動物病原高通量檢測技術(shù)＊

朱麗萍，顏世敢

（1.山東輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，山東濟(jì)南 250353；2.山東省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所山東省動物疫病防控與繁育重點實驗室，山東濟(jì)南 250100）

高通量檢測技術(shù)是在免疫學(xué)、微生物學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科最新研究成果的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，借助自動化操作系統(tǒng)執(zhí)行檢測過程，通過快速、靈敏的檢測儀器采集實驗數(shù)據(jù)并用計算機對數(shù)據(jù)分析處理，實現(xiàn)大量樣品快速檢測的新技術(shù)。高通量檢測技術(shù)具有高通量、自動化、微量化、快速、靈敏、精確等特點。病原高通量檢測技術(shù)可分為高通量免疫學(xué)檢測技術(shù)（檢測抗原）和高通量分子生物學(xué)檢測技術(shù)（檢測核酸）兩大類。前者有液相芯片、抗體芯片、流式細(xì)胞術(shù)等；后者有基因芯片、變性高效液相色譜技術(shù)等。

我國養(yǎng)殖業(yè)的集約化程度越來越高，養(yǎng)殖規(guī)模越來越大，隨之而來的流行病學(xué)調(diào)查、臨床檢測、檢驗檢疫的樣品數(shù)量逐年增加，傳統(tǒng)的檢測方法和技術(shù)已經(jīng)難以適應(yīng)當(dāng)前的生產(chǎn)需要，迫切要求動物病原檢測實現(xiàn)高通量化。本文對近年來報道的高通量檢測新技術(shù)從原理、特點及其在動物病原檢測中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1 高通量免疫學(xué)檢測技術(shù)

近年來報道的用于檢測動物病原檢測的高通量免疫學(xué)檢測技術(shù)有液相芯片技術(shù)、抗體芯片技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)多色熒光檢測等。

1.1 液相芯片

液相芯片（lquid chip）是美國Luminex公司開發(fā)的一種基于xMAP技術(shù)的新型生物芯片技術(shù)。它將芯片技術(shù)和流式細(xì)胞儀結(jié)合為一體，在直徑5.5 μm的聚苯乙烯微球標(biāo)記上編碼多達(dá)100多種的熒光染料后成為編碼熒光微球，以此為反應(yīng)載體，以流式細(xì)胞儀作為檢測平臺，在液相中完成對各種抗原的高通量檢測，因此液相芯片又稱懸浮芯片（suspension array）。液相芯片具有快速、靈敏（0.01 pg）、重復(fù)性好、檢測范圍寬（0.2pg／mL～32 000 pg／mL）、微量（10μL）、高通量、檢測成本低、操作簡單的優(yōu)點。

液相芯片可用于多種動物病原感染的檢測。朱海紅等［1］采用液相芯片技術(shù)建立了56種常見細(xì)菌、病毒高通量檢測平臺。詹愛軍等［2－3］建立的新城疫病毒、鹿流行性出血熱病毒、阿卡斑病毒、藍(lán)舌病病毒、水皰性口炎病毒液相芯片檢測技術(shù)，檢測靈敏度達(dá)到50TCID50～100TCID50。夏駿等［4］利用液相芯片技術(shù)檢測H5N1亞型禽流感病毒的靈敏度達(dá)10pg。王靜等［5］檢測鼠疫菌的液相芯片在濃度為0.154ng／mL～4 514ng／mL的范圍內(nèi)具有良好的動力學(xué)響應(yīng)，液相芯片的靈敏度比ELISA法高2個數(shù)量級。

1.2 抗體芯片

抗體芯片（antibody chip）是高通量、微型化和自動化的蛋白質(zhì)分析技術(shù)，在玻片或其他固相支持物表面高密度排列抗體點陣，可特異地捕獲樣品中的抗原分子，CCD （charge－coupled device）照相技術(shù)與激光掃描系統(tǒng)獲取陣列圖象，用專門的計算機軟件進(jìn)行圖象分析、結(jié)果定量和解釋。抗體芯片具有特異、靈敏、重復(fù)性好、高通量的特點，一次可同時檢測數(shù)千種目標(biāo)蛋白，靈敏度達(dá)到ng／L。

