R2=0.9993，式中，y為吸光度、χ為牛磺酸提取量/(mg/g)。

1.3.3 中性蛋白酶酶解工藝參數(shù)的優(yōu)化[12-14]

在單因素試驗的基礎上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗設計原理，結(jié)合單因素試驗結(jié)果，以加酶量(X1)、pH值(X2)和溫度(X3)為變量因素，每一個自變量的低、中、高實驗水平分別以-1、0、1進行編碼，試驗設計見表1。

表1 響應面分析因素水平Table 1 Variables and their coded levels in the response surface design

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解工藝回歸模型的建立

根據(jù)表1進行響應面試驗，測定每個因素水平時?；撬岬奶崛×?，結(jié)果如表2所示。

表2 ?；撬崽崛」に嘊ox-Behnken試驗設計與結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

利用Design Expert軟件，對表2數(shù)據(jù)進行二次回歸擬合，得到回歸方程Y=2.78+0.38X1+0.33X2+0.15X3-0.078X1X2+0.065X1X3+0.072X2X3-0.39-0.36-0.26。

2.2 回歸模型的檢驗

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

通過Design Expert對表2數(shù)據(jù)進行方差分析，結(jié)果見表3。模型的P值為0.0008(＜0.01)，說明該模型在概率為0.01水平上能夠擬合試驗數(shù)據(jù)，回歸模型極顯著。模型中加酶量(X1)、pH值(X2)、、對?；撬崽崛×康挠绊憳O顯著，X3(溫度)、對?；撬崽崛×康挠绊戯@著。該模型回歸顯著(P＜0.01)、失擬項不顯著(P=0.1561＞0.05)，并且該模型的R2=0.9527，0.8919，說明該模型與實際實驗擬合較好，自變量與響應值之間線性關(guān)系顯著，可以用于?；撬崽崛〉膶嶒烆A測。

2.3 酶解工藝參數(shù)的確定

為直觀尋找最適宜變量組合，使得響應值達到最大，采用Design Expert軟件對3因素之間的交互作用進行全面的模型分析，并繪制響應面曲線圖。響應面圖形是響應值對各試驗因子X1、X2、X3所構(gòu)成的三維空間的曲面圖，從響應面分析圖上可形象地看出最佳參數(shù)及各級參數(shù)之間的相互作用。當特征值均為正值時，響應面的分析圖為山谷形曲面，有極小值存在；當特征值為負值時，響應面的分析圖形為山丘形曲面，有極大值存在；當特征值有正有負時，為馬鞍形曲面，無極值存在。等高線圖可以直觀地反映兩變量交互作用的顯著程度，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形與之相反。圖1b、圖2b及圖3b中等高線均呈橢圓形，表明各圖中兩因素交互作用顯著[15]。圖1～3分別顯示了3組實驗參數(shù)以?；撬崽崛×繛轫憫档内厔輬D。

圖1 加酶量和pH值對牛磺酸提取量影響的響應曲面和等高線圖Fig.1 Response surface plot and contour showing the effects of enzyme dosage and pH value on taurine extraction yield

圖2 pH值和溫度對?；撬崽崛×坑绊懙捻憫婧偷雀呔€圖Fig.2 Response surface plot and contour showing the effects of pH value and temperature on taurine extraction yield

圖3 加酶量和溫度對牛磺酸提取量影響的響應曲面和等高線圖Fig.3 Response surface plot and contour shwoing the effects of enzyme dosage and temperature on taurine extraction yield

從圖1可以看出，加酶量和pH值對?；撬崽崛×坑绊戄^大。隨著加酶量及pH值的提高，牛磺酸提取量呈先升高后下降的趨勢。加酶量到某一值時，酶與底物達到飽和，而隨著pH值的升高酶活性也在降低。因此只有在適宜的加酶量及pH值條件下，?；撬岬暮坎艜_到理想值。同樣從圖2、3可以看出，只有在pH值與溫度、加酶量與溫度適宜的情況下，牛磺酸提取量才能達到最大值。

由圖1a、2a、3a可以得出，響應面存在最大值。由數(shù)據(jù)分析可得?；撬崽崛∽钸m宜酶解工藝條件為加酶量1296U/g、pH7.53、溫度47.8℃，?；撬崽崛×康睦碚撟畲笾禐?.70mg/g。但考慮到實際生產(chǎn)的方便性，最適宜工藝條件相應修正為加酶量1300U/g、pH7.5、溫度48℃。在此修正條件下，做3個平行，測得實際提取量為2.724mg/g，與理論值相差不多，可見該模型可較好的反應?；撬岬奶崛l件。與水煮法相比酶解法溶出的雜質(zhì)少，而且水解液中含有豐富的氨基酸和肽類，還可以用于分離其他氨基酸或肽類等，對其進行多方面的綜合利用。

