綿羊冷凍精液研究進(jìn)展

陳世偉，權(quán)　凱，張兆旺

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，蘭州730070；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，鄭州 450000）

綿羊冷凍精液研究進(jìn)展

陳世偉1，權(quán)凱2，張兆旺2

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，蘭州730070；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，鄭州 450000）

隨著肉羊產(chǎn)業(yè)化、工廠化的發(fā)展，冷凍精液人工授精技術(shù)亟待應(yīng)用于生產(chǎn)中。綿羊精液冷凍保存技術(shù)雖然得到了快速發(fā)展，但目前仍處在試驗研究或小范圍的應(yīng)用階段。因此，綿羊精液冷凍技術(shù)還需要深入、系統(tǒng)的研究。文章從綿羊精液冷凍保存稀釋液中的添加劑、冷凍速率、冷凍-解凍對綿羊冷凍精液品質(zhì)的影響，精液輸精對受胎率的影響等方面進(jìn)行了綜述，為精液冷凍保存研究提供一定參考。

綿羊；冷凍精液；添加劑；受胎率

綿羊精液冷凍保存技術(shù)對綿羊人工授精、育種和遺傳資源保護(hù)方面具有重大意義。自從1949年，Polge等發(fā)現(xiàn)了甘油的冷凍保護(hù)特性后，家畜冷凍精液研究和應(yīng)用得到迅速的發(fā)展，尤其是在乳牛上的應(yīng)用效果已同鮮精無明顯差異。然而該技術(shù)在羊的應(yīng)用方面依然受到很大的限制。目前，綿羊冷凍精液人工授精情期受胎率低的問題仍然沒有得到解決。本文對綿羊精液冷凍保存方面的最新研究進(jìn)展加以綜述，旨在對今后精液冷凍保存研究工作提供一定的參考。

1　稀釋液中添加劑對綿羊冷凍精液品質(zhì)的影響

1.1冷凍精液稀釋液中添加維生素對綿羊冷凍精液品質(zhì)的影響

綿羊冷凍精液稀釋液中添加一些維生素，對冷凍保存的精液品質(zhì)有一定提高作用。羅海玲等［1］研究發(fā)現(xiàn)，添加維生素E可降低冷凍對精子頂體的損害程度，提高精液品質(zhì)。古蘭白爾·木合塔爾等［2］在和田羊精液冷凍稀釋液中添加不同濃度的維生素E，發(fā)現(xiàn)添加量為1.2 mg/mL時精子解凍后活率（43.56%）顯著高于對照組（34.14%）和其他各添加組（P＜0.05）。說明在冷凍精液稀釋液中添加適當(dāng)濃度維生素E可減緩冷凍對精子的傷害，提高冷凍-解凍后精子活率，改善冷凍精液品質(zhì)。

哈福等［3］研究表明，在綿羊凍精稀釋液中添加復(fù)合維生素B可有效提高凍精解凍后活率并保護(hù)精子形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性。陳亞明［4］發(fā)現(xiàn)，VE、VB6和VB12能顯著提高冷凍-解凍精子的活率，VE和VB6對解凍精子頂體保護(hù)效果較好，能提高精子的生存指數(shù)，并且VE、VB6和VB12有降低精漿中GOT、LDH和ALP活性釋放量的作用。說明冷凍精液稀釋液中添加維生素對精子有一定的保護(hù)作用。

1.2冷凍保護(hù)劑對綿羊冷凍精液品質(zhì)的影響

冷凍精液中添加不同的冷凍保護(hù)劑，同一保護(hù)劑不同量對綿羊冷凍精液品質(zhì)有一定影響。研究表明，用乙二醇作為冷凍保護(hù)劑解凍后的活力較高，效果顯著，達(dá)0.43±0.028，并且在冷凍稀釋液中添加了EDTA和Tris對精子有良好的保護(hù)性［5］。王立強(qiáng)等［6］將6%甘油作為小尾寒羊冷凍精液保護(hù)劑效果較理想。程彩虹等［7］發(fā)現(xiàn)，冷凍稀釋液中添加5.0 mmol/L的半胱氨酸可有效保護(hù)精子免受過氧化物的損害。龍翔等［8］對不同冷凍保護(hù)劑在豬精液冷凍中的作用分析后發(fā)現(xiàn)，在常溫下對精子毒害作用最大的是DMSO，其次是甘油，EG和DMA對精子毒害作用最小，但這些物質(zhì)對綿羊精液的毒性試驗報道較少，還有待進(jìn)一步試驗。

