老年患者惡性胸水中腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞體外活化

黃 艷 王紅陽(yáng) 郭繼芳 劉 颯 (華北煤炭醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科,河北 唐山 063000)

目前認(rèn)為腫瘤微環(huán)境中抗原提呈細(xì)胞及效應(yīng)細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境的關(guān)鍵細(xì)胞,可以發(fā)揮免疫監(jiān)視及清除癌細(xì)胞的作用。近年來樹突細(xì)胞(DCs)作為抗原提呈細(xì)胞在機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)中的重要作用日益受到重視,對(duì)腫瘤浸潤(rùn)樹突細(xì)胞(TIDC)的研究證實(shí) DCs是腫瘤微環(huán)境中的主要抗原提呈細(xì)胞,但是無功能或功能低下。有關(guān)惡性胸水腫瘤微環(huán)境中的TIDC研究較少,目前對(duì)惡性胸水中的淋巴細(xì)胞的研究頗多,認(rèn)為腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL)主要源于 T淋巴細(xì)胞,IL-2作用下可增殖、分化為細(xì)胞毒性 T細(xì)胞(CTL)。我們選擇在體外用IL-2活化惡性胸水免疫細(xì)胞,主要針對(duì) TIL和 TIDC,觀察負(fù)載腫瘤全抗原后對(duì)腫瘤細(xì)胞的體外殺傷作用,以期為惡性胸水臨床免疫治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 多種氨基酸培養(yǎng)基(RPMI1640,美國(guó)Lifetechnologies公司)。淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll-Hypaque液,上海試劑二廠),IL-2(北京雙鷺生物工程制品廠),AB型血清(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院天津血液學(xué)研究所)。肝素抗凝試劑、人外周血 T細(xì)胞亞群 SAP法檢測(cè)試劑盒、S-100蛋白 SP法檢測(cè)試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)。

1.2 臨床資料 選取 2003年 3月至 2007年 8月我院診治的100例肺癌合并惡性胸水老年患者,男 50例,女 50例。所有病例經(jīng)胸片、CT及病理學(xué)診斷和(或)細(xì)胞學(xué)檢查證實(shí)為晚期惡性肺腫瘤合并胸膜轉(zhuǎn)移致胸腔積液患者,同時(shí)血性胸水患者不作為研究對(duì)象。

1.3 方法 在無菌操作下抽取患者胸水 500 ml,并將其引流進(jìn)含有肝素(10 U/ml)的無菌鹽水瓶?jī)?nèi),50 ml離心管分裝胸水,1 000 r/min,20℃離心 10 min。棄上清,Hanks液洗 2遍。取 10只 10ml離心管各加淋巴細(xì)胞分離液 3.5 ml,以 1∶1的比例加入 HBSS懸浮的細(xì)胞,2 000r/min,20℃離心 20 min。吸取白膜層細(xì)胞轉(zhuǎn)移至 10ml離心管。1 000 r/min離心 10min。棄去上清,含滅活補(bǔ)體的 10%人 AB型血清的 RPMI1640培養(yǎng)基洗 2遍。調(diào)整細(xì)胞濃度為 106/ml接種于 6孔板中,每孔加2 ml,置體積分?jǐn)?shù)為 0.05的 CO2、37℃溫箱中培養(yǎng)培養(yǎng) 2～3 h。輕輕吸取非貼壁細(xì)胞,輕輕洗去殘余懸浮細(xì)胞,獲得先貼壁細(xì)胞,所有懸浮細(xì)胞共同轉(zhuǎn)移至另一 6孔板中再貼壁 20 h,再次吸取非貼壁細(xì)胞(單核細(xì)胞為主)(包括TIDC和TIL)。非貼壁細(xì)胞中加入 500 U/ml IL-2,每 2天傳代 1次同時(shí)補(bǔ)充 IL-2,37℃ 5%CO2溫箱繼續(xù)培養(yǎng),相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)細(xì)胞并檢測(cè)細(xì)胞活性。細(xì)胞培養(yǎng)前后SP法檢測(cè) T細(xì)胞亞群免疫功能及 S-100蛋白陽(yáng)性細(xì)胞。S-100蛋白陽(yáng)性細(xì)胞判定標(biāo)準(zhǔn):光鏡下可見胞漿及胞膜出現(xiàn)棕黃色,陽(yáng)性結(jié)果為棕黃色,樹突細(xì)胞胞漿著色,單核 /巨噬細(xì)胞染色位于細(xì)胞膜。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組化DAB染色結(jié)果判定 陽(yáng)性結(jié)果為棕黃色;光鏡下可見胞漿及胞膜出現(xiàn)棕黃色,S100陽(yáng)性DC胞漿著色,單核/巨噬細(xì)胞染色位于細(xì)胞膜,見圖 1;活化第 7天:DC形態(tài)不規(guī)則,有長(zhǎng)短、粗細(xì)不等的突起;核不規(guī)則,且多扭曲,胞漿內(nèi)出現(xiàn)彌漫狀或顆粒狀棕黃色反應(yīng)物;胞漿呈分枝狀突起,形似樹突狀,而巨噬細(xì)胞出現(xiàn)胞膜棕黃色,圖 1。

