昆蟲對農(nóng)藥抗性的研究進(jìn)展

黃艷君 浦冠勤

（蘇州大學(xué)園藝系，江蘇蘇州，215123）

昆蟲對農(nóng)藥抗性的研究進(jìn)展

黃艷君 浦冠勤

（蘇州大學(xué)園藝系，江蘇蘇州，215123）

隨著化學(xué)農(nóng)藥在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)過程中的廣泛應(yīng)用，害蟲對農(nóng)藥的抗性不斷增強(qiáng)。因此，昆蟲對農(nóng)藥的抗性機(jī)制已成為當(dāng)前重要的研究課題之一?，F(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的運(yùn)用使有關(guān)抗性機(jī)制的研究呈現(xiàn)多層次、多方位的研究特點(diǎn)。綜述了近年來有關(guān)昆蟲抗藥性幾種機(jī)制的研究進(jìn)展，如代謝抗性機(jī)制、靶標(biāo)抗性機(jī)制等，以期為昆蟲的抗性研究提供參考。

昆蟲；農(nóng)藥；抗性機(jī)制

長期使用殺蟲劑易使昆蟲產(chǎn)生不同程度的抗藥性，甚至產(chǎn)生交互抗性，從而不利于生態(tài)環(huán)境的保護(hù)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本的降低。因此，昆蟲的抗性機(jī)制研究逐漸成為重要的研究課題之一，在過去的半個多世紀(jì)中，人們不斷從各個方面對昆蟲的抗性機(jī)制進(jìn)行研究，以了解其產(chǎn)生抗性的機(jī)理，從而為抗性監(jiān)測和新農(nóng)藥研制提供依據(jù)。

昆蟲抗性研究從最初的行為、生理到代謝再到作用靶標(biāo)，實(shí)現(xiàn)了跨越式發(fā)展。近年來，昆蟲抗性機(jī)制的研究主要集中于抗性基因的表達(dá)和調(diào)控。大多數(shù)研究認(rèn)為，昆蟲的抗藥性機(jī)制主要包括藥劑穿透率下降、昆蟲體內(nèi)解毒酶活力增強(qiáng)即代謝抗性與靶標(biāo)敏感性降低等。其中解毒酶主要包括細(xì)胞色素P450介導(dǎo)的多功能氧化酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）、水解酯酶等；3個主要作用靶標(biāo)分別為乙酰膽堿酯酶（AChE）、神經(jīng)軸突鈉離子通道（SC）和γ-氨基丁酸（GABA）受體-氯離子通道復(fù)合體。而隨著昆蟲基因組全序列的測序完成以及基因組研究技術(shù)的開發(fā)運(yùn)用，大大地促進(jìn)了抗性基因的鑒別，使昆蟲的抗性機(jī)制研究在代謝機(jī)制和作用靶標(biāo)這兩方面取得了重大突破。

1 代謝抗性機(jī)制的研究

1.1 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因的研究

目前，從分子水平上探索谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）的作用機(jī)制已經(jīng)十分普遍，PCR等分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用使人們對昆蟲抗性機(jī)理的研究邁上了一個新的臺階。潘敏慧等[1]通過在 sf9細(xì)胞中真核表達(dá)家蠶 （Bombyx mori）GSTe3，確定了家蠶GSTe3的表達(dá)具有較高的組織特異性，它只在家蠶血液和頭部表達(dá)，其真核表達(dá)產(chǎn)物具有較好的GSTs酶活性；劉海濤等[2]研究表明，BmGSTe5可能是參與合成GSTs的主要基因。以GST基因?yàn)槟繕?biāo)的研究還有很多，這些研究都在一定程度上加深了人們對GSTs抗性機(jī)理的了解。

1.2 羧酸酯酶基因的研究

劉海濤等[2]推測家蠶對藥劑產(chǎn)生抗性可能是因?yàn)槠潴w內(nèi)的羧酸酯酶（CarE）發(fā)生了突變，提高了對殺蟲劑的水解能力。黃水金等[3]利用RT-PCR技術(shù)和 RACE方法獲得了 1個斜紋夜蛾（Spodoptera litura）CarE基因的全長cDNA序列，命名為Slest2，并推測Slest2的過量表達(dá)可能是斜紋夜蛾對溴氰菊酯產(chǎn)生抗性的分子機(jī)制之一，這種推測為進(jìn)一步研究夜蛾科昆蟲的抗性機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。蘭亦全等[4]研究也表明羧酸酯酶活性的提高是甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）對氰戊菊酯和順式氯氰菊酯產(chǎn)生抗性的重要原因。

