油菜中轉(zhuǎn)基因成分的篩查檢測(cè)策略

劉 冰

(1.陜西省種子管理站，西安 710018；2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)作物種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(西安) ，西安 710018)

油菜屬于十字花科蕓薹屬，是重要的油料作物和優(yōu)質(zhì)的蛋白飼料作物，也是轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用較多的農(nóng)作物[1]。從 1996- 2015年的 20 a間，全球轉(zhuǎn)基因作物累計(jì)種植面積達(dá)20億hm2，其中轉(zhuǎn)基因油菜累計(jì)種植面積達(dá)到1億hm2，僅次于大豆、玉米和棉花[2]。轉(zhuǎn)移到油菜中的外源基因至少有50個(gè)，目標(biāo)性狀主要涉及抗除草劑、雜交系統(tǒng)(雄性不育/恢復(fù))、抗蟲和種子成分改變(如改變種子脂肪酸構(gòu)成、改變蛋白質(zhì)構(gòu)成等)等[3]。截至2017年3月，全球商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因油菜轉(zhuǎn)化事件有24個(gè)[4-6]。中國(guó)尚未批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因油菜的商業(yè)化種植，但已批準(zhǔn)7個(gè)轉(zhuǎn)基因油菜的轉(zhuǎn)化事件作為加工用途進(jìn)口[7]，分別為孟山都公司的GT73( RT73) 和拜爾公司的MS1RF1、MS1RF2、MS8RF3、OXY235、T45和Topas19/2。

中國(guó)每年需要進(jìn)口大量油菜籽用于加工食用油。 按照《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》及配套辦法的規(guī)定，農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物從試驗(yàn)研究、種子品種審定、生產(chǎn)、銷售、田間種植到農(nóng)產(chǎn)品加工消費(fèi)和進(jìn)出口貿(mào)易等諸多環(huán)節(jié)都要采取嚴(yán)格的安全控制措施[8]。實(shí)現(xiàn)對(duì)這些環(huán)節(jié)的全覆蓋監(jiān)管，就需要加大轉(zhuǎn)基因抽查檢測(cè)的力度，從大量的非轉(zhuǎn)基因油菜樣品中快速、準(zhǔn)確地篩查出個(gè)別的轉(zhuǎn)基因樣品[9]。

轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品分子檢測(cè)主要包括DNA檢測(cè)和蛋白質(zhì)檢測(cè)，基于DNA 的PCR檢測(cè)技術(shù)在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中應(yīng)用最廣。其中PCR篩查法是以幾個(gè)使用頻率最高的遺傳元件作為檢測(cè)靶標(biāo)，如果檢測(cè)出其中任何一個(gè)元件，表明該樣品含有轉(zhuǎn)基因成分；如果未檢出，則表明樣品中不含有已知轉(zhuǎn)基因成分[9-10]。該方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，可檢出的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化事件多，也是中國(guó)種子檢測(cè)機(jī)構(gòu)普遍使用的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)方法。

目前，關(guān)于轉(zhuǎn)基因油菜篩查檢測(cè)的報(bào)道多以中國(guó)批準(zhǔn)進(jìn)口的7個(gè)轉(zhuǎn)基因油菜的轉(zhuǎn)化事件為檢測(cè)目標(biāo)[10-13]，而全球商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因油菜轉(zhuǎn)化事件有24個(gè)，檢測(cè)覆蓋面明顯不足。本研究檢索已知24個(gè)商業(yè)化轉(zhuǎn)基因油菜的常用轉(zhuǎn)化遺傳元件信息，根據(jù)不同元件的使用頻率建立轉(zhuǎn)基因油菜的篩查檢測(cè)策略，同時(shí)確定轉(zhuǎn)基因油菜篩查的靶標(biāo)元件和檢測(cè)方法，并利用農(nóng)業(yè)部農(nóng)作物種子質(zhì)量監(jiān)督測(cè)試中心(西安)保存的9個(gè)轉(zhuǎn)化事件對(duì)方法的特異性和靈敏度進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材 料

轉(zhuǎn)基因油菜粉末Oxy235、Topas19/2、T45、MS1RF1、MS1RF2、MS8RF3、GT73、MON88302、MS8xRF3xRT73，非轉(zhuǎn)基因油菜種子‘秦榮6號(hào)’，由農(nóng)業(yè)部農(nóng)作物種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(西安)收藏。

新型植物基因組提取試劑盒(DP320) 購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。PCR擴(kuò)增試劑(Premix ExTaq，R003A)、DNA分子質(zhì)量Marker(DL1000,3591A)購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。擴(kuò)增引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取 樣品基因組DNA提取采用試劑盒法，提取方法參照試劑盒說明。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA樣品的完整性。

