牛瘤胃微生物定量測定方法研究進展

荊元強,宋恩亮,楊維仁,劉桂芬,譚秀文,萬發(fā)春*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院,山東泰安 271018;2.山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所,山東濟南 250100;3.山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室,山東濟南 250100)

牛瘤胃微生物定量測定方法研究進展

荊元強1,2,3,宋恩亮2,3,楊維仁1,劉桂芬2,3,譚秀文2,3,萬發(fā)春2,3*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院,山東泰安 271018;2.山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所,山東濟南 250100;3.山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室,山東濟南 250100)

瘤胃微生物數(shù)量測定一直是反芻動物營養(yǎng)的難點之一。傳統(tǒng)的定量方法有亨氏滾管法和最大可能計數(shù)法(MPN)兩種,方法簡單,但工作量大,測定結果與實際存在偏差?，F(xiàn)代分子定量技術的出現(xiàn)和發(fā)展,為瘤胃微生物數(shù)量的測定提供了一種新的思路和方法。如核算分子雜交技術、變性梯度凝膠電泳(DGGE)或溫度梯度凝膠電泳(TGGE)、定量PCR技術等。隨著現(xiàn)代分子定量技術的不斷發(fā)展和完善,人們對瘤胃微生物的定量研究必將更加深入。論文簡要對瘤胃微生物數(shù)量測定方法進行了綜述,旨在為開展瘤胃微生物的研究提供參考。

瘤胃微生物;傳統(tǒng)定量;分子定量

反芻動物的瘤胃是一個復雜而又獨特的微生態(tài)系統(tǒng),其內(nèi)棲息著多種多樣的微生物。這些微生物的存在使瘤胃成為反芻動物消化吸收的最重要部位。因此,研究瘤胃微生物的種類和數(shù)量變化有助于探索瘤胃在反芻動物消化代謝體系中的作用機理,進而達到調(diào)控瘤胃功能的目的[1]。長期以來研究人員都采用傳統(tǒng)的定量方法來測定瘤胃微生物的種類和數(shù)量變化。然而,瘤胃微生物生長要求嚴格厭氧環(huán)境,這使得大部分細菌無法培養(yǎng)。因此,傳統(tǒng)的培養(yǎng)、直接觀察的定量方法不能準確測定瘤胃微生物的數(shù)量[2]。近年來,隨著現(xiàn)代分子生物學技術突飛猛進的發(fā)展,逐步建立了較為完善的分子定量方法用于測定瘤胃微生物種類和數(shù)量變化。與傳統(tǒng)定量方法相比,現(xiàn)代分子生物學技術能夠準確、快速、高效的定量測定瘤胃微生物,是瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)研究的必然趨勢[3]。

1 瘤胃微生物組成

瘤胃內(nèi)棲息著復雜、多樣、非致病性的微生物,包括細菌、真菌、原蟲和古菌等,還有少數(shù)噬菌體[4-5]。在瘤胃微生物中,細菌的數(shù)量巨大,種類最多,其種類和數(shù)量受飼料性質(zhì)、采食后的時間、宿主生理狀態(tài)等多種因素的影響。通常情況下瘤胃內(nèi)容物中的細菌數(shù)量為1010～1011cfu/mL。目前,人們已經(jīng)從瘤胃中分離出29個屬的200多種細菌,其中絕大多數(shù)為厭氧菌和兼性厭氧菌,最主要的有纖維降解菌、淀粉降解菌、瘤胃產(chǎn)甲烷菌等[6]。瘤胃內(nèi)的細菌對于降解飼料有效成分有非常重要的作用。細菌之間以及細菌與其他微生物之間的相互作用有助于揮發(fā)性脂肪酸和微生物蛋白的合成[7]。

瘤胃原蟲是瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)中重要的一部分,按其形態(tài)可以分為瘤胃鞭毛蟲和瘤胃纖毛蟲兩大類,以纖毛蟲為主。在瘤胃內(nèi)原蟲數(shù)量比細菌少的多,一般為105～106cfu/mL,但原蟲個體較大,在生物量上并不比細菌少[8]。瘤胃纖毛蟲不但可將植物纖維和淀粉轉變成揮發(fā)性脂肪酸,還可吞食一定量的瘤胃細菌,從而降低瘤胃細菌消化淀粉的速率,維持瘤胃內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定。瘤胃纖毛蟲的繁殖速度非常快。

