卵巢移植技術(shù)及其應(yīng)用研究進(jìn)展＊

彭南妮，袁安文，鄒紅艷，吳方貴，許學(xué)嵐，薛立群

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院與動(dòng)物科技學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128；2.廣東省深圳市第五人民醫(yī)院生殖中心，廣東深圳 518001）

卵巢是動(dòng)物和人類雌性個(gè)體的重要生殖器官，具有產(chǎn)生卵子和分泌性激素等主要功能。卵巢功能的嚴(yán)重?fù)p害將導(dǎo)致雌性喪失繁殖后代的能力。隨著動(dòng)物及人類輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，特別是卵巢冷凍保存、卵母細(xì)胞體外成熟與受精等技術(shù)的完善，卵巢移植技術(shù)與之相結(jié)合，已取得突破性進(jìn)展，正在成為保存和延續(xù)雌性個(gè)體生殖能力的一項(xiàng)重要技術(shù)。

卵巢移植技術(shù)的研究早在19世紀(jì)60年代初就已開始，1896年Knauer首次在動(dòng)物中成功地進(jìn)行了自體卵巢移植。1906年Carrel等采用血管吻合方法進(jìn)行卵巢移植，使移植卵巢存活并成功創(chuàng)立了器官移植血管吻合技術(shù)。隨后人們相繼在大鼠、小鼠、兔、羊、豬、獼猴和人等成功進(jìn)行了卵巢移植，開創(chuàng)了卵巢自體原位移植，自體異位移植，同種異體移植和異種移植等技術(shù)，在生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和瀕危動(dòng)物種質(zhì)資源的搶救及保護(hù)方面顯示出良好的應(yīng)用前景。

1 卵巢移植技術(shù)

1.1 自體原位移植

卵巢自體原位移植（orthotopic autograft）是將摘除后保存的卵巢或卵巢組織自體移植到卵巢正常解剖部位的一種方法，主要用于防止因嚴(yán)重疾病或腫瘤治療對(duì)卵巢或卵巢功能的損傷，在尚未累及卵巢之前，將卵巢摘除和冷凍保存，病愈后進(jìn)行原位移植，避免癌癥女性患者因放療和化療而喪失生育能力和性激素分泌功能，使其仍可恢復(fù)自然妊娠生育，重新獲得自身的生育能力。

目前卵巢自體原位移植主要采用非血管吻合的方式，通過腹腔手術(shù)或腹腔鏡手術(shù)將凍融卵巢皮質(zhì)組織塊植入卵巢囊或卵巢系膜內(nèi)。卵巢移植體在移植部位建立血供后可恢復(fù)卵泡發(fā)育與性激素分泌功能，且因靠近輸卵管傘部也有利于排出卵子的撿拾，移植受體可望恢復(fù)自然生育能力，實(shí)現(xiàn)自然妊娠，或結(jié)合體外受精輔助生殖技術(shù)繁育后代。Gosden R G等［1］將凍融的綿羊卵巢組織進(jìn)行自體原位移植，成功分娩羊羔。Donnez J等［2］報(bào)道一位自體原位移植凍融卵巢組織的婦女3個(gè)月后卵巢組織開始恢復(fù)其功能，出現(xiàn)卵泡發(fā)育、血清雌激素含量升高，患者再現(xiàn)卵巢周期，實(shí)現(xiàn)了自然妊娠并產(chǎn)下健康嬰兒。多個(gè)臨床應(yīng)用研究在體外受精技術(shù)的輔助下，利用自體原位移植卵巢組織腔卵泡的卵母細(xì)胞，也成功產(chǎn)下健康嬰兒［3－4］。此外，一位自體原位移植凍融卵巢組織的婦女，在第一次通過體外受精實(shí)現(xiàn)妊娠并產(chǎn)下女嬰后，再次實(shí)現(xiàn)自然妊娠，產(chǎn)出健康嬰兒［5］。這些臨床應(yīng)用研究結(jié)果表明，卵巢自體原位移植可成為救助女性生殖能力的有效方法，使患者恢復(fù)自然生育能力。但是，因移植手術(shù)引起的輸卵管阻塞、手術(shù)后組織粘連等因素可影響受體的自然妊娠。