各種冷凍保護(hù)劑雖能在冷凍過程中起到保護(hù)作用，在精液冷凍稀釋液中添加甘油、乙二醇等冷凍保護(hù)物質(zhì)可以減少精子在冷凍過程中受到的損傷，同時，這些冷凍保護(hù)劑又有不同程度的毒害作用，對精子存在一定的毒性作用。因此，選擇適宜的冷凍保護(hù)劑和最佳的添加量，對精液的冷凍保存效果有直接的影響。從目前研究現(xiàn)狀來看，甘油、乙二醇依然是精液冷凍保存的首選，6%甘油添加劑量應(yīng)用最多。

2　pH值和滲透壓對綿羊冷凍精液品質(zhì)的影響

稀釋液的pH值和滲透壓是影響精液保存效果的主要因素之一。張建軍等［9］研究發(fā)現(xiàn)，稀釋液中基礎(chǔ)液pH值為7.2時精液冷凍效果最好，精子在pH值為6.6～6.8時運動比較旺盛，能量消耗過快，導(dǎo)致平衡解凍后精子活力較低，因此，pH值高于6.8時，精液冷凍效果較好。劉福元等［10］研究了薩福克羊精液低溫液態(tài)保存效果時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)稀釋液pH值接近綿羊精液pH值（7.0～7.2）時，保存效果最好。

劉福元等［10］發(fā)現(xiàn)，稀釋液的滲透壓為340 mOsm/L時，精子有效存活時間、存活時間和生存指數(shù)最高，以滲透壓358 mOsm/L為標(biāo)準(zhǔn)，稀釋液的滲透壓越接近于綿羊精液的滲透壓，保存效果越好。張兆旺等［11］在低溫下保存雞的精液時也發(fā)現(xiàn)，稀釋液的滲透壓和雞精液的滲透壓一致時精子的保存效果最佳。說明只有使精細(xì)胞處在一個相對穩(wěn)定、適宜的環(huán)境中，其代謝才能正常進(jìn)行，綿羊冷凍精液稀釋液的滲透壓為358 mOsm/L，與綿羊精液的滲透壓一致時，冷凍保存效果最好。

3　冷凍速率對綿羊冷凍精液品質(zhì)的影響

3.1平衡方法對綿羊精子冷凍后活率的影響

不同平衡方法對精子活率及生存指數(shù)有明顯影響。陳亞明等［12］發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用200 mL38℃體積水浴2.5 h降溫到4℃的平衡方法對冷凍精子的活率、生存指數(shù)、頂體完整率（P＜0.05）提高明顯。于明舉等［13］研究表明，平衡時間對解凍后綜合指數(shù)影響差異顯著（P＜0.05），平衡4 h效果優(yōu)于1 h和2 h。趙有璋等［14］對綿山羊顆粒凍精品質(zhì)優(yōu)化試驗后得出，優(yōu)化的冷凍工藝是1:2稀釋，4 h降溫，滴凍成0.2 mL大小的顆粒，37℃VB12解凍。鄧雯等［15］發(fā)現(xiàn)，精液冷凍水浴平衡降溫速率前30 min，降溫速率應(yīng)控制在0.73～0.74℃/min之間，30～90 min降溫速率應(yīng)控制在0.11～0.12℃/min之間；并且250 mL水浴平衡時的降溫時間3 h時對精子造成的冷打擊最小，制作的凍精解凍后的精子品質(zhì)最高。由此看出，200～250 mL水浴平衡2.5～4 h時可以在一定程度上提高精液品質(zhì)。

