包埋載辛伐他汀PLGA微球的膠原/殼聚糖支架的制備及其生物相容性研究

李昱張占召吳鼎宇李倩楠耿英楠曹誼林劉偉張文杰周廣東王賢松張智勇

·論著·

包埋載辛伐他汀PLGA微球的膠原/殼聚糖支架的制備及其生物相容性研究

李昱張占召吳鼎宇李倩楠耿英楠曹誼林劉偉張文杰周廣東王賢松張智勇

目的構(gòu)建一種具有緩釋辛伐他汀功能的膠原/殼聚糖復(fù)合支架（SIM/COL/CS），并評估其生物相容性。方法聯(lián)合應(yīng)用復(fù)乳溶劑揮發(fā)法和凍干技術(shù)，制備SIM/COL/CS支架。電鏡觀察支架的表面形態(tài)，紫外光分度法測量支架中藥物的緩釋速率。分別利用CCK-8（Cell Counting Kit 8）法和死活細(xì)胞染色，檢測接種在支架上的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）的增殖和活性。利用堿性磷酸酶（ALP）定量分析和茜素紅染色，檢測支架對BMSCs成骨分化的影響。結(jié)果SIM/COL/CS支架為層狀多孔結(jié)構(gòu)，PLGA微球與支架基質(zhì)緊密結(jié)合。支架中的SIM能夠以穩(wěn)定的速率持續(xù)釋放，釋放時間達(dá)27 d以上。CCK-8檢測顯示，在實驗的第1、3、5天，COL/CS組和SIM/COL/CS組的細(xì)胞數(shù)量無差異；在第7天，SIM/COL/CS組的細(xì)胞數(shù)量顯著高于COL/CS組。死活細(xì)胞染色顯示，COL/CS組和SIM/COL/CS組中的細(xì)胞均有良好的活性，較少出現(xiàn)凋亡。此外，SIM/COL/CS組的ALP活性和鈣沉積也顯著高于COL/CS組。結(jié)論聯(lián)合應(yīng)用復(fù)乳溶劑揮發(fā)法和凍干技術(shù)，可成功制備能夠緩釋SIM的膠原/殼聚糖支架，這種新型支架可顯著促進(jìn)BMSC的增殖和成骨分化，在骨組織工程研究中具有廣闊的應(yīng)用前景。

辛伐他汀聚乳酸-羥基乙酸共聚物膠原殼聚糖骨組織工程

盡管人體骨組織具有一定的再生能力，但對于因腫瘤、手術(shù)和外傷等原因造成的大面積骨組織缺損，自體的修復(fù)效果十分有限。目前，全世界每年有超過200萬例矯形手術(shù)需要使用骨移植材料[1]。臨床常用的骨移植材料有自體骨、同種異體骨和異種骨。自體骨不存在免疫排斥，且含有豐富干細(xì)胞和生長因子，具有非常顯著的骨修復(fù)效果。但是，自體骨移植會引起供區(qū)并發(fā)癥，如疼痛、感染及局部功能異常等，且可取材部位和取材量有限[2]。同種異體骨移植和異種骨移植的成骨活性較差，且具有傳播病原體的風(fēng)險[3-4]。骨組織工程研究為解決臨床大面積骨缺損修復(fù)提供了新的可能性[5]。本實驗利用復(fù)乳溶劑揮發(fā)法和凍干技術(shù)，制備載辛伐他汀的膠原/殼聚糖（SIM/COL/CS）復(fù)合骨移植材料，并在體外檢測了其生物相容性和成骨活性，以期為修復(fù)大面積骨缺損提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

PLGA（濟(jì)南岱罡生物工程有限公司）；二氯甲烷、乙腈、氯化十六烷吡啶溶液（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；LIVE/DEAD染液（Thermo公司，美國）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco公司，美國）。

掃描電鏡（Hitachi公司，日本）；低溫離心機(jī)、CO2培養(yǎng)箱、紫外分光光度儀、酶標(biāo)儀（Thermo公司，美國），冷凍干燥機(jī)（上海億倍實業(yè)有限公司）；熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）。