1.2 自體異位移植

卵巢自體異位移植（heterotopic autograft）是將卵巢或卵巢組織移植到自體其他部位。移植部位通常選擇在皮下、腎囊下、肌肉、腹膜和網(wǎng)膜等。與原位移植相比，選擇皮下和肌肉等淺表部位進(jìn)行卵巢移植，具有移植手術(shù)相對(duì)簡(jiǎn)單且容易對(duì)移植體進(jìn)行監(jiān)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，但需要輔助體外受精技術(shù)實(shí)現(xiàn)妊娠生育。在臨床研究中，人們對(duì)自體異位移植卵巢或卵巢組織的功能恢復(fù)情況進(jìn)行了觀察和檢驗(yàn)。早期人們采用顯微血管吻合方法將卵巢移植入患者前臂皮下，1年后從移植卵巢中采集到成熟卵子，患者恢復(fù)并維持規(guī)律性卵巢周期超過1年時(shí)間。同樣，采用簡(jiǎn)便的非血管吻合方法將卵巢皮質(zhì)組織自體植入病人的的前臂皮下，10周后卵巢移植體有卵泡發(fā)育，連續(xù)18個(gè)月有優(yōu)勢(shì)卵泡形成，并產(chǎn)生成熟卵母細(xì)胞。Laufer M R等［6］對(duì)患癌癥的小女孩進(jìn)行了卵巢自體異位移植效果追蹤調(diào)查，確認(rèn)移植卵巢維持長(zhǎng)達(dá)12年～15年的性激素分泌。同樣，Igarashi S等［7］選擇在腹膜和網(wǎng)膜部位對(duì)短尾猴卵巢皮質(zhì)組織進(jìn)行自體移植，也實(shí)現(xiàn)了卵巢功能的恢復(fù)，經(jīng)超數(shù)排卵和顯微注射受精處理獲得成熟卵子和囊胚。Oktay K等［8］將患者冷凍保存的卵巢組織移入自體腹部皮下，3個(gè)月后移植卵巢組織恢復(fù)卵泡發(fā)育并產(chǎn)生雌激素，經(jīng)卵子體外受精后獲得早期胚胎，并在后期的臨床研究中實(shí)現(xiàn)妊娠生育，產(chǎn)下健康嬰兒［9］。然而，與自體原位移植相比較，自體異位移植的效果似乎更多受局部環(huán)境的影響［10］。

1.3 同種異體移植

同種異體移植（allograft）包括同種異基因移植（allograft）和同種同基因移植（syngraft），前者是指同一動(dòng)物種屬內(nèi)遺傳背景不同個(gè)體間的移植；后者是指遺傳背景完全相同個(gè)體間（同卵孿生子或近交系動(dòng)物）的移植。同種異體移植使得移植受體可以利用同種群體的卵巢資源實(shí)現(xiàn)妊娠與生育，對(duì)滿足特定個(gè)體生育要求以及挽救瀕危動(dòng)物物種具有特殊意義。在卵巢同種異體移植中，同基因移植通常不引發(fā)排斥反應(yīng)，可在單合子雙生姐妹間進(jìn)行。Donnez J等［11］對(duì)發(fā)生卵巢早衰的特納綜合征（Turner syndrome）患者進(jìn)行了卵巢移植，在植入單合子雙生姐妹供體卵巢皮質(zhì)組織后3個(gè)月，卵巢移植體恢復(fù)功能，并在出現(xiàn)規(guī)則卵巢周期7個(gè)月后受體患者自然妊娠并生育一健康女嬰。Silber S J等［12］報(bào)道，進(jìn)行了新鮮或凍融卵巢組織移植的10對(duì)單合子雙生姐妹，移植受體全部恢復(fù)了卵巢周期和排卵，其中6例自然受孕，并產(chǎn)下2個(gè)健康嬰兒。臨床研究中異基因移植一般需要考慮移植受體對(duì)供體卵巢移植物的排斥反應(yīng)。有報(bào)道認(rèn)為，卵巢并非免疫特惠器官，卵巢異體移植需要配合長(zhǎng)期免疫抑制劑處理［13］。Pullium J K等［14］對(duì)6只白細(xì)胞抗原相同的一窩青年母犬進(jìn)行了卵巢異體移植并使用免疫抑制劑，術(shù)后這些母犬經(jīng)歷了初次發(fā)情，出現(xiàn)每年兩次的正常發(fā)情周期和相應(yīng)的孕酮水平升高，配種后有母犬受孕。Donnez J等［15］發(fā)現(xiàn)，在白細(xì)胞抗原（HLA）配型完全相同的非單合子雙生姐妹間進(jìn)行過骨髓移植的受體，形成完全供體嵌合體，再次接受同一供體的卵巢移植時(shí)，即使在不使用免疫抑制劑的情況下也不發(fā)生排斥反應(yīng)，卵巢可在移植3.5個(gè)月后恢復(fù)卵巢周期活動(dòng)和雌激素分泌。