Miller J L等［6］在玻片上先分別包被多聚L－賴氨酸和聚丙烯酰胺凝膠，再固定上184種不同的抗體制成免疫芯片，鑒別出5種差異蛋白。Nettikadan S R等［7］研制的抗體芯片Viri Chip能在30min內(nèi)檢出樣品中滴度為108蝕斑形成單位（pfu／mL）的犬細(xì)小病毒，而且病毒滴度在108pfu／mL～1010pfu／mL范圍內(nèi)與抗體的結(jié)合在4h內(nèi)都會呈線性而不會達(dá)到飽和。Boyler M D等［8］、Saouda M 等［9］采用抗體芯片快速鑒定了化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的外毒素SpeB。Thulasiraman V等［10］運用抗體芯片技術(shù)比較了鼠疫耶爾森菌（Yersinia pestis）在26℃（跳騷媒介）、37℃（哺乳動物宿主）兩種生理狀態(tài)下蛋白表達(dá)模式，找到兩種表達(dá)水平與溫度、Ca2＋相關(guān)的毒力因子。Delehanty J B等［11］采用抗體芯片技術(shù)對霍亂毒素、葡萄球菌內(nèi)毒素B的檢測靈敏度分別為8μg／L和4 μg／L，檢測過程僅需15min。隨著單克隆抗體技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的發(fā)展、成熟和完善，免疫芯片技術(shù)必將廣泛應(yīng)用于臨床檢測。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)多色熒光檢測

流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）是利用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞或其他微小生物顆粒的多種物理、生物學(xué)參數(shù)同時進(jìn)行定量檢測，并對特定細(xì)胞群體進(jìn)行分選的分析測量技術(shù)，具有快速、靈敏、準(zhǔn)確及客觀、直接和同時進(jìn)行多參數(shù)檢測的優(yōu)點。流式細(xì)胞術(shù)早期主要應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的腫瘤學(xué)和血液學(xué)研究，近年來拓展到細(xì)菌、真菌和病毒的快速檢測及微生物群落結(jié)構(gòu)的研究。細(xì)菌、真菌的檢測多采用直接檢測法，而病毒主要根據(jù)細(xì)胞表面抗原表達(dá)與否來間接判斷病毒是否存在，但隨著新染料的開發(fā)和分子生物學(xué)方法的引入及FCM檢測精度的提高，利用FCM直接檢測病毒已成為可能。

Stopa P J等［12］建立FCM檢測炭疽芽胞桿菌的芽胞的方法，有效地降低生物武器對人類的威脅。高明燕等［13］報道利用流式細(xì)胞術(shù)在H4亞型流感病毒接種36h后檢測到病毒感染陽性細(xì)胞，不加胰酶也可引起病毒感染，但加胰酶組感染率明顯高于不加胰酶組。Barardi C R M等［14］應(yīng)用FITC標(biāo)記的抗體識別輪狀病毒感染的細(xì)胞，運用FCM技術(shù)檢測感染細(xì)胞的數(shù)量和感染水平。Marie D等［15］使用新型核酸染料SYBR Green直接檢測水環(huán)境中的病毒數(shù)目取得成功。Defoort J D等［16］在多重PCR的基礎(chǔ)上采用FCM 和微球雜交法快速、特異地從同一個血清樣品中同時檢測到至少3種病原體。Yan X等［17］把 MBDI（Microsphere－based duplexed immunoassay）與FCM結(jié)合成功檢測到了A、B 2種類型的流感病毒。MClelland RD和Dinder AC用FCM結(jié)合單克隆抗體檢測食品中的沙門菌，靈敏度達(dá)到1cfu／g［18］。在四通路的流式細(xì)胞儀上已實現(xiàn)多達(dá)13色免疫熒光檢測，即同時鑒別檢測12種細(xì)胞表面標(biāo)記物，可用于傳染病的早期診斷及監(jiān)測。流式細(xì)胞儀還可用于細(xì)菌藥敏試驗，通過測量加入藥物孵育后的散射光的DNA含量來判斷抗菌藥物對細(xì)菌的敏感性，這是流式細(xì)胞儀在該領(lǐng)域應(yīng)用的經(jīng)典方法。