1.2 實驗方法

1.2.1 載藥PLGA微球的制備

本實驗采取復(fù)乳溶劑揮發(fā)法制備載SIM的PLGA微球。首先，稱量420 mg PLGA和21 mg SIM，溶解于6 mL二氯甲烷中。然后，超聲震蕩混合液30 sec，靜置30 min，再將混合液緩慢滴入含3% PVA的水溶液中，室溫下持續(xù)攪拌6 h。待微球固化，去離子水沖洗PLGA微球3次，離心法收集PLGA微球，并將其在-80℃中預(yù)凍2 h，冷凍干燥24 h。

1.2.2 載藥膠原/殼聚糖支架的制備

本實驗采取冷凍干燥法制備膠原/殼聚糖支架。首先，稱取100 mg膠原（COL）和100 mg殼聚糖（CS），溶解于10 mL 1%醋酸水溶液中。然后，將7 mg載SIM的PLGA微球加入COL/CS混合液中，并充分?jǐn)嚢琛Ｕ婵粘槲旌弦?0 min以除去混雜的氣泡，將混合液在-80℃預(yù)凍2 h，真空干燥24 h。

1.2.3 藥物釋放曲線

將1 μg SIM溶于1 mL色譜級乙腈中，充分振蕩溶解，使用紫外光分度儀進(jìn)行全波段掃描，以確定其吸收峰。將含SIM的COL/CS支架置于10 mL離心管中，并加入2 mL新鮮的PBS緩沖液，然后將離心管放于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中（37℃，100 r/min）。分別在1、3、5、7、12、17、22、27 d從試管中取出1 mL PBS溶液，與1 mL新鮮的PBS溶液混合，使用紫外分光度法于236 nm處測量PBS溶液中SIM濃度。

1.2.4 電鏡掃描

將樣本在液氮中浸泡20 sec，然后迅速用手術(shù)刀片將樣本切為厚度為1 mm左右的薄片。使用導(dǎo)電雙面膠帶將薄片狀的樣本粘在銅柱上，噴金1 min。最后，將噴金后的樣本置于掃描電鏡下觀察。

1.2.5 細(xì)胞培養(yǎng)

大鼠BMSC取自出生5 d的Wistar大鼠。大鼠處死后浸泡于75%乙醇中30 min，然后PBS中浸泡10 min。于超凈臺中鈍性分離大鼠股骨，并將其兩端切去。使用完全培養(yǎng)基（含89%DMEM，10%胎牛血清，1%雙抗）將大鼠骨髓沖洗到培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿置于恒溫37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.6 細(xì)胞增殖

支架以環(huán)氧乙烷消毒，置24孔板中，將50 μL（5×104個）細(xì)胞懸液輕輕滴加在支架上，在培養(yǎng)箱中孵育1 h，然后將50 μL（5×104個）細(xì)胞懸液輕輕滴加在支架的另一面。在1、3、5、7 d，將支架轉(zhuǎn)移到新的24孔板中，用PBS沖洗支架3遍，再將支架轉(zhuǎn)移到96孔板中，加入110 μL CCK-8工作液，并在培養(yǎng)箱中孵育1 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長測量CCK-8工作液的吸光度。

1.2.7 細(xì)胞活性

使用同步驟1.2.6相同的方法，將細(xì)胞接種到支架上，培養(yǎng)7 d后，將支架轉(zhuǎn)移到新的24孔板中，用PBS沖洗支架3遍，將支架浸沒在1 mL LIVE/ DEAD染液中，避光孵育10 min，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.8 堿性磷酸酶活性檢測

以6×104cells/cm2的密度將BMSCs接種于6孔板中，每個培養(yǎng)孔中加入2 mL成骨誘導(dǎo)液，然后將含有支架的transwells小室（8 μm孔徑）輕輕放入培養(yǎng)孔中。在第7、14、21天，使用堿性磷酸酶定量試劑盒檢測堿性磷酸酶活性。