1.2.2 定性PCR檢測(cè) 定性PCR使用ABI 2720 PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)項(xiàng)目包括CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、bar基因、pat基因、 CP4-epsps基因、NPTII基因6個(gè)靶標(biāo)原件。定性PCR 的引物及擴(kuò)增程序等反應(yīng)條件參照農(nóng)業(yè)部相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(表1)。

表1 檢測(cè)中所用的引物序列、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度及檢測(cè)依據(jù)Table 1 Primers,amplicon and reference

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因油菜的遺傳信息及篩查策略

檢索環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心轉(zhuǎn)基因作物數(shù)據(jù)庫(CERA,http: ∥www.cera-gmc.org)[4]、歐洲轉(zhuǎn)基因生物指南(http: ∥www.gmo-compass.org/eng/gmo/db)[5]、上海交通大學(xué)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)數(shù)據(jù)庫(GMDD，http: ∥gmdd.shgmo.orgwww.gmo-compass.org/)[6]中轉(zhuǎn)基因油菜的遺傳信息(詳見表2)。目前商業(yè)化轉(zhuǎn)基因油菜轉(zhuǎn)化事件有24個(gè)。NOS終止子出現(xiàn)頻率最高為13次、NPTII基因9次、CaMV 35S啟動(dòng)子7次、bar基因6次、pat基因和 CP4-epsps基因均為5次。因此，利用CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、bar基因、pat基因、 CP4-epsps基因和NPTII基因6個(gè)靶標(biāo)元件的組合，理論上可篩查出22個(gè)轉(zhuǎn)基因油菜轉(zhuǎn)化事件，占已知商業(yè)化轉(zhuǎn)基因油菜轉(zhuǎn)化事件的92%；另有2個(gè)轉(zhuǎn)化事件61061和73496 2012年才被批準(zhǔn)商業(yè)化，雖然檢索出含有PINII終止子和 gat4621基因，但其遺傳信息檢測(cè)的相關(guān)研究報(bào)道較少，暫時(shí)無法檢測(cè)。

2.2 轉(zhuǎn)基因油菜PCR篩查特異性檢測(cè)

為驗(yàn)證表1中選擇的擴(kuò)增引物是否適合不同轉(zhuǎn)化事件中轉(zhuǎn)基因成分的篩查，利用農(nóng)業(yè)部農(nóng)作物種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(西安)已有的9個(gè)轉(zhuǎn)基因油菜的轉(zhuǎn)化事件Oxy235、Topas19/2、T45、MS1RF1、MS1RF2、MS8RF3、GT73、MON88302、MS8xRF3xRT73進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果如圖1所示。CaMV 35S啟動(dòng)子檢測(cè)中，Oxy235、Topas19/2、T45檢測(cè)結(jié)果為陽性，其他為陰性；NOS終止子檢測(cè)中，Oxy235、MS1RF1、MS1RF2、MS8RF3、MS8xRF3xRT73為陽性，其他為陰性；bar基因檢測(cè)中，MS1RF1、MS1RF2、MS8RF3、MS8xRF3xRT73為陽性，其他為陰性；pat基因檢測(cè)中，Topas19/2、T45為陽性，其他為陰性； CP4-epsps基因檢測(cè)中，GT73、MON88302、MS8xRF3xRT73為陽性，其他為陰性。NPTII基因檢測(cè)中，MS1RF1、MS1RF2為陽性，其他為陰性。以上結(jié)果與轉(zhuǎn)基因油菜轉(zhuǎn)化事件遺傳信息(表2)符合。表明本研究選用的引物序列在不同轉(zhuǎn)化事件的檢測(cè)中具有較好的特異性。

表2 轉(zhuǎn)基因油菜轉(zhuǎn)化事件常用遺傳信息Table 2 Common genetic information of GM rapeseed event

注：“+”表示含有此元件。

Note： “+”existence of the element.