2 靶標(biāo)抗性機(jī)制的相關(guān)研究

2.1 乙酸膽堿酯酶基因的研究

乙酸膽堿酯酶（AChE）作為抗性機(jī)制中的一個重要靶標(biāo)，成為從基因表達(dá)和基因調(diào)控角度研究抗性機(jī)制的重點(diǎn)。陳亮等[5]對斜紋夜蛾乙酰膽堿酯酶基因cDNA片段進(jìn)行克隆和序列分析，為獲取斜紋夜蛾乙酰膽堿酯酶基因全序列以及研究其變構(gòu)乙酰膽堿酯酶的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

大量試驗(yàn)表明，不敏感AChE對于殺蟲劑的抗性歸因于很多潛在的與抗性相關(guān)的點(diǎn)突變。以AchE基因（ace）為例，昆蟲的ace發(fā)生突變，其產(chǎn)物AChE發(fā)生變構(gòu)，使其對有機(jī)磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的敏感性降低，從而使昆蟲產(chǎn)生抗藥性[6]。李兵[7]研究表明，家蠶Bm-ace2和野桑蠶 （Bombyx mandarina）Bmm-ace2的突變是導(dǎo)致其對有機(jī)磷農(nóng)藥抗性差異的原因之一。此外，劉海濤等[2]也發(fā)現(xiàn)家蠶雌雄個體之間Bm-ace2基因的表達(dá)量不同，導(dǎo)致AChE的活性存在明顯差異，并最終使雌雄個體表現(xiàn)出不同的抗性。研究家蠶AChE活性及其ace基因的表達(dá)模式，為探索家蠶對有機(jī)磷農(nóng)藥抗性的分子機(jī)制提供了依據(jù)，并且通過與野桑蠶比較，為家蠶對有機(jī)磷農(nóng)藥的抗性退化研究提供新的依據(jù)。

2.2 鈉離子通道蛋白基因的研究

趙華強(qiáng)等[8]以野桑蠶為材料，利用RT-PCR技術(shù)克隆了野桑蠶鈉離子通道蛋白基因的cDNA片段，發(fā)現(xiàn)該基因cDNA片段編碼氨基酸序列包括鈉離子通道蛋白α亞基的跨膜結(jié)構(gòu)域Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ，并存在a、b、c 3個選擇性微外元。但尚不清楚在發(fā)育調(diào)控中，這3個微外元對鈉離子通道蛋白產(chǎn)生的影響。

2.3 煙堿型乙酰膽堿受體的研究

煙堿型乙酰膽堿受體（nAChRs）作為昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的神經(jīng)遞質(zhì)受體，也是幾類重要?dú)⑾x劑的作用靶標(biāo)，近年來在其抗性機(jī)理上取得了明顯進(jìn)展。趙宇等[9]利用RT-PCR和RACE技術(shù)，克隆了小菜蛾（Pplutella xylostella）nAChR α亞基的一個新基因Pxα8，為研究小菜蛾nAChR的亞基類型、亞基組合形式、藥理學(xué)特征及其在小菜蛾對多殺菌素的靶標(biāo)抗性機(jī)制方面的作用提供了重要依據(jù)。此外，在褐飛虱（Nilaparvata lugens）抗性機(jī)理的研究中，nAChRs的附屬蛋白作用的發(fā)現(xiàn)[10]，也為抗性研究提供了更多的選擇。

3 其他基因的研究

3.1 家蠶SerB基因

除了對ace基因的廣泛研究，與抗性有關(guān)的其他基因也在不斷被尋找中。葛君等[11]發(fā)現(xiàn)，家蠶在對有機(jī)磷農(nóng)藥代謝解毒過程中磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)氨酶 （SerB）的表達(dá)量增加，其基因mRNA轉(zhuǎn)錄與其蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)相同趨勢，推測該基因可能與家蠶對有機(jī)磷農(nóng)藥的抗性存在一定關(guān)系。