3.2初凍溫度對綿羊精子冷凍后活率的影響

初凍溫度是影響精子冷凍后活率的一個重要因素。賴彥等［16］通過液氮熏蒸將初凍溫度控制在-80℃可以使綿羊情期受胎率提高0.9～1.7個百分點。吳云海等［17］采用初凍溫度為-120℃，入氮溫度為-110℃的冷凍方法進(jìn)行荷斯坦種公牛精液細(xì)管的冷凍，能明顯提高凍后精子的活力，縮短制凍時間，提高工作效率。張曉霞等［18］發(fā)現(xiàn)，牛細(xì)管冷凍精液的最佳始凍溫區(qū)為-84～-112℃。由此可見，選擇一個好的初凍溫度是精液是否能夠冷凍成功的重要因素之一。對于綿羊精液冷凍最佳的初凍溫度，還需進(jìn)一步試驗。

4　冷凍-解凍對綿羊冷凍精液品質(zhì)的影響

不同解凍方式、解凍溫度和解凍液對綿羊顆粒冷凍精液品質(zhì)都有影響。張子軍等［19］發(fā)現(xiàn)，在管壁薄、顆粒數(shù)多、濕解凍、水浴溫度42～45℃和VB12解凍液條件下解凍后效果較好。哈福等［20］表明，不同解凍溫度對精子活力有極顯著影響，在42℃解凍的精子解凍后活力最高，達(dá)0.40±0.02。徐振軍等［21］的研究結(jié)果表明，從液氮中取出細(xì)管精液，迅速投入39～40℃水浴中，停留10～15 s取出，解凍后活率最高達(dá)0.53。說明在冷凍精液解凍過程中，解凍溫度為40～42℃以及必要時采用維生素B12解凍液對提高綿羊冷凍精液品質(zhì)具有重要作用。

5　綿羊冷凍精液輸精方法對受胎率的影響

輸精方法對綿羊凍精人工授精受胎率有直接的影響。劉桂娟［22］研究表明，綿羊腹腔鏡子宮內(nèi)冷凍精液輸精的情期受胎率68.90%，要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于陰道子宮頸口輸精的情期受胎率32.97%，兩種方法輸精效果差異極顯著（P＜0.01）；并且綿羊情期每只輸精總次數(shù)與年份因素對綿羊冷凍精液人工授精的受胎率沒有顯著影響（P＜0.05）。李煥玲等［23］研究了不同輸精方法和輸精次數(shù)對綿羊冷凍精液受精率的影響后發(fā)現(xiàn)，子宮角輸精法情期受胎率（59.32%）比過頸輸精法（42.31%）提高17.01個百分點，差異極顯著（P＜0.01）；輸精3次的受胎率（33.33%）比輸精2次的受胎率（27.78%）提高5.55個百分點，差異顯著（P＜0.05）。石國慶等做了綿羊腹腔內(nèi)窺鏡子宮角深部冷凍精液輸精試驗后發(fā)現(xiàn)，采用人用黃體酮、PMSG對綿羊進(jìn)行同期發(fā)情處理，46只綿羊48 h同期發(fā)情率95.65%（44/46），用解凍后活力僅0.2的冷凍精液，借助腹腔內(nèi)窺鏡子宮角深部輸精，情期受胎率72.73%（32/44），與常規(guī)冷凍精液輸精的情期受胎率55.45%（178/321）相比，高出17.78個百分點，差異極顯著（P＜0.01）。盧景郁等［24］對綿羊冷凍精液進(jìn)行深部輸精后發(fā)現(xiàn)，在發(fā)情后24～36 h輸精2次，間隔8～12 h，可提高凍精受胎率。表明腹腔鏡輸精子宮內(nèi)的受胎率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他輸精方式的受胎率。目前，腹腔鏡輸精已廣泛應(yīng)用于人工授精技術(shù)當(dāng)中，并獲得了良好的受胎率。