1.2.9 茜素紅染色

按照步驟1.2.8中的方法培養(yǎng)細(xì)胞，21 d后，用PBS沖洗細(xì)胞3遍，將細(xì)胞在4%多聚甲醛溶液中固定30 min，用去離子水沖洗細(xì)胞3遍，向每孔中加入2 mL茜素紅染液并孵育10 min，再用去離子水沖洗細(xì)胞3遍。

在上述6孔板中加入10%氯化十六烷吡啶溶液，均勻振蕩培養(yǎng)板30 min，然后吸出混合液，使用酶標(biāo)儀在562 nm波長測量混合液的吸光度。

1.3 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 微球形態(tài)

制備的載SIM的PLGA微球在肉眼下呈白色粉末狀（圖1A）。電鏡下，載SIM的PLGA微球為規(guī)則的圓球狀，表面光滑（圖1B）。使用動態(tài)光分散法測得微球的粒徑分布范圍為4～35 μm（圖1C）。

2.2 支架形態(tài)

凍干的COL/CS支架和SIM/COL/CS支架均為規(guī)則的圓柱狀（圖2A、2B）。電鏡下，COL/CS支架和SIM/COL/CS支架均呈現(xiàn)層狀多孔結(jié)構(gòu)（圖2C、2D）；PLGA微球均勻分布于SIM/COL/CS支架的孔隙中，并與支架基質(zhì)緊密結(jié)合在一起。

2.3 藥物緩釋

使用紫外光分度儀對SIM溶液進(jìn)行全波段掃描，測得其在230 nm、236 nm和245 nm處有較強的吸收峰，并以236 nm處的吸收峰最為明顯，因而本實驗選擇在236 nm處測量SIM的吸光度（圖3A）。釋放曲線顯示，實驗的前7 d，SIM釋放速率較快，此后21 d，SIM釋放速率較平緩，整體上藥物釋放曲線接近零級動力學(xué)特征（圖3B）。

2.4 支架對細(xì)胞增殖和細(xì)胞活性的影響

將大鼠BMSC以相同密度接種在COL/CS支架和SIM/COL/CS支架上，CCK-8法分別在第1、3、5、7天檢測細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示，在第1、3、5天，COL/CS組和SIM/COL/CS組的細(xì)胞增殖量沒有顯著性差異；在第7天，SIM/COL/CS組的細(xì)胞增殖量顯著高于COL/CS組（圖4A）。LIVE/DEAD染色顯示，COL/CS支架和SIM/COL/CS支架表面具有大量的活細(xì)胞（綠色），而死細(xì)胞（紅色）則較少（圖4B）。2.5支架對細(xì)胞成骨分化的影響

為了評估支架的成骨作用，分別使用ALP定量分析和茜素紅染色檢測BMSC的成骨分化。ALP定量分析顯示，在第7天，COL/CS組和SIM/COL/CS組ALP活性沒有顯著性差異；在第14、21天，SIM/ COL/CS組的ALP活性顯著高于COL/CS組（圖5A）。茜素紅染色及其定量分析也說明，在第21天SIM/COL/CS組的鈣沉積量顯著高于COL/CS組（圖5B，C）。

圖1 載SIM的PLGA微球的形貌特征Fig.1 Morphology characterization of the SIM-loaded PLGA microspheres

圖2 COL/CS支架和SIM/COL/CS支架的形貌特征Fig.2 Morphology characterizations of the COL/CS and SIM/COL/CS scaffolds

圖3 SIM的紫外吸收光譜和SIM/COL/CS支架的藥物緩釋特性Fig.3 The UV absorption spectroscopy of SIM and drug release property of the SIM/COL/CS scaffold

圖4 COL/CS支架和SIM/COL/CS支架的生物相容性評估（*：P＜0.05）Fig.4 Biocompatibility evaluation of the COL/CS and SIM/ COL/CS scaffolds(*:P＜0.05)

