6種糖基化合物對(duì)臺(tái)灣乳白蟻糖基水解酶分泌的影響

曾文慧，劉瑞嫻，李志強(qiáng)，劉炳榮，李秋劍，陳來(lái)泉，鐘俊鴻*

(1.廣東省昆蟲研究所，廣州 510260;2.廣東韶能集團(tuán)股份有限公司，韶關(guān) 510630)

木質(zhì)纖維素 (lignocellulose)是植物細(xì)胞壁的主要組成成分 (Ohkuma，2003)，是一類由纖維素(cellulose)、半纖維素 (hemicellulose)等多聚糖以及無(wú)定形態(tài)聚合物木質(zhì)素 (lignin)結(jié)合在一起形成的混合物 (Arakawa et al.，2009)，是地球上含量最豐富的可再生資源。

纖維素和半纖維素酶均屬于糖基水解酶 (glycosyl hydrolase)蛋白家族。低等白蟻的木質(zhì)纖維素水解酶系統(tǒng)包含三種不同類型的纖維素酶:外切葡聚糖酶，包括纖維二糖水解酶 (cellobilohydrolase，1，4－β －D －glucan cellobiohydrolase，CBH)和外葡萄糖水解酶 (exoglucohydrolase，1，4－β－D－glucan exoglucohydrolase)2種成份，內(nèi)切葡聚糖酶 (endo－β－1，4－glucanases，EG，EC3.2.1.4)以及 β－葡萄糖苷酶 (β－glucosidase，BG，EC3.2.1.21)(Li et al.，2010)。同時(shí)，內(nèi)切木聚糖酶 (endo－β－1，4－D－xylan，xylanohydrolase，EX，EC3.2.1.8)是低等白蟻重要的一類半纖維素水解酶 (Li and Sun，2001)。

研究發(fā)現(xiàn)低等白蟻擁有兩個(gè)纖維素水解酶系統(tǒng):一個(gè)在前腸 (Foregut)/唾液腺 (Salivary gland) +中腸 (Midgut)，為內(nèi)源性水解酶系統(tǒng);另一個(gè)在后腸 (Hindgut)，為后腸共生微生物水解酶系統(tǒng) (Nakashima et al.，2002;Zhou et al.，2007)。但是，至今為止，低等白蟻的兩個(gè)纖維素酶水解系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)制還未有相關(guān)的研究報(bào)道。相較而言，在絲狀真菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了木聚糖酶和纖維素酶啟動(dòng)子結(jié)合型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Xyrl、ACEI及轉(zhuǎn)錄激活因子X1nR等 (Ling et al.，2009;Stricker et al.，2008;Saloheimo et al.，2000)。研究發(fā)現(xiàn)真菌木質(zhì)纖維素酶可以通過(guò)添加槐糖 (sophorose)、纖維二糖 (cellobiose)及乳糖 (lactose)等寡聚糖至培養(yǎng)基中作為調(diào)節(jié)因子來(lái)調(diào)節(jié)其分泌量 (Morikawa et al.，1995)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)借鑒真菌纖維素酶和半纖維素酶分泌的調(diào)節(jié)因子，利用各種糖基化合物活體誘導(dǎo)臺(tái)灣乳白蟻Coptotermes formosanus，研究它們對(duì)臺(tái)灣乳白蟻4種糖基水解酶分泌的影響。通過(guò)測(cè)定EG、BG和CBH 3種纖維素酶及EX 1種半纖維素酶活力，來(lái)檢測(cè)誘導(dǎo)效果。這些研究將給白蟻木質(zhì)纖維素酶系的調(diào)控機(jī)制，提供重要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)白蟻

供試蟲源采自廣州龍洞的白蟻誘捕箱，帶回實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，挑取活力較好的臺(tái)灣乳白蟻工蟻進(jìn)行試驗(yàn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

本實(shí)驗(yàn)選用的誘導(dǎo)試劑:木質(zhì)素 (Lignin，low sulfonate content，Sigma)，羧甲基纖維素鈉(CMC－Na，天津福晨化學(xué)試劑廠)，L－山梨糖(L－sorbose，Genview)，D－果糖 (D－Fructose，Genview)，葡萄糖 (Glucose，廣州化學(xué)試劑廠)，D－半乳糖 (D－Galactose，Genview);其它化學(xué)試劑:濾紙 (雙圈定性濾紙)，D－水楊苷 (DSalicin，上海晶純?cè)噭┯邢薰?，對(duì)硝基苯－8－D－纖維二糖苷 (p－NPC，Sigma)，木聚糖 (Xylan from Birchwood，Sigma)，D－木糖 (D－Xylose，Genview)，對(duì)硝基苯酚 (p－NP，Genview)，牛清血蛋白組分 V(BSA，Albumin，F(xiàn)raction V，Genview)，3，5－二硝基水楊酸 (DNS，Genview)，考馬斯亮藍(lán) G－250(Coomassie brilliant blue G －250，Genview)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳白蟻誘導(dǎo)培養(yǎng)