在不同部位進(jìn)行卵巢同種異體移植的效果比較中，Soleimani R等［16］利用小鼠模型確認(rèn)，選擇背部肌肉部位移植要優(yōu)于腎囊下移植，可以獲得更多的新生血管支持，有較多原始卵泡存活。

1.4 異種移植

卵巢異種移植（xenotransplantation）指不同種屬個(gè)體間的卵巢移植，可以通過冷凍卵巢組織異種移植獲得成熟卵母細(xì)胞，產(chǎn)生體外受精的新生個(gè)體，對(duì)保護(hù)和利用瀕危物種的卵巢組織具有特殊意義。研究表明，異種移植卵巢或卵巢組織可在異種雌性甚至雄性動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育，卵巢原始卵泡不僅可以發(fā)育到有腔卵泡，而且還可獲得生長(zhǎng)發(fā)育卵母細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)體外成熟、體外受精和胚胎發(fā)育，代替體外長(zhǎng)期培養(yǎng)體系［17］。

由于受種間組織的免疫排斥反應(yīng)的限制，卵巢異種移植主要選用免疫缺陷動(dòng)物作為移植受體，如裸鼠、重癥聯(lián)合免疫缺陷鼠、非肥胖糖尿病－重癥聯(lián)合免疫缺陷鼠（NOD－SCID）等。Weissman A 等［18］將人卵巢組織植入NOD－SCID鼠皮下，2周后在74%的卵巢移植體中觀察到卵泡，12周后51%的卵巢移植體在外源促性腺激素的刺激下出現(xiàn)卵泡生長(zhǎng)和腔卵泡。Moniruzzaman M等［19］對(duì)植入SCID鼠的仔豬凍融卵巢組織進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)卵巢原始卵泡在移植2個(gè)月后可發(fā)育至次級(jí)卵泡并伴有卵子的生長(zhǎng)發(fā)育。Kaneko H等［20］將仔豬卵巢組織植入免疫缺陷鼠腎囊下，并在陰道分泌物中發(fā)現(xiàn)有角質(zhì)上皮細(xì)胞后按3個(gè)組分別用5單位eCG處理10、30、60d，結(jié)果顯示，移植45d～70d后各試驗(yàn)組的受體鼠都開始發(fā)生陰道上皮角質(zhì)化并有少量腔卵泡發(fā)育，但僅從60deCG處理組小鼠獲得大量體積完全增大的卵母細(xì)胞，且抑制素總水平在各組中最高；其中17%的卵母細(xì)胞經(jīng)體外成熟培養(yǎng)發(fā)育成熟，釋放出第一極體。Snow M等［21］將小鼠卵巢異種移入裸體雌性大鼠腎囊下，21d后采集到生發(fā)泡時(shí)期卵母細(xì)胞和擴(kuò)展的顆粒細(xì)胞－卵母細(xì)胞復(fù)合體，經(jīng)體外成熟培養(yǎng)和受精后進(jìn)行2細(xì)胞胚胎移植，成功產(chǎn)下健康仔鼠。