瘤胃中的真菌數(shù)量不多,但種類較多,迄今為止,從瘤胃中分離到的厭氧真菌多達6個屬16種。瘤胃真菌相對是嚴格厭氧的,正常瘤胃內(nèi)容物中厭氧真菌的游動孢子數(shù)為103～105cfu/mL[9]。依據(jù)菌絲的形成方式瘤胃真菌可分為單中心和多中心兩種類型,其中,單中心類型真菌的菌絲體形成單個孢子囊,而多中心類型真菌的菌絲體則可形成多個孢子囊,這些孢子囊均可釋放出游動的孢子。孢子可附著在飼料上生長,逐漸形成新的菌絲體[10]。由于瘤胃真菌是瘤胃中分泌纖維素酶的主要微生物,因此成為當前研究的熱點之一。

2 瘤胃微生物的傳統(tǒng)定量方法

由于瘤胃內(nèi)微生物的種類繁多,很多在體外根本無法培養(yǎng)。因此,從20世紀50年代開始研究人員就一直在尋求測定瘤胃微生物數(shù)量和種類變化的技術,并建立了一系列不同的方法,其中最為經(jīng)典的是亨氏滾管法和最大可能計數(shù)法。

2.1 亨氏滾管法

亨氏滾管法因最早是由Hungate R E于1969提出而得名[11]。其基本步驟為:在亨氏管中的培養(yǎng)基上接種,流水冷卻。將凝固后的培養(yǎng)基放入39℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)數(shù)天后,挑取滾管壁上出現(xiàn)的單菌落放入新鮮的培養(yǎng)基培養(yǎng)。新培養(yǎng)的菌液經(jīng)過多次滾管和單菌落分離后即可得到純的菌株。通過滾管后菌落的多少可對瘤胃細菌和真菌培養(yǎng)菌計數(shù),也可用于瘤胃液中細菌和真菌的活菌計數(shù)。但這種方法存在著很大的局限性。因為大多數(shù)瘤胃微生物都是厭氧的,而保持絕對厭氧環(huán)境存在很大的難度,而且很多瘤胃微生物在體外無法培養(yǎng)[12]。

2.2 最大可能計數(shù)法

除亨氏滾管法可用于計數(shù)活菌外,目前最常用的傳統(tǒng)定量方法是MPN。其基本要點是先梯度稀釋接種物,然后每個稀釋度經(jīng)過培養(yǎng)后通過直接觀察微生物的生長情況,或對培養(yǎng)液進行pH檢測確定每管是否有微生物生長,最后根據(jù)MPN表換算確定微生物的濃度。Dehority B A等[13]發(fā)表了用于瘤胃細菌的MPN計數(shù)法,并發(fā)現(xiàn)此法與滾管法的總細菌計數(shù)結果相一致。

3 瘤胃微生物的現(xiàn)代分子技術定量方法

由于瘤胃微生物培養(yǎng)的條件高、難度大,再加上傳統(tǒng)的計數(shù)方法工作量大、耗時長,對一些不可培養(yǎng)的微生物又無法計數(shù)等,導致瘤胃微生物的定量研究一直進展緩慢。而現(xiàn)代分子生物技術的興起和發(fā)展,使建立快速、科學、靈敏的瘤胃微生物定量方法成為可能[14]。

3.1 核酸分子雜交技術

該技術是20世紀70年代發(fā)展起來的,其原理是基于核酸分子具有互補配對的特性,用特異性探針和待測樣品核酸雜交,然后檢測。特異性探針常用16 S rDNA/rRNA分子的保守序列來設計。這種方法最大的優(yōu)點是可以檢測一些尚不能成功培養(yǎng)的瘤胃微生物[15]。