采用蛭石作為保濕材料，用滅菌蒸餾水濕潤(rùn)后均勻鋪到直徑為10 cm的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿放入150頭供試乳白蟻工蟻，加蓋培養(yǎng)。將6種誘導(dǎo)試劑分別配成1% (W/V)濃度溶液，各取約300 μL濕潤(rùn)濾紙，再放入加有白蟻的培養(yǎng)皿中，共六組。將裝有白蟻的培養(yǎng)皿放入28℃恒溫培養(yǎng)箱 (南京實(shí)驗(yàn)儀器廠，WMK－02型)，每天添加一次誘導(dǎo)試劑保持濕潤(rùn)狀態(tài)。在乳白蟻接觸到含有各種誘導(dǎo)試劑的濾紙開始后的4 h、8 h、24 h、2 d、3 d、4 d、6 d和9 d取樣。將乳白蟻腸道解剖成乳白蟻的前腸/唾液腺+中腸及后腸兩部份。前腸/唾液腺+中腸部分用于檢測(cè)白蟻內(nèi)源性糖基水解酶活性變化，后腸部分用于檢測(cè)白蟻共生微生物來(lái)源糖基水解酶活性變化，整頭白蟻酶活力測(cè)定用作指示各種酶活性大小之間的比例變化。以接觸誘導(dǎo)物之前的同批次乳白蟻?zhàn)鳛閰⒄?，參照活性設(shè)定為100% 。

1.2.2 粗酶制備

每次取樣選取各組中活力好的乳白蟻約15頭置于0.9% (W/V)滅菌生理鹽水中反復(fù)漂洗，之后用濾紙吸干表面水分，放入已滅菌的干凈培養(yǎng)皿中。在實(shí)體解剖鏡下將白蟻腸道解剖，分成前腸/唾液腺+中腸和后腸兩部分，與5頭未解剖的乳白蟻共分成3組分別放入裝有500 μL HACNaAC緩沖液 (SAB，0.1 M，pH5.6)的離心管中再轉(zhuǎn)移至玻璃組織勻漿器，冰浴研磨;研磨完畢將勻漿液吸至離心管后定容至 500μL，12000 rpm，4℃冷凍離心 (Sigma，3K15)15 min，取上清，再次12000 rpm，4℃冷凍離心5 min，取上清即為粗酶液于－20℃保存待用。

1.2.3 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行測(cè)定。將粗酶液按一定的比例進(jìn)行稀釋，取50 μL稀釋后粗酶液，加入350 μL考馬斯亮藍(lán)G－250顯色試劑，多功能酶標(biāo)儀595 nm 比色 (PerkinElmer，1420－012 victor3)，測(cè)定OD595，用蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線求蛋白質(zhì)含量。

1.2.4 內(nèi)切－β－1，4－葡聚糖酶，β－葡萄糖苷酶及內(nèi)切－β－1，4－木聚糖酶活力的測(cè)定

內(nèi)切－β－1，4－葡聚糖酶 (EG)，β－葡萄糖苷酶 (BG)以及內(nèi)切 －β－1，4－木聚糖酶(EX)活力的測(cè)定，參照 Miller方法 (Miller，1959)，均采用還原糖法測(cè)定。在1.5 mL離心管中，分別加入120 μL 1%CMC－Na，Salicin，Xylan，預(yù)熱5 min，然后加入酶液 12 μL，37℃ 準(zhǔn)確反應(yīng)60 min，立刻加入120 μL DNS溶液終止反應(yīng)，沸水浴 5 min，冰浴冷卻，540 nm比色，測(cè)定OD540。EG和BG從葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線求得葡萄糖含量，計(jì)算酶活力單位;XE用木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線求木糖含量，計(jì)算酶活力單位。EG，BG，EX酶活力U定義為，每毫克蛋白質(zhì)在37℃，pH=5.6反應(yīng)條件下分解底物，每分鐘可以產(chǎn)生還原糖的量，表示為U/mg。每個(gè)酶切反應(yīng)重復(fù)3次。