M.DNA marker DL1000; 1～11.分別是轉(zhuǎn)基因油菜Oxy235、Topas19/2、T45、MS1RF1、MS1RF2、MS8RF3、GT73、MON88302、MS8xRF3xRT73、非轉(zhuǎn)基因油菜‘秦榮6號(hào)’和空白對(duì)照 Genetically modified rapeseed Oxy235,Topas19/2,T45,MS1RF1,MS1RF2,MS8RF3,GT73,MON88302,MS8xRF3xRT73,‘Qinrong 6’ and no DNA control,respectively

圖1轉(zhuǎn)基因油菜PCR篩查法的特異性檢測(cè)
Fig.1SpecifictestofPCRscreeningmethodinGMrapeseed

2.3 轉(zhuǎn)基因油菜PCR篩查靈敏度檢測(cè)

將不同質(zhì)量的轉(zhuǎn)基因油菜T45、MS1RF1和MS8xRF3xRT73粉末分別與非轉(zhuǎn)基因油菜‘秦榮6號(hào)’粉末混合，使混合后樣品中轉(zhuǎn)基因粉末的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1 000、100、10、1、0.1、0 g/kg。檢測(cè)混合后6個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同的轉(zhuǎn)基因粉末樣品。結(jié)果如圖2所示，CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、bar基因、pat基因、 CP4-epsps基因和NPTII基因的檢測(cè)中，轉(zhuǎn)基因粉末的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 000、100、10、1 g/kg的混合樣品中均擴(kuò)增出條帶，而轉(zhuǎn)基因粉末質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1 g/kg的混合樣品未擴(kuò)增出條帶，說明本研究選用的擴(kuò)增引物靈敏度可達(dá)到1 g/kg。

2.4 轉(zhuǎn)基因油菜轉(zhuǎn)化事件鑒定路線圖

在油菜轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)過程中時(shí)，除要檢測(cè)樣品是否含有轉(zhuǎn)基因成分，還必須盡可能確認(rèn)樣品究竟含有哪個(gè)轉(zhuǎn)化事件。按照?qǐng)D3所示的篩查路線圖，利用CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、pat基因、bar基因、 CP4-epsps基因、NPTII基因、PINII終止子7個(gè)篩查元件，可以逐步縮小懷疑范圍，直至通過個(gè)別轉(zhuǎn)化事件的特異性引物確認(rèn)樣品究竟含有哪個(gè)轉(zhuǎn)化事件。與利用24個(gè)不同轉(zhuǎn)化事件特異性引物逐一確認(rèn)的方法相比，利用該路線進(jìn)行樣品中的轉(zhuǎn)基因成分篩查可以極大地減少檢測(cè)工作量，高效地完成轉(zhuǎn)化事件的確認(rèn)，更好地為轉(zhuǎn)基因安全監(jiān)管工作服務(wù)。

M.DNA marker DL1000；1～7.轉(zhuǎn)基因粉末的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1 000、100、10、1、0.1、0 g/kg和空白對(duì)照 GM mass fraction,1 000 g/kg,100 g/kg,10 g/kg,1 g/kg,0.1 g/kg,0 g/kg and no DNA control,respectively

圖2轉(zhuǎn)基因油菜PCR篩查法的靈敏度檢測(cè)
Fig.2SensitivitytestofPCRscreeningmethodinGMrapeseed

3 討 論

農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物的安全監(jiān)管是保障轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)健康、有序發(fā)展的重要舉措。中國(guó)政府高度重視轉(zhuǎn)基因生物的安全監(jiān)管，于2001年頒布《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》，并隨后發(fā)布一系列配套管理辦法，對(duì)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物的研究、生產(chǎn)、加工、經(jīng)營(yíng)和進(jìn)出口活動(dòng)進(jìn)行全過程的嚴(yán)格監(jiān)管[8]。中國(guó)尚未批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因油菜的種植，僅有7個(gè)轉(zhuǎn)基因油菜轉(zhuǎn)化事件批準(zhǔn)進(jìn)口作為加工原料。因此轉(zhuǎn)基因油菜安全監(jiān)管的重點(diǎn)應(yīng)集中在嚴(yán)防進(jìn)口轉(zhuǎn)基因油菜的非法使用和非法繁育，這就需要對(duì)常規(guī)油菜的品種審定、種子生產(chǎn)、種子銷售及轉(zhuǎn)基因油菜的加工銷售等關(guān)鍵環(huán)節(jié)加強(qiáng)監(jiān)管，避免轉(zhuǎn)基因油菜以非轉(zhuǎn)基因身份擴(kuò)散。實(shí)現(xiàn)這些環(huán)節(jié)的重點(diǎn)監(jiān)管，就需要快速、準(zhǔn)確、科學(xué)的轉(zhuǎn)基因成分篩查檢測(cè)方法作為技術(shù)支撐[9]。