3 結(jié) 論

本實驗建立了以?；撬崽崛×繛轫憫担约用噶?、pH值、溫度因素的數(shù)學模型。在本實驗設計范圍內(nèi)，影響牛磺酸提取量的主次順序為加酶量、pH值、溫度。方差分析表明該模型擬合行較好。最終確定出?；撬崽崛〉淖钸m宜酶解工藝條件為加酶量1300U/g、pH7.5、溫度48℃。

在最適宜條件下進行驗證實驗得到?；撬崽崛×繛?.724mg/g，與理論值相差不明顯，說明該模型可以較好地反映牛磺酸提取的條件。因此，采用響應面法優(yōu)化得到的提取條件參數(shù)具有可行性與應用價值。

[1]陳惠源, 蔡俊鵬. 牡蠣的營養(yǎng)藥用價值及其開發(fā)利用[J]. 中藥材, 2005, 3(3)∶ 172-173.

[2]龔麗芬, 黃慰生, 鄭志福, 等. 牛磺酸的生物活性、提取與測定[J].福建化工, 2003(1)∶ 26-28.

[3]張平偉, 楊祖英. ?；撬岬纳砉δ芗捌錉I養(yǎng)作用(綜述)[J]. 中國食品衛(wèi)生雜志, 1997, 5(9)∶ 36-40.

[4]張磊, 楊程, 侯志成, 等. ?；撬岬纳碜饔肹J]. 武警醫(yī)學院學報, 2002, 11(1)∶ 54-56.

[5]俞鳴, 田慶偉. ?；撬岜＝∽饔玫难芯窟M展[J]. 中國食品添加劑, 1999 (4)∶ 4-7.

[6]譚樂義, 章超樺, 薛長湖, 等. ?；撬岬纳锘钚约捌湓诤Ｑ笊镏械姆植糩J]. 湛江海洋大學學報, 2000, 20(3)∶ 75-79.

[7]張輝, 管華詩, 趙志強. 長牡蠣中天然牛磺酸的提取[J]. 海洋科學, 2005(4)∶ 1-4.

[8]粟桂嬌, 閻欲曉, 覃潔, 等. 車螺肉酶解液中提取分離天然?；撬峁に嘯J]. 食品科學, 2005, 26(9)∶ 372-376.

[9]郭玉華, 曾名勇. 牡蠣酶解工藝的研究[J]. 中國海洋藥物, 2008(2)∶40-44.

[10]吳文龍, 志娟. 雙酶法水解牡蠣肉工藝條件的研究[J]. 食品科技, 2005 (11)∶ 39-41.

[11]湯志方. 海洋生物中牛磺酸的提取及分析[D]. 青島∶ 青島科技大學, 2005∶ 16-24.

[12]王欽德, 楊堅. 食品試驗設計與統(tǒng)計分析[M]. 北京∶ 中國農(nóng)業(yè)大學出版社, 2002∶ 423-425.

[13]苗建銀, 吉宏武, 邵海艷, 等. 響應面法優(yōu)化近江牡蠣肉酶解工藝參數(shù)[J]. 食品工業(yè)科技, 2009(4)∶ 158-161.

[14]王素華, 勵建榮, 吉宏武. 響應面法優(yōu)化馬氏珠母貝肉酶解工藝參數(shù)[J]. 食品科技, 2009, 34(4)∶ 38-42.

[15]SAYAN G, MANOHAR C S. An improved response surface method for the determination of failure probability and importance measures[J]. Structural Safety, 2004, 26(1)∶ 123-132.

Employing Response Surface Methodology to Optimize Process Conditions for Enzymatic Extraction of Taurine from Oyster Meat with Neutral Protease

LIU Ya-nan，ZHANG Zhi-sheng*，TONG Hai-ju，SUN Ke-yan，SONG Xin
(College of Food Science and Technology, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, China)

In this study, neutral protease hydrolysis was used to extract taurine from oyster meat and the extraction process was optimized. On the basis of one-factor-at-a-time experiments, a three-variable, three-level Box-Behnken experimental design coupled with response surface analysis was employed to explore the effects of enzyme dosage, pH and temperature on the extraction efficiency of taurine. The optimum hydrolysis conditions for taurine extraction were enzyme dosage 1300 U/g fresh meat, pH 7.5 and hydrolysis temperature 48 ℃, and the resulting extraction yield of taurine was 2.724 mg/g fresh meat.

oyster；taurine； response surface methodology；enzymolysis

TS254.4

A

1002-6630(2011)14-0025-04

2010-09-09

國家海洋公益性行業(yè)科研專項(200805046)

劉亞南(1984—)，女，碩士研究生，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏工程。E-mail：yananliu1984@sina.cn

*通信作者：張志勝(1970—)，男，教授，博士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏工程。E-mail：zhangzhisheng66@139.com