1.2.5 FPA濾紙酶活測(cè)定

采用還原糖法測(cè)定，用打孔器將濾紙制作成直徑為5 mm的濾紙片，每個(gè)離心管中放入1份濾紙片，再加入120 μL SAB緩沖液 (pH 5.6)將其浸潤(rùn)。加入酶液 12 μL，37℃ 準(zhǔn)確反應(yīng) 60 min，然后加入120 μL DNS溶液終止反應(yīng)，沸水浴5 min，冰浴冷卻后，540 nm比色，測(cè)定OD540。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線求得葡萄糖含量，酶活力單位計(jì)算同1.2.4。每個(gè)酶切反應(yīng)重復(fù)3次。

1.2.6 纖維二糖水解酶 (CBH)活力測(cè)定

在1.5 mL離心管仲加入120 μL 1 mmol pNPC底物，預(yù)熱5 min，然后加入酶液12 μL，37℃ 準(zhǔn)確反應(yīng)60 min，加入120 μL Na2CO3(0.6mol/L)溶液終止反應(yīng)，405 nm比色，測(cè)定OD405，從p－NP標(biāo)準(zhǔn)曲線求得p－NP含量，計(jì)算酶活力單位。CBH酶活力U定義為:每毫克蛋白質(zhì)在37℃，pH=5.6反應(yīng)條件下分解pNPC，每分鐘可以產(chǎn)生p－NP的量，表示為 U/mg。每個(gè)酶切反應(yīng)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同糖基化合物對(duì)臺(tái)灣乳白蟻內(nèi)源性以及共生微生物來(lái)源的糖基水解酶分泌量的影響

選取用于對(duì)臺(tái)灣乳白蟻進(jìn)行活體誘導(dǎo)的化合物分為2類，第一類為大分子聚合物:木質(zhì)素和羧甲基纖維素鈉，第二類為單糖:山梨糖，果糖，葡萄糖。酶活力測(cè)定結(jié)果表明，這2類物質(zhì)對(duì)乳白蟻后腸共生微生物來(lái)源的糖基水解酶的分泌與它們對(duì)內(nèi)源性糖基水解酶的分泌作用相反。后腸部分:6種化合物對(duì)乳白蟻后腸EG，BG，CBH，EX 4種酶在整個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)起到的基本為抑制分泌的作用，其中對(duì)后腸抑制作用最大的物質(zhì)為果糖及山梨糖，只有 1% 半乳糖 (4 h，135%，0.540 U/mg)對(duì)濾紙分解有微弱的促進(jìn)作用 (圖1 f～j)。前腸/唾液腺+中腸部分:一方面山梨糖和果糖分別是為 EG(6day，126%，1.538 U/mg)與EX(6day，341%，5.146 U/mg)的最佳誘導(dǎo)物，同時(shí)山梨糖對(duì)BG(6day，147%，4.282 U/mg)和EX(6day，258%，3.892 U/mg)，果糖對(duì)CBH(6day，249%，1.128 U/mg)也有較好的誘導(dǎo)效果。另一方面半乳糖和葡萄糖對(duì)內(nèi)源性糖基水解酶促進(jìn)作用不明顯，且在大部分時(shí)間點(diǎn)對(duì)其分泌有抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明大分子物質(zhì)木質(zhì)素對(duì)4種內(nèi)源性水解酶平均促進(jìn)作用最大。它不僅為 FPA (6 day，149%，0.750 U/mg)，BG(6day，178%，5.170 U/mg) 及 CBH(6 day，265%，1.201 U/mg)的最佳誘導(dǎo)物，其次對(duì)EG(6day，122%，1.486 U/mg) 和EX(6day，232%，3.505 U/mg)都具有相對(duì)好的誘導(dǎo)效果。五種酶活測(cè)定指標(biāo)比較，CBH和EX的分泌對(duì)各種糖基化合物作用最為敏感且增幅最大。8個(gè)取樣點(diǎn)內(nèi)各種酶活力在4小時(shí)和第6天有高峰促進(jìn)作用(圖1 a～e)。

圖1 臺(tái)灣乳白蟻腸道不同部位糖基水解酶活性化學(xué)誘導(dǎo)曲線Fig.1 Graphs for chemical induced activity variations of glysosyl hydrolase in different parts of C.formosanus intestine