圖5 COL/CS和SIM/COL/CS支架的骨誘導(dǎo)評估（*：P＜0.05）Fig.5 Evaluation of the osteoinductive activity of the COL/CS and SIM/COL/CS scaffolds(*:P＜0.05)

3 討論

殼聚糖是廣泛存在于自然界中的一種甲殼素脫乙?；苌?，殼聚糖可以在人體內(nèi)被殼聚糖酶和氨基葡萄糖苷酶分解為葡萄糖[6]。膠原是一種在人體內(nèi)含量十分豐富的物質(zhì)，約占人體全身蛋白含量的25%～35%，是構(gòu)成骨、軟骨和結(jié)締組織的非常重要的成分[7]。殼聚糖具有較強的生物強度和較慢的降解速率，而膠原則具有很好的生物相容性，將其混合可以充分利用兩者各自的優(yōu)勢[8]。研究表明，膠原/殼聚糖復(fù)合支架能更有效地促進(jìn)BMSC的黏附、增殖和成骨分化[9-10]。

SIM是羥甲基戊二酞輔酶A還原酶的特異性抑制劑，常用于降低內(nèi)源性膽固醇的合成[11]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，SIM除了具有降低血脂的作用，還可以通過多種途徑促進(jìn)骨再生[12]。Yamashita等[13]指出，SIM可以誘導(dǎo)Smad 1、2、5磷酸化，逆轉(zhuǎn)腫瘤壞死因子（TNF）對BMP-2的抑制作用，進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和成熟。Takenaka等[14]通過大量實驗研究發(fā)現(xiàn)，SIM能以劑量依賴的方式促進(jìn)VEGF的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)血管化及骨再生。Ayukawa等[15]發(fā)現(xiàn)，SIM可以通過抑制Src和刺激絲裂原活化蛋白激酶/蛋白激酶B通路，以抑制破骨細(xì)胞分化，增加局部骨量。

本實驗中，我們使用復(fù)乳溶劑揮發(fā)法將SIM包裹于PLGA微球中，并將含有SIM的PLGA微球與COL/CS支架復(fù)合，得到了一種具備長期緩釋SIM能力的功能性支架。復(fù)乳溶劑揮發(fā)法是一種簡便、高效和成熟的制備載藥PLGA微球的方法[16]，本實驗所制備的載藥微球具有規(guī)整的外表形態(tài)，以及良好的粒徑分布（4～35 μm），且其平均粒徑（19 μm）大于10 μm，可以避免被巨噬細(xì)胞直接吞噬，使微球可以在體內(nèi)長期釋放藥物[17]。將PLGA微球與COL/CS支架復(fù)合后，PLGA微球仍保持著良好的表面形貌，并可在長達(dá)27 d的時間內(nèi)將SIM以相對恒定的速率釋放出來，可有效避免藥物暴釋而造成的細(xì)胞損傷。

為了研究SIM/COL/CS支架的生物相容性，我們將BMSC接種到膠原/殼聚糖復(fù)合支架。CCK-8測試和LIVE/DEAD細(xì)胞染色表明，SIM/COL/CS支架不僅沒有細(xì)胞毒性，還能顯著促進(jìn)BMSC的增殖。這可能與SIM加速干細(xì)胞分裂的能力有關(guān)。為了研究SIM/COL/CS支架的成骨誘導(dǎo)作用，我們又進(jìn)行了ALP定量分析和茜素紅染色。ALP活性與干細(xì)胞早期成骨分化密切相關(guān)，而茜素紅染色則可以揭示干細(xì)胞在成骨分化晚期所形成的鈣結(jié)節(jié)的數(shù)量[18]。實驗結(jié)果表明，SIM/COL/CS支架在早期和晚期都可以顯著促進(jìn)BMSCs的成骨分化。由此可見，SIM/COL/ CS支架具有良好的生物相容性和很強的成骨作用，可作為一種很好的骨缺損修復(fù)材料及骨組織工程支架材料，具有廣闊的應(yīng)用前景。

[1]Hollister SJ.Porous scaffold design for tissue engineering[J].Nat Mater,2005,4(7)：518-524.