2 高通量分子生物學(xué)檢測方法

高通量分子生物學(xué)檢測方法是在PCR或RTPCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的高通量核酸檢測方法，如基因芯片、變性高效液相色譜技術(shù)等，可用于動物病原的檢測、基因分型及野毒與疫苗毒的鑒別。

2.1 基因芯片

基因芯片（gene chip）又稱DNA芯片、DNA微陣列、寡核苷酸陣列，是把大量已知核酸序列探針集成在同一個基片（如玻片、膜、硅片、塑料片等）上，經(jīng)過標(biāo)記的若干靶核苷酸序列與芯片特定位點上的探針雜交，通過檢測雜交信號，對海量的基因信息進(jìn)行篩選與檢測分析?；蛐酒夹g(shù)流程包括芯片的設(shè)計與制備、靶基因的標(biāo)記、芯片雜交與雜交信號檢測?；蛐酒闹苽溆性缓铣煞ê忘c樣法兩種方法，原位合成法制造的基因芯片密度高、重復(fù)性好、質(zhì)量容易控制，但成本高于點樣法，點樣法主要用于部分沒有商業(yè)化的物種的基因芯片的制備?；蛐酒哂懈叨炔⑿行浴⒍鄻有?、微型化和自動化的特點。

1994年第一張商業(yè)化基因芯片由Affymetrix公司推出。隨后，基因芯片迅猛發(fā)展，廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)譜分析、基因診斷、藥物篩選及序列分析等諸多生命科學(xué)領(lǐng)域。在病原檢測方面，基因芯片已做到對病原微生物的鑒定、檢測及分型、毒力因子測定、耐藥性檢測，檢測的敏感度與PCR相當(dāng)。宋亞軍等［19］、翟俊輝等［20］利用16S、23SrRNA 寡核苷酸芯片對常見病原細(xì)菌檢測。秦智鋒等［21］制備了臨床癥狀相似的4種水皰性動物疾病病毒檢測和鑒別基因芯片，實現(xiàn)了大批量貨物的集成化檢測和快速通關(guān)的要求。楊素等［22］制備了可同時檢測水皰性口炎病毒、藍(lán)舌病病毒、口蹄疫病毒、豬瘟病毒、牛病毒性腹瀉病毒、鹿流行性出血熱病毒和赤羽病病毒等7種病原的基因芯片。朱來華等［23］制備了同時檢測和鑒別馬皰疹病毒Ⅰ型、馬動脈炎病毒、馬流感病毒、馬傳染性貧血病毒和東部馬腦脊髓炎病毒等5種病毒的基因芯片。曹三杰等［24］制備了同時檢測雞新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、禽流感病毒和雞傳染性法氏囊病病毒的基因芯片，其檢測靈敏性、特異性與RT－PCR方法基本一致。Sengupta S等［25］利用476個流感病毒特異的21bp的寡核苷酸片段制備了基因芯片，可以區(qū)分病毒類型（A、B和C型）、病毒的宿主種類（人、豬、禽、馬等）、HA亞型和NA亞型。Bruant G等［26］設(shè)計了檢測大腸埃希菌189個毒力基因和30個耐藥性基因的寡核苷酸基因芯片，可用于大腸埃希菌致病型及耐藥性的檢測和監(jiān)測。

基因芯片技術(shù)目前尚存在一些缺陷，如檢測成本高、芯片制作工藝復(fù)雜、信號檢測需專門的儀器設(shè)備、合成效率及芯片的集成程度低、樣品制備的標(biāo)準(zhǔn)化不統(tǒng)一等。