3.2 P450基因

與AChE相似，P450基因表達(dá)量的升高一定程度上增強(qiáng)了昆蟲的抗藥性。黃水金等[12]推斷細(xì)胞色素P450基因CYP4M14和CYP4S9的過量表達(dá)可能與斜紋夜蛾對溴氰菊酯的高水平抗性有關(guān)。張林林等[13]在對田間灰飛虱（Laodelphgax striatellus）抗藥性進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞色素P450的CYP6家族中的10條基因序列以及CYP4家族中的6條基因序列在抗性品系中的表達(dá)量明顯高于敏感品系。值得注意的是，雖然針對任何一種殺蟲劑的高水平抗性，可能只涉及其中少數(shù)幾個對該化合物有針對性的基因，但仍需關(guān)注這些基因的表達(dá)對其他基因的影響。

4 病原微生物在抗性機(jī)理上的研究

目前，除了從基因組學(xué)角度研究各類酶外，一系列病原微生物與昆蟲體內(nèi)酶的關(guān)系的研究也在進(jìn)行。王龍江等[14]推測球孢白僵菌（Beauveria bassiana）感染紅火蟻（Solenopsis invicta）后，影響了其體內(nèi)各種酶的活性，導(dǎo)致其體內(nèi)某一種或幾種保護(hù)酶的合成受到抑制，從而破壞了這幾種酶在昆蟲體內(nèi)的作用或它們之間的協(xié)同作用，最終引起寄主一系列的生理病變。其中CarE的活力呈先下降后上升的趨勢，而AchE的活力則呈先上升后下降的趨勢，說明球孢白僵菌能抑制其體內(nèi)AchE的活性，這對于以后紅火蟻的生物防治具有重要意義，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

另外，研究結(jié)果還表明球孢白僵菌侵染紅火蟻工蟻后會刺激CarE和AchE活性，產(chǎn)生一種免疫防御反應(yīng)，這與昆蟲對化學(xué)農(nóng)藥的抗性機(jī)理顯著不同[14]。

5 病原微生物與基因組學(xué)

大腸桿菌（Escherichia coli）是第一個用于重組蛋白生產(chǎn)的宿主菌[15]，是目前應(yīng)用最廣泛的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)。任文彬等[16]通過克隆高毒力金龜子綠僵菌（Metarrhizium anisopliae）中一個幾丁質(zhì)酶基因，構(gòu)建pGEX-chi融合表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，經(jīng)SDS-PAGE結(jié)果分析顯示，表達(dá)出的融合蛋白大小為68 kD，占蛋白表達(dá)總量的64.5%。該試驗(yàn)從分子生物學(xué)和微生物學(xué)角度出發(fā)，為今后昆蟲的抗性機(jī)理研究提供了一個很好的例子，為新農(nóng)藥的研究提供了一條新的思路。

該試驗(yàn)還成功地在大腸桿菌中高效融合表達(dá)了金龜子綠僵菌幾丁質(zhì)酶，為以后對綠僵菌幾丁質(zhì)酶性質(zhì)與作用的研究奠定了基礎(chǔ)。幾丁質(zhì)酶作為入侵宿主的一個重要毒力因子，是生物防治的一個重要選擇。郝蕾蕾等[17]研究結(jié)果表明，幾丁質(zhì)酶在球孢白僵菌中分泌達(dá)到一定閾值后會顯著提高病菌的毒力，但具體機(jī)制還有待研究?？赡苁瞧渲苯蛹觿×藢ハx表皮幾丁質(zhì)的分解，或是通過協(xié)助蛋白酶的分泌來強(qiáng)化這種分解。若能確定其作用機(jī)理，那么將為昆蟲抗性機(jī)理研究提供另一個重要依據(jù)。