[2]Damien CJ,Parsons JR.Bone graft and bone graft substitutes：a review of current technology and applications[J].J Appl Biomater, 1991,2(3)：187-208.

[3]Kretlow JD,Young S,Klouda L,et al.Injectable biomaterials for regenerating complex craniofacial tissues[J].Adv Mater,2009,21 (32-33)：3368-3393.

[4]Quarto R,Mastrogiacomo M,Cancedda R,et al.Repair of large bone defects with the use of autologous bone marrow stromal cells[J].N Engl J Med,2001,344(5)：385-386.

[5]Wang J,Wu D,Zhang Z,et al.Biomimetically ornamented rapid prototyping fabrication of an apatite-collagen-polycaprolactone composite construct with nano-micro-macro hierarchical structure for large bone defect treatment[J].ACS Appl Mater Interfaces, 2015,7(47)：26244-26256.

[6]Baty AR,Eastburn CC,Techkarnjanaruk S,et al.Spatial and temporal variations in chitinolytic gene expression and bacterial biomass production during chitin degradation[J].Appl Environ Microbiol,2000,66(8)：3574-3585.

[7]Ferreira AM,Gentile P,Chiono V,et al.Collagen for bone tissue regeneration[J].Acta Biomater,2012,8(9)：3191-3200.

[8]Wang X,Wang G,Liu L,et al.The mechanism of a chitosancollagen composite film used as biomaterial support for MC3T3-E1 cell differentiation[J].Sci Rep,2016,6：39322.

[9]Wang C,Xie XD,Huang X,et al.A quantitative study of MC3T3-E1 cell adhesion,morphology and biomechanics on chitosancollagen blend films at single cell level[J].Colloids Surf B Biointerfaces,2015,132：1-9.

[10]Wang L,Stegemann JP.Thermogelling chitosan and collagen composite hydrogels initiated with beta-glycerophosphate for bone tissue engineering[J].Biomaterials,2010,31(14)：3976-3985.

[11]Thomopoulos C,Skalis G,Michalopoulou H,et al.Effect of lowdensity lipoprotein cholesterol lowering by ezetimibe/simvastatin on outcome incidence：overview,meta-analyses,and metaregression analyses of randomized trials[J].Clin Cardiol,2015,38 (12)：763-769.

[12]Moshiri A,Sharifi AM,Oryan A.Role of Simvastatin on fracture healing and osteoporosis：a systematic reviewoninvivo investigations[J].Clin Exp Pharmacol Physiol,2016,43(7)：659-684.

[13]Yamashita M,Otsuka F,Mukai T,et al.Simvastatin antagonizes tumor necrosis factor-alpha inhibition of bone morphogenetic proteins-2-induced osteoblast differentiation by regulating Smad signaling and Ras/Rho-mitogen-activated protein kinase pathway [J].J Endocrinol,2008,196(3)：601-613.

[14]Takenaka M,Hirade K,Tanabe K,et al.Simvastatin stimulates VEGF release via p44/p42 MAP kinase in vascular smooth muscle cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2003,301(1)：198-203.

[15]Ayukawa Y,Yasukawa E,Moriyama Y,et al.Local application of statin promotes bone repair through the suppression of osteoclasts and the enhancement of osteoblasts at bone-healing sites in rats [J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod,2009,107 (3)：336-342.

[16]Waeckerle-Men Y,Groettrup M.PLGA microspheres for improved antigen delivery to dendritic cells as cellular vaccines[J].Adv Drug Deliv Rev,2005,57(3)：475-482.

[17]Minardi S,Corradetti B,Taraballi F,et al.Biomimetic concealing of PLGA microspheres in a 3D scaffold to prevent macrophage uptake[J].Small,2016,12(11)：1479-1488.