卵巢異種移植可選用不同部位進(jìn)行，常見的移植部位包括腹膜內(nèi)、卵巢囊、腎囊下、肌肉內(nèi)和 皮下。由于不同研究結(jié)果的差異，目前對(duì)最適宜的移植部位尚缺乏同一的認(rèn)識(shí)。Dath C等［22］應(yīng)用免疫組化方法對(duì)植入4個(gè)不同部位（腹膜內(nèi)、卵巢囊、皮下和肌肉）的凍融卵巢組織進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)植入后3周肌肉部位的卵巢組織發(fā)生間質(zhì)纖維化的程度低于其他部位。一般認(rèn)為，移植后卵巢組織的存活及其功能恢復(fù)狀況與卵巢組織的血管新生及血液再灌注有關(guān)，受移植部位生理環(huán)境影響。Eyck等在對(duì)植入裸鼠腹膜內(nèi)凍融卵巢組織的觀察中發(fā)現(xiàn)，移植后3d卵巢組織塊的周邊出現(xiàn)受體鼠的新生血管和血液灌注，10d時(shí)血液灌注和血管化過程明顯增強(qiáng)，卵巢組織塊在中心部位出現(xiàn)明顯的血管再形成和血液灌注［23］。Soleimani R等［24］對(duì)人凍融卵巢組織植入SCID鼠背部肌肉和腎囊下的效果進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)植入背部肌肉的卵巢組織在血管發(fā)生和腔卵泡的發(fā)育方面更為突出，并能夠從更多的發(fā)育卵泡中獲得第二次減數(shù)分裂中期的成熟卵子。移植體的血管化作用與卵泡大小相關(guān)，F(xiàn)SH可刺激微血管和大的腔卵泡的形成，并從生長(zhǎng)卵泡中獲得第二次減數(shù)分裂中期的成熟卵子。

2 卵巢移植技術(shù)的應(yīng)用前景

2.1 在人類生殖醫(yī)學(xué)的應(yīng)用

在人類醫(yī)學(xué)中，由于遺傳、感染、自身免疫性疾病及醫(yī)源性因素等造成的卵巢功能早衰，放療及大劑量全身化療對(duì)女性癌癥患者卵巢功能的損害，使得患者甚至青年女性和兒童承受喪失生育能力的風(fēng)險(xiǎn)，保存卵巢功能和生育能力成為許多患者的愿望。隨著卵巢移植技術(shù)的發(fā)展以及與輔助生殖技術(shù)的結(jié)合，卵巢自體原位和異位移植、卵巢異體移植已在臨床中應(yīng)用，以挽救卵巢功能早衰和癌癥患者的卵巢功能和生育能力。直至目前，臨床中應(yīng)用新鮮或凍存卵巢及卵巢組織移植，已使多位患者實(shí)現(xiàn)生育，成功產(chǎn)下健康嬰兒，其中一位患者先后二次受孕和分娩。這些成功例證充分顯示了卵巢移植技術(shù)在生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用價(jià)值和潛力。

2.2 稀有及瀕危哺乳動(dòng)物卵巢資源的保護(hù)與利用

卵巢移植技術(shù)在稀有及瀕危動(dòng)物的保護(hù)和卵巢生殖細(xì)胞資源的利用中具有重要應(yīng)用價(jià)值。大多數(shù)動(dòng)物在出生前后，有大量原始卵泡在卵巢組織中形成和儲(chǔ)備，進(jìn)入成年繁殖期后僅有一小部分被利用。因此，從不同年齡階段甚至新近死亡的雌性個(gè)體獲得的卵巢組織，可以通過冷凍保存技術(shù)和移植技術(shù)得到充分利用。卵巢組織移植后，可從發(fā)育的生長(zhǎng)卵泡中獲取成熟卵母細(xì)胞，經(jīng)體外成熟培養(yǎng)、體外受精（IVF）或胞質(zhì)內(nèi)精子注射（ICSI）生產(chǎn)胚胎，繁育后代。相關(guān)的技術(shù)研究已逐步由小型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（小鼠、大鼠、兔等）和家畜（豬、牛、羊等）擴(kuò)展至多種馴養(yǎng)動(dòng)物（狨、獼猴、短尾猴、大象、袋熊和小袋鼠等）。卵巢組織異體移植技術(shù)和異種移植技術(shù)的發(fā)展和完善，將為稀有及瀕危哺乳動(dòng)物的保護(hù)和利用提供新的方法和手段。