6　其他因素對綿羊冷凍精液人工授精的影響

另外，品種、飼養(yǎng)管理水平、輸精時間、輸精劑量等均對綿羊冷凍精液人工授精技術(shù)有一定影響。劉玉峰等［25］對綿羊不同發(fā)情方式的不同輸精時間進(jìn)行研究證明，自然發(fā)情、誘導(dǎo)發(fā)情、同期發(fā)情的綿羊子宮頸口輸精在發(fā)情后24 h內(nèi)輸精效果較好。誘導(dǎo)發(fā)情與同期發(fā)情母羊的腹腔鏡輸精，應(yīng)該在撤栓后54 h與60 h進(jìn)行，受胎效果較好。發(fā)情母羊子宮內(nèi)輸精的輸精范圍應(yīng)該在發(fā)情結(jié)束前2～3 h，也就是排卵前2～3 h，輸精效果較好。有研究表明，綿羊不同的膘情體況、年齡、胎次、輸精方式、季節(jié)、產(chǎn)羔后再次輸精間隔時間、輸精人員、公羊等相關(guān)因素也會影響陰道子宮頸口與腹腔鏡子宮內(nèi)輸精效果（P＜0.05），且呈顯著相關(guān)性［22］。不同品種的公羊精液品質(zhì)也不盡相同。楊凌等［26］研究了綿羊不同品種細(xì)管冷凍精液試驗后發(fā)現(xiàn)，細(xì)管凍精解凍后活率以黑薩福克羊活率最高，與杜泊羊和特克塞爾羊相比差異顯著（P＜0.05），其他品種之間相比差異不顯著（P＞0.05）。后來發(fā)現(xiàn)綿羊凍精品質(zhì)與其在當(dāng)?shù)氐倪m應(yīng)性有一定的相關(guān)性。

冷凍精液（特別是顆粒精液）解凍時，要嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行，解凍后一定要鏡檢，精子活力達(dá)0.3以上才能輸精。母羊發(fā)情排卵要求對母羊進(jìn)行合理的飼養(yǎng)管理，維持其適當(dāng)?shù)谋烨?，對于有生殖疾病的母羊要及時檢查治療。改善生活環(huán)境，給予適當(dāng)?shù)膽敉饣顒雍凸庹眨瑢δ秆虻陌l(fā)情排卵、受精和妊娠是重要的。清潔消毒時不要造成精液污染，輸精槍和開膣器用完后，要用酒精燈火焰消毒，再用生理鹽水棉球擦凈晾干 （馮國權(quán)等，2002）。

［1］羅海玲，賈志海，朱士恩，等.稀釋液中添加維生素E對綿羊冷凍精液品質(zhì)的影響［J］.中國畜牧雜志，2004（11）：9-11，52.

［2］古蘭白爾·木合塔爾,吳海榮，艾合買提江·吐爾遜，等.稀釋液中添加維生素E對和田羊冷凍精液品質(zhì)的影響［J］.黑龍江動物繁殖，2013（1）：9-11.

［3］哈福，趙有璋.綿羊冷凍精液稀釋液中添加復(fù)合維生素B提高凍精解凍后品質(zhì)的研究［J］.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2003（1）：17-19，46.

［4］陳亞明.綿羊精液超低溫冷凍程序及稀釋液優(yōu)化方法的研究［D］.蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2002.

［5］烏蘭托婭.綿羊細(xì)管冷凍精液稀釋液的研究［D］.呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

［6］王立強(qiáng)，陳輝，馬健.小尾寒羊精液冷凍技術(shù)研究［J］.畜牧獸醫(yī)雜志，2004（1）：11-13.

［7］程彩虹，岳文斌，任有蛇，等.稀釋液中添加半胱氨酸對綿羊冷凍精液品質(zhì)的影響［J］.中國草食動物，2012，32（1）：29-31.

［8］龍翔，邰秀林.不同冷凍保護(hù)劑在豬精液冷凍中的作用分析［J］.畜禽業(yè)，1999（9）：18-19.

［9］張建軍，楊軍祥，茍想珍，等.綿羊精子的生物學(xué)特性及其不同因素對精子活力的影響［J］.當(dāng)代畜牧，2007（12）：29-31.

［10］劉福元，陳玲香，楊永林，等.薩?？搜蚓旱蜏匾簯B(tài)保存效果的研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（25）：10887-10889.