[18]Shen X,Zhang Y,Gu Y,et al.Sequential and sustained release of SDF-1 and BMP-2 from silk fibroin-nanohydroxyapatite scaffold for the enhancement of bone regeneration[J].Biomaterials,2016, 106：205-216.

Fabrication and Biocompatibility Evaluation of Collagen/Chitosan Scaffolds Embedded with Simvastatin-Loaded PLGA MicrospheresLI Yu1,2,ZHANG Zhanzhao1,2,WU Dingyu1,2,LI Qiannan1,2,Geng Yingnan1,2,CAO Yilin1,2,LIU Wei1,2,

ZHANG Wenjie1,2,ZHOU Guangdong1,2,WANG Xiansong1,2,ZHANG Zhiyong1,2,3．1 Department of Plastic and Reconstructive Surgery;2 Shanghai Key Laboratory of Tissue Engineering,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China;3 Centre for regenerative medicine and 3D printing,Guangzhou Medical University,Guangzhou 510150,China.Corresponding author:ZHANG Zhiyong(E-mail:Drzhiyong@126.com).

ObjectiveTo prepare a collagen/chitosan scaffold incorporating simvastatin-loaded PLGA microspheres(SIM/ COL/CS),which can release simvastatin(SIM)in a sustained manner,and investigate the biocompatibility of the scaffold. MethodsCollagen/chitosan scaffolds incorporating SIM-loaded PLGA microspheres were prepared by combining freezedrying technology and emulsion-solvent evaporation method.The morphology and drug release profile of the scaffolds were characterized by scanning electron microscope and ultraviolet spectrophotometry respectively.The effects of the composite scaffold on the proliferation and viability of the rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells(BMSCs)were assessed by Cell Counting Kit 8(CCK-8)and Live/Dead cell imaging kit separately.The osteoinductive effect of the scaffold on BMSCs was evaluated by alkaline phosphatase(ALP)activity assay and alizarin red S staining.ResultsThe composited scaffolds exhibited an interconnected porous structure and the PLGA microspheres were tightly integrated within the matrix.Besides,the SIM exculpated in the scaffold was released in a sustained manner for up to 27 days.CCK-8 assay showed that although there was no difference in cell number between the COL/CS and SIM/COL/CS groups on days 1,3 and 5,cell number in the SIM/COL/CS group was significantly higher than that in the COL/CS group on day 7.Live/dead cell staining indicated the viability of the BMSCs on both COL/CS and SIM/COL/CS were good and few dead cells(red)was found. Moreover,both of the ALP activity and calcium deposit in the SIM/COL/CS group were significantly higher than those in the COL/CS group.ConclusionCOL/CS scaffolds containing SIM-loaded PLGA microspheres for controlled SIM delivery can be successfully prepared by combining freeze-drying technology and emulsion-solvent evaporation method.The novel SIM-loaded COL/CS scaffold can promote both the proliferation and osteogenic differentiation of BMSCs and has great application potentials in bone repair.

Simvastatin;PLGA;Collagen;Chitosan;Bone tissue engineering

R318.08

A

1673－0364（2017）02－0061－05

2017年2月16日；

2017年3月12日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2017.02.001

中組部青年千人計劃；國家自然科學(xué)基金（81371964，81572137，81101353）。

200011上海市上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院整形修復(fù)外科（李昱，張占召，吳鼎宇，李倩楠，耿英楠，曹誼林，劉偉，張文杰，周廣東，王賢松，張智勇）；上海市組織工程重點實驗室（李昱，張占召，吳鼎宇，李倩楠，耿英楠，曹誼林，劉偉，張文杰，周廣東，王賢松，張智勇）；510150廣州市廣州醫(yī)科大學(xué)再生醫(yī)學(xué)與3D打印技術(shù)轉(zhuǎn)化研究中心（張智勇）。

張智勇（E-mail：Drzhiyong@126.com）。