圖3 轉(zhuǎn)基因油菜篩查策略Fig.3 Screening strategy of GM rapeseed

本研究制定轉(zhuǎn)基因成分篩查方法主要基于以下幾點(diǎn)考慮:(1) 效率與成本兼顧，以經(jīng)濟(jì)、高效的方法盡可能篩查出所有已知轉(zhuǎn)化事件；(2)特異性強(qiáng)，靈敏度高；(3)盡可能選擇已發(fā)布的相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)作為檢測(cè)方法。因此，最終選擇CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、bar基因、pat基因、 CP4-epsps基因和NPTII基因 6個(gè)篩查元件的組合。該組合理論上可完成對(duì)22個(gè)轉(zhuǎn)基因油菜轉(zhuǎn)化事件的篩查檢測(cè)，占已知商業(yè)化轉(zhuǎn)基因油菜轉(zhuǎn)化事件的92%。然而，由于商業(yè)化轉(zhuǎn)基因油菜的技術(shù)專利多屬于孟山都、拜爾等國(guó)外公司，國(guó)內(nèi)轉(zhuǎn)基因油菜的材料很難獲得。受條件所限，農(nóng)業(yè)部農(nóng)作物種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(西安)僅保存9個(gè)轉(zhuǎn)基因油菜轉(zhuǎn)化事件，因此僅利用這9個(gè)轉(zhuǎn)化事件驗(yàn)證檢測(cè)方法；另外13個(gè)轉(zhuǎn)化事件由于缺乏材料無法驗(yàn)證。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，利用CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、bar基因、pat基因、 CP4-epsps基因和NPTII基因6個(gè)篩查元件，在特異性篩查出9個(gè)轉(zhuǎn)化事件的同時(shí)，檢測(cè)的靈敏度可達(dá)到1 g/kg，與所報(bào)道篩查方法的檢測(cè)靈敏度相近[9-10,18-19]。說明該方法具有較高的特異性和靈敏度，適用于高通量地篩查油菜中的轉(zhuǎn)基因成分，為轉(zhuǎn)基因油菜的全面、有效監(jiān)管提供有力的技術(shù)支撐，對(duì)于保障中國(guó)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全、推動(dòng)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)的健康、有序發(fā)展具有十分重要的意義。

Reference：

[1] 劉 曉,景 寅.轉(zhuǎn)基因油菜研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2010(9):80-81.

LIU X,JING Y.Advance of studies on transgenicBrassicanapus[J].ModernAgriculturalScienceandTechnology,2010(9):80-81.

[2] JAMES C.2014年全球生物技術(shù)/轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢(shì)[J].中國(guó)生物工程雜志,2015,35(1):1-14.

JAMES C.Global status of commercialized biotech/gm crops:2014[J].ChinaBiotechnology,2015,35(1):1-14.

[3] 盧長(zhǎng)明,陳桂敏,瞿 勇.世界轉(zhuǎn)基因油菜田間試驗(yàn)頻次分析[J].中國(guó)油料作物學(xué)報(bào),2013,35(增刊):25-30.

LU CH M,CHEN G M,QU Y.Global frequency analysis of field trials of genetic modified crops [J].ChineseJournalofOilCropScience,2013,35(supplement):25-30.

[4] Center for Environmental Risk Assessment.GM Crop Database [DB/OL].Washington D C:The International Life Sciences Institute(ILSI),2009[2017-3-1].http:∥cera-gmc.org.

[5] EU GMO Compass.GMO Database[DB/OL].Gembloux:EU GMO Compass,2008 [2017-3-1].http:∥www.gmo-compass.org.

[6] 上海交通大學(xué)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)室.轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法數(shù)據(jù)庫[DB/OL].上海:上海交通大學(xué),2008 [2016-5-30].http∥gmdd.shgmo.org.

GMO Detection Laboratory in Shanghai Jiao Tong University,GMO Detection Method Database(GMDD))[DB/OL].Shanghai:Shanghai Jiao Tong University,2008 [2016-5-30].http∥gmdd.shgmo.org.

[7] 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.進(jìn)口用作加工原料的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物審批情況[EB/OL].北京:農(nóng)業(yè)部,2016 [2017-3-1].http:∥www.moa.gov.cn /ztzl/zjyqwgz/spxx/.

Ministry of Agriculture of PRC.The approval of imported genetically modified organisms as raw materials for processing [EB/OL].Beijing:Ministry of Agriculture of PRC,2016 [2017-3-1].http:∥www.moa.gov.cn /ztzl/zjyqwgz/spxx/.

[8] 李飛武,徐世艷,宋貴文,等.淺談我國(guó)轉(zhuǎn)基因作物安全監(jiān)控需求與策略[J].農(nóng)業(yè)科技管理,2010,29(2):27-29.

LI F W,XU SH Y,SONG G W,etal.Preliminary discussions on the requirements and strategies for the safety monitoring of genetically modified crops [J].ManagementofAgriculturalScienceandTechnology,2010,29(2):27-29.