2.2 流式細(xì)胞儀分析鑒定DC表面分子 PEMCs培養(yǎng)前微量CD1a+DC,無DC?；罨?TIDC 7 d:出現(xiàn) CD1a+DC和 CD8+3DC,是 DC的成熟標(biāo)記,見表 1。

圖1 TIDC光鏡下形態(tài)(DAB,×400)

表1 培養(yǎng)前后 DC細(xì)胞表型變化(±s)

表1 培養(yǎng)前后 DC細(xì)胞表型變化(±s)

與培養(yǎng)前比較:1)P＜0.01

時(shí)間點(diǎn) CD1a+DC的比例 CD+83DC的比例培養(yǎng)前 0.19±0.14 0.00培養(yǎng)后 0.76±0.221) 0.62±0.191)

3 討 論

肺癌合并惡性胸水臨床常見,以胸膜轉(zhuǎn)移為常見原因,這些轉(zhuǎn)移灶從生物學(xué)角度看具有異質(zhì)性,每個(gè)灶對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性也存在異質(zhì)性,單純化療除去所有轉(zhuǎn)移灶并不可能。抗原提呈細(xì)胞將腫瘤抗原有效地提呈給T淋巴細(xì)胞,激活腫瘤抗原特異性細(xì)胞毒性 T淋巴細(xì)胞(CTL)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用是特異性抗腫瘤免疫的關(guān)鍵環(huán)節(jié)〔1,2〕。DC是體內(nèi)功能最強(qiáng)的專職抗原提呈細(xì)胞,DC僅占外周血單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)的 0.5%～1.0%,癌腫瘤微環(huán)境DCs的數(shù)量、功能的研究鮮見報(bào)道,TIDC是腫瘤微環(huán)境中的主要抗原提呈細(xì)胞,可能是一種無功能或功能低下的 DC,腫瘤細(xì)胞在腫瘤局部分泌的免疫抑制因子可能是導(dǎo)致 TIDC功能低下的原因之一,抑制免疫細(xì)胞的抗腫瘤免疫應(yīng)答,研究 TIDC對(duì)了解腫瘤免疫逃避機(jī)制具有重要意義〔3〕。由于晚期癌癥患者全身免疫功能的低下,導(dǎo)致了癌性胸水中的TIL處于免疫抑制狀態(tài)?，F(xiàn) TIL體外活化后其特異性及細(xì)胞殺傷活性等已得到臨床證實(shí),來自自體腫瘤細(xì)胞的TIL對(duì)自體腫瘤具有強(qiáng)大的細(xì)胞毒作用,對(duì)自體正常組織無殺傷性,著腫瘤免疫學(xué)的深入,提出了“腫瘤微環(huán)境”的概念,由于惡性腫瘤在患者體內(nèi)生長(zhǎng)時(shí)能分泌免疫抑制因子,抑制免疫細(xì)胞的抗腫瘤免疫應(yīng)答。因此,如何解除腫瘤細(xì)胞的免疫抑制作用,優(yōu)化機(jī)體的特異性抗腫瘤免疫的微環(huán)境,提高腫瘤患者機(jī)體自身的抗腫瘤免疫應(yīng)答,是對(duì)癌細(xì)胞擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移的預(yù)防及治療過程中一個(gè)重要的問題。以往的研究發(fā)現(xiàn),IL-2基因修飾的 DC免疫治療后,能優(yōu)化荷瘤宿主體內(nèi)抗原提呈的微環(huán)境,腔內(nèi)直接注入TIL,對(duì)局部抗腫瘤免疫應(yīng)答的微環(huán)境起到了優(yōu)化和增強(qiáng)作用,能有效地抑制晚期癌癥患者胸水中癌細(xì)胞的增長(zhǎng)。本文發(fā)現(xiàn)IL-2活化 TIL的同時(shí),使胸水中的無功能 TIDC轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒霥C,腫瘤抗原致敏的TIL和TIDC有特異性殺傷作用。本研究結(jié)果顯示惡性胸水中的TIDC數(shù)量極少,經(jīng)過IL-2活化,T細(xì)胞免疫功能明顯上調(diào),且對(duì)于腫瘤抗原具有特異性殺傷作用。本研究為惡性胸水的臨床治療提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù),在臨床治療中將有廣闊的應(yīng)用前景。

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2 Sallusto F,Lanzavecchia A.Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte macrophage colony-stimulating factor plus interleukin-4 and down regulated by tumor necrosis factor alpha〔J〕.J Exp Med,1994;179(4):1109-18.

3 Canque B,Rosenzwaijg M,Camus S,et al.The effect of in vitro human immuo deficiency virus infection on dendritic cell differentiation and function〔J〕.JBlood,1996;88(11):4215-28.