2.2 糖基化合物對(duì)臺(tái)灣乳白蟻纖維素酶、半纖維素酶之間活性大小比例的影響

選取誘導(dǎo)后4 h(酶活高點(diǎn))、3 d(酶活低點(diǎn))、6 d(酶活高點(diǎn))、9 d(酶活低點(diǎn))的整頭乳白蟻為樣品，測(cè)定4種水解酶活性大小，以未接觸誘導(dǎo)物的同批臺(tái)灣乳白蟻?zhàn)鲗?duì)照。對(duì)整頭白蟻的酶活測(cè)定表明 (圖2)，EX的活力明顯高于其它3種，是總酶活大小變化的主要影響因素。4種酶活力誘導(dǎo)最大值的大小順序?yàn)?EX(6 d，9.356 U/mg) ＞BG(2 d，3.313 U/mg) ＞ EG(2 d，1.541 U/mg) ＞ CBH(6 d，1.476 U/mg)。分泌量有所提高的1% 木質(zhì)素，1%CMC和1%山梨糖樣品其整頭白蟻4種酶活力的低點(diǎn)和高點(diǎn)的酶活大小比例均與對(duì)照白蟻基本一致，即EX:(BG+EG+CBH) 約為 2∶1。

3 結(jié)論與討論

圖2 臺(tái)灣乳白蟻糖基水解酶腸道活性比例分布變化化學(xué)誘導(dǎo)曲線Fig.2 Graphs for chemical induced proportion variations of intestinal glysosyl hydrolase activities of C.formosanus

在T.reesei的纖維素調(diào)控機(jī)制中，T.reesei的生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)條件能夠顯著影響其纖維素和半纖維素酶的產(chǎn)量，碳水化合物及他們的衍生物可以作為誘導(dǎo)物質(zhì)促進(jìn)其大部分纖維素酶的分泌 (Ling et al.，2009)。根據(jù)碳水化合物在細(xì)胞代謝中的一些共同中間產(chǎn)物，本研究選取用于對(duì)臺(tái)灣乳白蟻進(jìn)行活體誘導(dǎo)的化合物包括:代謝起始物質(zhì) (大分子聚合物)木質(zhì)素和羧甲基纖維素鈉;代謝下游產(chǎn)物 (單糖)山梨糖、果糖、葡萄糖和半乳糖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這些糖基化合物對(duì)乳白蟻不用來(lái)源的纖維素酶的分泌起著大相徑庭的作用。

在6種化合物的影響下，乳白蟻后腸4種酶的分泌在8個(gè)取樣點(diǎn)大部分為抑制狀態(tài)，山梨糖和果糖的抑制作用最為明顯，只有半乳糖對(duì)FPA活力有微弱的促進(jìn)作用。而對(duì)于乳白蟻內(nèi)源性糖基水解酶，木質(zhì)素、山梨糖和果糖對(duì)酶的分泌起到了正向的誘導(dǎo)作用。

4種單糖中山梨糖和果糖互為差向異構(gòu)體均為己酮糖，它們與己醛糖葡萄糖、半乳糖對(duì)后腸的作用與其對(duì)前腸/唾液腺+中腸的作用相反。絲狀真菌中葡萄糖作為降解物，可以對(duì)纖維素酶分泌的造成反饋抑制，但是當(dāng)葡萄糖耗盡之后纖維素則可以正常的表達(dá) (Ilmen et al.，1997)。在本實(shí)驗(yàn)中葡萄糖對(duì)乳白蟻木質(zhì)纖維素分泌的抑制作用，很可能也是由于代謝物的反饋抑制作用，半乳糖作為葡萄糖的差向異構(gòu)體而產(chǎn)生了類似的作用。山梨糖在T.reesei中已經(jīng)被證明可以通過(guò)啟動(dòng)子誘導(dǎo)糖基水解酶的分泌 (Ling et al.，2009)，因此同理山梨糖的差像異構(gòu)體果糖也很可能可以產(chǎn)生誘導(dǎo)作用。山梨糖和果糖對(duì)乳白蟻糖基水解酶的分泌表現(xiàn)出的誘導(dǎo)作用，可以則猜測(cè)為其可能擁有類似于T.reesei中控制纖維素酶和半纖維素酶的啟動(dòng)子，這些啟動(dòng)子的上下游序列中存在山梨糖等物質(zhì)的激活位點(diǎn)。但是山梨糖和果糖對(duì)于后腸4種糖基水解酶的強(qiáng)烈抑制作用機(jī)理還需要進(jìn)一步的研究。