[9] 張海波,張 英,劉 冰,等.玉米中轉(zhuǎn)基因成分篩查策略[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2015,24(12):57-63.

ZHANG H B,ZHANG Y,LIU B,etal.Strategy of genetically modified maize screening based on qualitative PCR method[J].ActaAgriculturaeBoreali-occidentalisSinica,2015,24(12):57-63.

[10] 張 麗,武玉花,吳 剛,等.轉(zhuǎn)基因油菜篩查檢測(cè)策略研究[J].中國(guó)油料作物學(xué)報(bào),2012,34(1):74-81.

ZHANG L,WU Y H,WU G,etal.Strategy of transgenic rapeseed screening based on exogenous gene elements [J].ChineseJournalofOilCropScience,2012,34(1):74-81.

[11] 李 想,潘良文,李俊毅,等.進(jìn)口油菜籽中不同轉(zhuǎn)基因品系的檢測(cè)與分析[J].中國(guó)油料作物學(xué)報(bào),2011,33(1):77-82.

LI X,PAN L W,LI J Y,etal.Identification of imported genetically modified rapeseeds [J].ChineseJournalofOilCropScience,2011,33(1):77-82.

[12] 李俊毅.轉(zhuǎn)基因油菜品系特異性檢測(cè)方法研究及其標(biāo)準(zhǔn)分子研制[D].上海:華東理工大學(xué),2010.

LI J Y.Research on event-specific analysis of genetically modified rapeseed detection and development of reference molecules[D].Shanghai:East China University of Science and Technology,2010.

[13] 聶淑晶.轉(zhuǎn)基因油菜轉(zhuǎn)化事件特異性檢測(cè)技術(shù)[D].武漢:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所,2008.

NIE SH J.Event specific detection of transgenic rapeseed[D].Wuhan:Oilcrops Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,2008.

[14] 謝家建,沈 平,彭于發(fā),等.農(nóng)業(yè)部1782號(hào)公告-3-2012 轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測(cè)-調(diào)控元件CaMV 35S啟動(dòng)子、FMV 35S啟動(dòng)子、NOS啟動(dòng)子、NOS終止子和CaMV 35S終止子定性PCR方法[S].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2012:1-13.

XIE J J,SHEN P,PENG Y F,etal.Announcement by the Ministry of Agriculture,No.1782-3-2012 detection of genetically modified plants and derived products - qualitative PCR methods for the regulatory elements CaMV 35S promoter,FMV 35S promoter,NOS promoter,NOS terminator and CaMV 35S terminator[S].Beijing:China Agriculture Press,2012:1-13.

[15] 路興波,宋貴文,李 凡,等.農(nóng)業(yè)部1782號(hào)公告-6-2012 轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測(cè)bar或pat基因定性PCR方法[S].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2012:1-5.

LU X B,SONG G W,LI F,etal.Announcement by the Ministry of Agriculture,No.1782-6-2012 detection of genetically modified plants and derived products - qualitative PCR method ofbarorpatgene[S].Beijing:China Agriculture Press,2012:1-5.

[16] 楊立桃,厲建萌,劉 勇,等.農(nóng)業(yè)部1861號(hào)公告-5-2012 轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測(cè) CP4-epsps基因定性PCR方法[S].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2012:1-5.

YANG L T,LI J M,LIU Y,etal.Announcement by the Ministry of Agriculture,No.1861-5-2012 Detection of genetically modified plants and derived products - qualitative PCR method for CP4-epsps gene[S].Beijing:China Agriculture Press,2012:1-5.

[17] 盧長(zhǎng)明,宋貴文,吳 剛,等.農(nóng)業(yè)部1782號(hào)公告-2-2012 轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測(cè)標(biāo)記基因NPTII、HPT和PMI定性PCR方法[S].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2012:1-9.

LU CH M,SONG G W,WU G,etal.Announcement by the Ministry of Agriculture,No.1782-2-2012 detection of genetically modified plants and derived products-qualitative PCR method for the maker genesNPTII,HPTandPMI[S].Beijing:China Agriculture Press,2012:1-9.

[18] WU Y H,WANG Y L,LI J,etal.Development of a general method for detection and quantification of the P35S promoter based on assessment of existing methods[J].ScientificReports,2014(4):7358.

[19] 李風(fēng)翠.轉(zhuǎn)基因飼料中bar基因檢測(cè)方法的研究 [D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.

LI F C.Determination ofbargene in animal forage[D].Nanjing:Nanjing Agricultural University,2011.