3.1.1 斑點雜交技術和狹線雜交技術 斑點雜交技

術(dot hybridization technique,DHT)和狹線雜交技術

(technique,SHT)是現(xiàn)代分子生物學的標準技術。其方法是通過用特異的探針與樣品雜交,估計樣品點發(fā)射出的信號強度,與已知濃度的標準品信號強度進行比較,確定待測樣品中靶序列的量;也可利用通過探針和特異探針在相同條件下分別對同一樣品進行雜交后的相應信號強度比來計算特異探針所對應的RNA占通用探針所對應的靶RNA的百分含量[16]。但是,即使是同一張雜交膜上同一樣品的雜交信號有時也不穩(wěn)定,結果重現(xiàn)性差,在定量研究中的應用效果不夠理想。因此,這種技術在瘤胃微生物的定量方面未得到廣泛應用[10]。

3.1.2 熒光原位雜交 熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)是采用特異的熒光標記探針在未破碎的細胞內(nèi)與它的互補序列完整結合,通過熒光信號檢測核酸序列。FISH結合圖形分析能快速計數(shù)微生物數(shù)量,同時還可以對不同類群的微生物在細胞水平上進行原位的定量分析。

Mackie R I等[17]采用FISH技術測定了不同反芻動物中顫螺菌的含量。Soliva C R等[18]用總甲烷菌和四個種類甲烷菌(甲烷桿菌、甲烷球菌、甲烷微菌和甲烷八疊球菌)的特異性探針研究了肉豆蔻酸對甲烷生成和甲烷菌數(shù)量的影響。這些研究充分說明FISH技術可用于定量瘤胃微生物。但是,該技術容易受到樣品微生物生理狀態(tài)的影響,所以在檢測中會存在一定的偏差[19]。

3.2 變性梯度凝膠電泳或溫度梯度凝膠電泳

DGGE或TGGE都屬于DNA指紋技術。DGGE技術發(fā)展最為迅速,其原理是通過不同的變性劑梯度,顯示不同DNA的差異片段。DGGE的方法是將PCR擴增得到的等長的DNA片段加入到含有變性劑梯度的聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳,由于DNA片段空間構型的變化會改變電泳速度,因此,會在不同變性劑梯度凝膠位置上呈現(xiàn)各自的條帶。停留在相同位置的條帶,可視為具有相同的 DNA序列[20]。DGGE或TGGE技術已被廣泛應用于微生物的定量和多樣性的研究。但是,該技術對于瘤胃中含量很少的微生物,當其DNA在DNA總量中不足1%時就很難檢測到[21]。因此,在微量瘤胃微量微生物的定量中不理想,有待于進一步提高和完善。

3.3 定量PCR技術

PCR技術是由美國科學家Muliis K于1985年發(fā)明的一種可在體外快速擴增特定基因或DNA序列的分子生物學技術[22]。定量PCR技術是對普通PCR技術的進一步發(fā)展和補充。其中,競爭PCR技術和熒光實時定量PCR因其定量準確、迅速等優(yōu)勢而開始被廣泛應用于微生物定量研究中,在瘤胃微生物的定量研究中也顯示出了很好的應用。

3.3.1 競爭PCR技術 當瘤胃液細菌數(shù)低于總菌數(shù)的0.01%時,核酸分子雜交法雖然不能準確測定,但其

rRNA定量方法卻極大地推動了目標rDNA定量方法的發(fā)展,如競爭PCR技術。該技術能夠排除管間及樣本間的變化誤差,可用于核酸的絕對定量和低拷貝基因的定量測定。這種技術在瘤胃微生物的定量研究中已被廣泛應用[14]。競爭PCR技術雖然定量相對準確,

但耗時較長,對于大量樣品進行定量研究時存在一定的難度。Sekhavati M H等(2009)首次建立了針對瘤胃厭氧真菌的競爭定量PCR方法,通過與基于幾丁質(zhì)測定的真菌定量方法相比較,驗證了該方法在體外條件下的有效性[23]。