木質(zhì)素對(duì)乳白蟻內(nèi)源性糖基水解酶5種酶活力指標(biāo)的平均促進(jìn)作用最大。木質(zhì)素是一種高度分支的由多種芳香族羧酸組成的高分子物質(zhì)，性質(zhì)穩(wěn)定降解緩慢 (Xie et al.，2000)。木質(zhì)素通常在細(xì)菌或真菌的氧化酶作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榉辑h(huán)自由基和醌類才能進(jìn)一步分解，而纖維素的降解產(chǎn)物可以為木質(zhì)素的降解提供還原力 (Sewalt et al.，1996)。雖然木質(zhì)素代謝與乳白蟻纖維素、半纖維素酶分泌之間的關(guān)系目前未見報(bào)道，但是Tartar等(2009)研究表明黃胸散白蟻Reticulitermes flavipes的酚氧化酶幾乎全部來(lái)源于前腸和唾液腺，而且喂食木質(zhì)素可以提高酚氧化酶的活性。結(jié)合本研究結(jié)果，木質(zhì)素的作用機(jī)制可能為，由木質(zhì)素作為一種間接促進(jìn)酚氧化酶分泌的化學(xué)信號(hào)，刺激糖基水解酶分泌用來(lái)降解纖維素，從而產(chǎn)生各種代謝物質(zhì)來(lái)直接誘導(dǎo)分解木質(zhì)素的酚氧化酶的生產(chǎn)，即相當(dāng)于提高了糖基水解酶的分泌量。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示乳白蟻CBH和EX的分泌對(duì)各種糖基化合物作用最為敏感，其次為BG，以EG最不敏感，且后腸EG抑制最為強(qiáng)烈。所測(cè)定的乳白蟻4種糖基水解酶中，EX的活力明顯高于其它三種，4種酶的大小順序?yàn)镋X ＞BG＞EG＞CBH。到目前為止，乳白蟻CBH的基因只在后腸的共生鞭毛蟲中發(fā)現(xiàn)，而本實(shí)驗(yàn)中乳白蟻內(nèi)源性CBH活性在接觸誘導(dǎo)物后出現(xiàn)了大量的提高，因此推測(cè)乳白蟻是有可能存在自身基因組編碼的CBH基因。木質(zhì)素和半纖維素可以形成致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，包圍和加固纖維素與半纖維素骨架，將纖維素成份緊密的包埋起來(lái) (Yu，2008)，所以EX的大量分泌是木制纖維素代謝的基礎(chǔ)。當(dāng)EX分泌大量增加時(shí)，從木質(zhì)纖維素中釋放出大量纖維素，纖維素的結(jié)晶部份需要經(jīng)過(guò)CBH的作用才能繼續(xù)被EG和BG分解，這是其中一種可能的解釋。因此EX的分泌量的增大伴隨著CBH分泌量的相應(yīng)提高，而BG和EG則由于處于代謝產(chǎn)物反饋調(diào)節(jié)中更加下游的位置使得其誘導(dǎo)不明顯或出現(xiàn)抑制作用。同時(shí)在對(duì)T.reesei cbh1啟動(dòng)子的研究中發(fā)現(xiàn)，cbh1啟動(dòng)子上游區(qū)域存在葡萄糖抑制位點(diǎn)，可以在槐糖山梨糖醇的培養(yǎng)基中強(qiáng)烈誘導(dǎo)cbh1基因 (Takashima et al.，1996;Ilmen et al.，1996)。在本實(shí)驗(yàn)中葡萄糖和山梨糖對(duì)CBH也出現(xiàn)了相應(yīng)的抑制和誘導(dǎo)作用，那么乳白蟻中是否存在類似與cbh1基因的調(diào)節(jié)機(jī)制還需要大量的基礎(chǔ)研究工作。

此外，8個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)內(nèi)各種酶活力均沒有呈現(xiàn)規(guī)律性的變化，只在4 h和6 d兩個(gè)取樣點(diǎn)有高峰促進(jìn)作用。有研究表明，真菌纖維素酶的誘導(dǎo)合成與誘導(dǎo)物的濃度密切相關(guān) (Sun，2007)，因此誘導(dǎo)物對(duì)白蟻木質(zhì)纖維素酶分泌的誘導(dǎo)作用的波動(dòng)，可能反映了實(shí)際起作用的誘導(dǎo)物濃度的變化，相關(guān)的影響因子有待進(jìn)一步研究。

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