此外，卵巢移植技術(shù)還可用于一些生育力低、不育、絕育的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)動(dòng)物的繁殖。由于這類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自身生殖力低，可通過卵巢移植技術(shù)，利用具有正常繁殖力的相同品系個(gè)體為移植受體實(shí)現(xiàn)快速繁殖后代，擴(kuò)大轉(zhuǎn)基因動(dòng)物群體。在轉(zhuǎn)基因小鼠的繁殖中這一技術(shù)已得到成功應(yīng)用，已經(jīng)有C57BL／6小鼠、綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠等通過新鮮或凍存卵巢異體原位移植后成功產(chǎn)仔［25］。劉英等［26］將PCR陽(yáng)性SV40T轉(zhuǎn)基因雌鼠卵巢移植到FVB雌鼠卵巢囊內(nèi)，也成功繁殖后代，后代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性率達(dá)到25.4%?；蚯贸碾s合子小鼠卵巢經(jīng)玻璃化冷凍保存后異體原位移植亦成功獲得其后代。

2.3 用于建立卵巢卵泡發(fā)育研究模型

卵巢移植技術(shù)作為建立動(dòng)物模型的新方法已應(yīng)用于卵泡發(fā)育的研究。利用卵巢移植動(dòng)物模型，人們可以容易觀察和檢測(cè)卵巢組織的功能活動(dòng)，研究不同階段卵泡發(fā)育的調(diào)控機(jī)制，評(píng)價(jià)不同方法對(duì)卵巢冷凍保存的效果等。在實(shí)踐中人們可以根據(jù)研究需要選擇雌性受體動(dòng)物進(jìn)行自體異位移植、異體移植或異種移植，也可采用雄性受體動(dòng)物進(jìn)行卵巢移植。相關(guān)研究結(jié)果顯示，在雄性受體鼠中胎鼠和新生鼠卵巢具有與雌性受體中相似的生長(zhǎng)發(fā)育能力，雄性個(gè)體可以提供卵巢及卵泡生長(zhǎng)發(fā)育所需的基本生理環(huán)境［27］。

研究表明，移植卵巢組織在完成血液循環(huán)重建之前，經(jīng)歷了組織缺血過程，使得移植卵巢中的生長(zhǎng)卵泡退化，僅能維持原始卵泡生存。基于這一特點(diǎn)人們可以利用卵巢移植動(dòng)物模型研究原始卵泡募集過程的生理調(diào)節(jié)機(jī)理，并驗(yàn)證了FSH對(duì)早期卵泡發(fā)育的調(diào)節(jié)作用。建立這樣的動(dòng)物模型，可能對(duì)進(jìn)一步研究調(diào)控早期卵泡發(fā)育的局部因子和其他內(nèi)分泌因素，確定發(fā)育關(guān)鍵點(diǎn)，設(shè)計(jì)出符合早期卵泡和卵母細(xì)胞發(fā)育生理要求的培養(yǎng)體系都具有積極意義。

劉利兵等［28］利用家免角膜板層內(nèi)植入自體卵巢的方法，建立了角膜培養(yǎng)卵巢皮質(zhì)組織的動(dòng)物模型。該研究報(bào)道，卵巢組織可在眼角膜內(nèi)成活，使用雌激素后能夠直接觀察到卵巢組織的外觀形態(tài)變化，可作為一種較好的研究模型用于評(píng)價(jià)藥物對(duì)卵巢組織的作用效應(yīng)。此外，凍融卵巢組織的移植，也被普遍用于卵巢組織冷凍保存方法的評(píng)價(jià)，檢驗(yàn)卵巢組織冷凍保存后的卵泡生長(zhǎng)發(fā)育能力。