［11］張兆旺，劉麗霞.稀釋液溶質(zhì)、滲透壓、pH值和緩沖指數(shù)與低溫保存雞精液效果的關(guān)系［J］.中國家禽，2004（21）：13-16.

［12］陳亞明，趙有璋.綿羊冷凍精液平衡方法研究［J］.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2002（3）：346-350.

［13］于明舉，王嶺斌，羅艷梅，等.山羊夏季精液品質(zhì)分析及冷凍方法優(yōu)化［J］.中國畜牧雜志，2009（17）：19-22.

［14］趙有璋，陳亞明，孫照剛，等.提高綿、山羊顆粒凍精品質(zhì)的研究［J］.中國草食動物，2003，23（1）：3-5.

［15］鄧雯，禹學(xué)禮，龐有志，等.綿羊精液平衡過程中降溫速率對精子品質(zhì)的影響［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2010（4）：109-112.

［16］賴彥，劉麗娜，呂瀟瀟，等.道賽特綿羊細(xì)管冷凍精液商品化研究［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2010（20）：65-67.

［17］吳云海，馬亞賓，劉廷玉，等.兩種不同冷凍方法對荷斯坦種公牛細(xì)管凍精活力的影響［J］.今日畜牧獸醫(yī)，2006（7）：7-8.

［18］張曉霞，吳慶榮，張海濤，等.應(yīng)用混沌、孤立子理論驗證微型細(xì)管牛冷凍精液最佳始凍溫區(qū)［C］//第六屆全國低溫生物醫(yī)學(xué)及器械學(xué)術(shù)大會論文集.北京：中國制冷學(xué)會第六專業(yè)委員會，2009：5.

［19］張子軍，趙有璋.不同解凍方式、解凍溫度和解凍液對綿羊顆粒冷凍精液品質(zhì)的影響［J］.中國草食動物，2005，25（1）：61.

［20］哈福，趙有璋.在綿羊冷凍精液解凍液中添加復(fù)合VB提高凍精解凍后品質(zhì)的研究［J］.中國草食動物，2003，23（5）：19-20.

［21］徐振軍，閆長亮，郭成，等.小尾寒羊精液保存技術(shù)研究［J］．中國畜牧雜志，2006，42（21）：9-11．

［22］劉桂娟.綿羊冷凍精液人工授精及影響受胎率相關(guān)因素的研究［D］.沈陽：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

［23］李煥玲，王金文，王德芹，等.不同輸精方法和輸精次數(shù)對綿羊冷凍精液受精率的影響［J］.當(dāng)代畜牧，2006（4）：26-27.

［24］盧景郁，黃賀，田亞光，等.綿羊冷凍精液深部輸精效果觀察［J］.黑龍江動物繁殖，2005（4）：44.

［25］劉玉峰.綿羊子宮內(nèi)輸精技術(shù)的研究［D］.沈陽：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.

［26］楊凌，張樂穎，王貴江，等.綿羊不同品種細(xì)管冷凍精液試驗［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2006（6）：28-30.

Recent Advances in Sheep Semen Cryopreservation

Chen Shiwei1，Quan Kai2，ZhangZhaowang2
（1.College ofAnimal Science and Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.Henan UniversityofAnimal Husbandryand Economy，Zhengzhou 450000，China）

With the development ofmutton-sheep industrialization，the application ofartificial insemination with frozen semen became urgent.Although there was a rapid development in the sheep frozen-semen storage technology，it was still in the stage ofexperiment or application in a small scale.Therefore，sheep frozen-semen technologyalsoneed tobe researched in depth systematically.In this paper，the effect ofdilute additive，freezingrate and frozen-thawed on sheep frozen semen and the effect of artificial insemination on the conception rates ofsheep were discussed，in order toprovide a reference for further study.

sheep；frozen semen；additive；conception rate

S826.3

A

2095-3887（2014）06-0056-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.06.017

2014-09-03

陳世偉（1989-），男，碩士研究生。

權(quán)凱（1977-），男，博士。研究方向：動物繁殖與肉羊生產(chǎn)。