2.2 變性高效液相色譜技術(shù)

變性高效液相色譜技術(shù)（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）是利用通用PCR引物從多種細(xì)菌的16SrRNA中擴增含有高度變異序列的片段，將這些來自不同種細(xì)菌的擴增產(chǎn)物與參照菌株的擴增產(chǎn)物混和后進(jìn)行DHPLC檢測，產(chǎn)生一個獨特的色譜峰圖，可作為鑒定細(xì)菌種類的分子指紋［27－28］。DHPLC是一種新的基因高通量分析技術(shù)，具有高通量、自動化分析、準(zhǔn)確、靈敏、重復(fù)性好、檢測速度快、檢測成本低、操作簡便安全等優(yōu)點。DHPLC是不依賴培養(yǎng)的混合微生物樣本分析平臺，尤其適用于分析無法培養(yǎng)的微生物及混合微生物樣本的檢測，能鑒定常見菌、罕見菌、厭氧菌及混合微生物樣品的分離鑒定，可用于微生物基因分型和鑒定、定性和定量檢測混合菌群中各成分的動態(tài)變化、基因突變檢測、微生物耐藥基因突變檢測。美國環(huán)球基因有限公司根據(jù)DHPLC研制了WAVE系列核苷酸片段分析系統(tǒng)。

Hurtle W等［28］利用DHPLC技術(shù)檢測細(xì)菌的特異性為100%，敏感性為91.7%。陳茹等［29］建立了多重PCR－DHPLC快速鑒別檢測結(jié)核分支桿菌、牛分支桿菌、禽分支桿菌及副結(jié)核分支桿菌等4種重要致病性分支桿菌，從40份來自疑似發(fā)病牛群的臨床樣品中檢出31份牛分支桿菌陽性，檢測靈敏度為10－2～10－3基因拷貝，檢出率高于細(xì)菌分離培養(yǎng)法。文獻(xiàn)報道了用DHPLC技術(shù)同時快速、高通量、檢測了動物源性飼料中的沙門菌和志賀菌［30－31］、肉制品中的沙門菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、空腸彎曲菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌和溶血性鏈球菌［32］。

3 展望

隨著免疫學(xué)、微生物學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科的迅猛發(fā)展、滲透和交叉，新儀器、新設(shè)備、新技術(shù)、新方法不斷出現(xiàn)及應(yīng)用，高通量檢測新方法、新技術(shù)不斷涌現(xiàn)。本文只對文獻(xiàn)報道的用于動物病原高通量檢測的基因芯片技術(shù)、抗體芯片技術(shù)、液相芯片技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)多色熒光分析技術(shù)、變性高效液相色譜技術(shù)等部分新技術(shù)進(jìn)行綜述，還有一些新技術(shù)沒有列舉。本文介紹的高通量檢測新技術(shù)是按照抗原和核酸兩大類分別進(jìn)行介紹的，其中有些技術(shù)并不局限于單方面的檢測，如流式細(xì)胞術(shù)既可用于抗原檢測也可用于核酸檢測，而且有些高通量檢測技術(shù)也不局限于病原檢測領(lǐng)域，還可用于新藥篩選、抗藥性基因篩選等領(lǐng)域。

本文列舉的某些新技術(shù)已經(jīng)實現(xiàn)了商品化，如DPHC、FCM等。有些新技術(shù)還存在這樣那樣的不足之處，技術(shù)層面還需要完善，有些技術(shù)帶來的檢測費用昂貴，限制了實際應(yīng)用，如基因芯片、抗體芯片等。相信隨著新技術(shù)的日臻完善，檢測成本的日漸降低，動物病原檢測必將發(fā)生質(zhì)的飛躍，促進(jìn)禽流感、口蹄疫、豬鏈球菌病、瘋牛病、沙門菌病等嚴(yán)重危害養(yǎng)殖業(yè)及威脅人類健康和生命安全的人獸共患病及時、快速確診，在此基礎(chǔ)上迅速、有的放矢地采取有效的防控措施。

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