6 結(jié)語與展望

人類與昆蟲之間的拉鋸戰(zhàn)已經(jīng)持續(xù)了數(shù)千年，一直到科學(xué)技術(shù)高度發(fā)展的今天仍然進(jìn)行著。隨著人類對昆蟲認(rèn)識水平的深入，防治技術(shù)也在不斷提高。自20世紀(jì)40年代DDT問世以來，人類在這場拉鋸戰(zhàn)中取得了重大進(jìn)展，但隨之又帶來了一系列問題，其中較為緊迫的一項(xiàng)便是昆蟲對農(nóng)藥的抗性。尋找新的抗性研究途徑一直是人們關(guān)注的重點(diǎn)，但在尋找新途徑的同時也要對已有途徑進(jìn)行創(chuàng)新利用。對于當(dāng)前熱門的基因工程來說，與微生物研究結(jié)合有可能是一條可行性非常高的途徑，將引領(lǐng)我們不斷探索未知的領(lǐng)域。

有害生物綜合防治（IPM）技術(shù)研究過程中，應(yīng)該以生態(tài)學(xué)、多戰(zhàn)術(shù)、協(xié)調(diào)共存和經(jīng)濟(jì)學(xué)這四大觀點(diǎn)為主導(dǎo)，立足于生產(chǎn)實(shí)踐，多角度、多手段地對昆蟲抗藥性機(jī)理進(jìn)行探索。

[1]潘敏慧，許湲，余泉友，等.家蠶谷光甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶GSTe3基因的鑒定及其真核表達(dá)[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43（4）：873-880.

[2]劉海濤，李兵，趙國棟，等.家蠶幼蟲不同齡期體內(nèi)主要解毒酶及其基因表達(dá)的性別差異[J].昆蟲學(xué)報，2010，53（5）：479-486.

[3]黃水金，秦文婧，陳瓊.斜紋夜蛾羧酸酯酶基因的克隆、序列分析及表達(dá)水平[J].昆蟲學(xué)報，2010，53（1）：29-37.

[4]蘭亦全，趙士熙.甜菜夜蛾對氰戊菊酯和順式氯氰菊酯的抗性機(jī)理[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2010，21（1）：203-208.

[5]陳亮，李兵，浦冠勤.斜紋夜蛾乙酰膽堿酯酶基因cDNA片段的克隆和序列分析[J].蠶業(yè)科學(xué)，2010，36（1）：138-142.

[6]唐振華，畢強(qiáng).殺蟲劑作用的分子行為[M].上海：上海遠(yuǎn)東出版社，2003：641-644.

[7]李兵.家蠶和野桑蠶對有機(jī)磷農(nóng)藥抗性的研究[D].蘇州：蘇州大學(xué)，2009：14-20.

[8]趙華強(qiáng)，宋麗莉，李兵，等.野桑蠶鈉離子通道蛋白基因Bmmpara的克隆與選擇性剪接 [J].蠶業(yè)科學(xué)，2010，36（3）：435-441.

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[12]黃水金，秦文婧，陳瓊.斜紋夜蛾P(guān)450基因 CYP4M14和CYP4S9的克隆與mRNA表達(dá)水平研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43（16）：3 115-3 124.

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[16]任文彬，張世清，黃俊生.金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliaeHN1）幾丁質(zhì)酶與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶GST在大腸桿菌中的高效融合表達(dá)[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（17）：7 900-7 902.

[17]郝蕾蕾，陳珊珊，謝翎，等.幾丁質(zhì)酶基因在球孢白僵菌中的超表達(dá)提高其對馬尾松毛蟲的毒力[J].中國生物防治，2010，26（3）：267-273.

Research and Progress about Pesticide Resistance of Insects

HUANG Yanjun,PU Guanqin
(Department of Horticulture,Soochow University,Suzhou Jiangsu 215123)

As the widely use of chemical pesticides in agriculture and forestry production,the pesticide resistance of insects was the trend of getting stronger.So,researches about resistance mechanism of pesticide have been one of the important issues now.And the use of molecular biology technology made the researches develop variously.The paper generally overviewed the researches and progresses about pesticide resistance of insects in recent years to provide references for the researches.

Insects;Pesticide;Resistance mechanism

10.3865/j.issn.1001-3547.2011.06.003

黃艷君（1988－），女，碩士，研究方向?yàn)槔ハx生態(tài)學(xué)與綜合治理

浦冠勤，男，通信作者，教授，主要從事植物保護(hù)方便的教學(xué)與研究，電話：0512-65880210，E-mail：szpugq@126.com

2011-01-30