3.3.2 熒光實時定量PCR 實時定量PCR(real-time

quantitative PCR,RT-PCR)技術也是在普通PCR技術基礎上發(fā)展起來的一種高靈敏的核酸定量技術。這種技術是在PCR的反應體系中加入熒光標記物質(zhì),當熒光標記物與新合成的雙鏈DNA嵌合后,就可根據(jù)熒光信號的累積實時監(jiān)測整個PCR進程,最后通過與標準曲線比較產(chǎn)物積累的速度(時間)來間接對未知模板進行定量分析。RT-PCR技術不僅實現(xiàn)了從定性到定量的飛躍,而且在保持傳統(tǒng)PCR靈敏、快速等特點的基礎上,具有特異性強、定量準確、重復性好、不存在 PCR過程后處理的污染問題等眾多優(yōu)點,已經(jīng)被廣泛應用到瘤胃微生物的定量分析上。Bu D P等[24]首次采用RT-PCR方法研究了日糧中添加胡麻油和豆油對奶牛瘤胃產(chǎn)琥珀絲桿菌、瘤胃黃華球菌和瘤胃白色球菌數(shù)量變化。

目前,RT-PCR技術已廣泛應用在甲烷菌的檢測中[25]。Hook S E等[26]利用RT-PCR技術分析了在采食相同日糧條件下泌乳奶牛瘤胃甲烷菌數(shù)量的變化,研究結果發(fā)現(xiàn)添加莫能菌素的六個月內(nèi)甲烷菌數(shù)量無顯著變化。Guo Y Q等[27]利用RT-PCR方法檢測了甲烷生成被抑制時瘤胃甲烷菌數(shù)量的變化,發(fā)現(xiàn)甲烷排放和甲烷菌數(shù)量的變化并不一致。

4 展望

瘤胃是生物界中最復雜的生態(tài)系統(tǒng)之一,在反芻動物的消化過程中扮演著至關重要的角色。由于傳統(tǒng)方法不能夠準確測定瘤胃微生物數(shù)量,限制了對它的深入研究。近年來隨著現(xiàn)代分子生物學技術的發(fā)展,使分類瘤胃微生物及準確定量數(shù)量成為可能,研究人員對瘤胃微生物的研究也進一步深入。今后,隨著傳統(tǒng)定量技術和現(xiàn)代分子定量技術的結合和進一步發(fā)展,必將會大大提高瘤胃微生物數(shù)量測定的準確度,拓展瘤胃微生物功能研究的深度和廣度。

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Progress on Quantification Methods of Bovine Rumen Microbes

JING Yuan-qiang1,2,3,SONG En-liang2,3,YANG Wei-ren1,LIU Gui-fen2,3,TAN Xiu-wen2,3,W AN Fa-chun2,3

(1.College of Animal Science and Technology,Shandong Agricultural University,Taian,Shandong,271018,China;2.Institute of Animal Science and Veterinary Medicine,Shandong Academy of Agricultural Sciences,J inan,Shandong,250100,China;3.Shandong Key Laboratory of Animal Disease Control and Breeding,J inan,Shandong,250100,China)

The quantification of rumen microorganisms has been one of the difficulties of ruminant nutrition.The traditional methods comprise the classical roll-tube technique and maximum possible count technique.The appearance and development of molecular quantitative methods have provided a new idea and methods for quantifying rumen microorganisms.Such as:accounting hybridization,DGGE or TGFE,real-time PCR.With the constantly developing and improving,molecular quantitative methods will be in-depth to further study.The author reviewed the quantification methods of rumen microbes briefly for providing a reference for the research of rumen microorganisms.

rumen microbe;traditional quantification;molecular quantification

S854.47

A

1007-5038(2011)07-0093-04

2010-12-27

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系(肉牛)、公益性行業(yè)農(nóng)業(yè)科研專項經(jīng)費課題(nyhyzx07-036-01-01,nyhyzx07-036-05,20090300608);省應用創(chuàng)新項目“優(yōu)質(zhì)高檔肉牛生產(chǎn)技術研究”

荊元強(1984-),男,山東平度人,碩士研究生,主要從事動物營養(yǎng)與飼料科學研究。*通訊作者