3 影響卵巢移植效果的主要因素

3.1 缺血對(duì)移植卵巢的損傷

缺血對(duì)移植卵巢的損傷主要發(fā)生在非血管吻合方式的卵巢移植。移植卵巢在血管再生之前的缺血期里，易受到活性氧分子攻擊，產(chǎn)生缺血再灌注損傷（ischaemia－reperfusion injury），引起卵巢細(xì)胞凋亡，甚至卵巢組織發(fā)生壞死。移植后缺血使得移植卵巢中生長(zhǎng)卵泡很少有存活，存活的主要是原始卵泡。如何使卵巢組織的血管快速重建，盡可能地縮短缺血時(shí)間是移植后卵巢組織存活的關(guān)鍵。

目前減少缺血損傷的方法主要有：①使用抗氧化劑如維生素E、β－巰基乙醇或枸杞多糖等，減少過氧化物等活性氧分子的攻擊，減少卵泡的損失；②將卵巢組織移植到肉芽組織，加快移植體血管再生，提高卵泡存活率；③使用血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）等提高血管再生速度；④使用外源性促性腺激素刺激血管生長(zhǎng)因子，如VEGF、TGF等的合成，誘導(dǎo)和促進(jìn)新血管的形成，減輕局部缺血缺氧的發(fā)生。但這些方法不能完全解決卵巢移植技術(shù)中的缺血損害問題，要進(jìn)一步提高移植卵巢存活率，有效保存移植卵巢生殖內(nèi)分泌機(jī)能，還需更多地研究解決這一問題的方法，減少缺血對(duì)移植卵巢的損傷。

3.2 免疫排斥反應(yīng)的影響

異體卵巢移植后引起的免疫排斥反應(yīng)有急性排斥反應(yīng)和慢性排斥反應(yīng)兩種。急性排斥反應(yīng)與主要組織相容性復(fù)合物（MHC）有關(guān)，常使卵巢移植體難以存活。慢性排斥反應(yīng)一般發(fā)生在移植后一年左右，主要表現(xiàn)為卵巢移植體功能減退，卵巢間質(zhì)和血管發(fā)生纖維化，最終導(dǎo)致卵巢移植體功能喪失。有人用免疫抑制劑環(huán)孢素A（CsA）抑制免疫排斥反應(yīng)，認(rèn)為能改善移植卵巢的存活率，還能促進(jìn)移植后卵巢的功能恢復(fù)。一般認(rèn)為腎是相對(duì)免疫缺陷區(qū)，選擇腎囊下進(jìn)行卵巢組織移植，可減輕免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生。一些研究表明，移植前進(jìn)行卵巢移植物的組織培養(yǎng)，能降低移植物的免疫原性，使移植后的免疫排斥反應(yīng)減輕，更有利于提高移植物的臨床移植效果。移植前進(jìn)行組織抗原配型通?？梢詼p低免疫排斥反應(yīng)，有益于移植卵巢的存活和功能的恢復(fù)。免疫排斥反應(yīng)是影響異體移植成功的一個(gè)主要因素，如何降低其影響，維持移植卵巢長(zhǎng)期存活并具有功能，還有待進(jìn)一步研究。

3.3 冷凍保存對(duì)移植卵巢的損傷

卵巢組織冷凍保存技術(shù)已取得顯著進(jìn)展，但冷凍方法仍對(duì)卵巢組織有一定損傷［29－30］。與新鮮卵巢移植相比，冷凍卵巢移植體的卵泡發(fā)育數(shù)量一般少于新鮮卵巢移植體。這可能與降溫冷凍過程中細(xì)胞內(nèi)冰晶形成和鹽類的沉積對(duì)細(xì)胞造成的損傷有關(guān)。為減少凍融過程對(duì)卵巢組織的損傷，仍有待于選擇理想的冷凍保護(hù)劑和改進(jìn)冷凍保存方法。隨著冷凍生物技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，卵巢冷凍保存效率也必將不斷提高，卵巢移植技術(shù)也將更具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

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