單鏈抗體技術(shù)在農(nóng)獸藥殘留檢測(cè)方面的研究進(jìn)展

齊永華，董永軍，寧紅梅，趙 坤

（河南科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

自1975年Kohler和Milstein創(chuàng)立雜交瘤單克隆抗體技術(shù)以來[1]，大量可結(jié)合蛋白質(zhì)、碳水化合物、核酸和半抗原的單克隆抗體在免疫檢測(cè)領(lǐng)域中就顯示出其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)并發(fā)揮著巨大作用?；诳乖贵w特異性識(shí)別原理的免疫分析技術(shù)因其操作簡(jiǎn)便、快捷、靈敏度高，越來越多的應(yīng)用于農(nóng)獸藥殘留的快速監(jiān)測(cè)。但是隨著應(yīng)用農(nóng)獸藥種類和數(shù)目的不斷增加，造成了目前農(nóng)獸藥殘留現(xiàn)狀的復(fù)雜性和不確定性，給監(jiān)測(cè)工作帶來了前所未有的挑戰(zhàn)。基于單克隆抗體的傳統(tǒng)免疫分析技術(shù)一次僅檢測(cè)單個(gè)農(nóng)獸藥的方式已經(jīng)不能滿足日益增多的大量樣本快速、及時(shí)、高效檢測(cè)的要求。提高免疫分析檢測(cè)的工作效率、縮短檢測(cè)時(shí)間和簡(jiǎn)化操作步驟是其未來發(fā)展的主要趨勢(shì)，因此發(fā)展獸藥的快速多殘留檢測(cè)，建立一次分析可以檢測(cè)多種同類或不同類農(nóng)獸藥的免疫分析方法是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。而農(nóng)獸藥廣譜性抗體是建立多殘留免疫分析的關(guān)鍵試劑，其性質(zhì)決定著免疫分析的靈敏度和特異性，是目前制約多殘留免疫技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展的主要瓶頸。20世紀(jì)80年代初出現(xiàn)的基因重組抗體技術(shù)為廣譜性抗體制備提供了一條嶄新的途徑。在基因重組抗體中，目前應(yīng)用最為廣泛的當(dāng)屬單鏈抗體（Single chain variable fragment，scFv）。本文對(duì)單鏈抗體的研究進(jìn)展及其在農(nóng)獸藥殘留分析方面的應(yīng)用情況進(jìn)行簡(jiǎn)單綜述。

1 單鏈抗體技術(shù)

scFv是抗體分子中保留抗原結(jié)合部位的最小功能片段的一種新型重組蛋白，由重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）通過一段約15～25個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的彈性短肽（Linker）以非共價(jià)鍵相連而成,分子質(zhì)量約為完整抗體分子的1/6，具有單一抗原結(jié)合位點(diǎn)、分子質(zhì)量小、組織穿透力強(qiáng)、體內(nèi)清除快、免疫原性低、易于在大腸桿菌中表達(dá)和進(jìn)行基因進(jìn)化等特點(diǎn)[2-3]。單鏈抗體技術(shù)基本原理：從B淋巴細(xì)胞中提取總RNA，經(jīng)RT-PCR分別擴(kuò)增出抗體的VH和VL編碼基因，再用Linker將兩者連接成scFv基因，然后通過表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)。

1.1 單鏈抗體的構(gòu)建

scFv基因主要來源于人或動(dòng)物的外周血淋巴細(xì)胞、骨髓、脾細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞等。即從中抽提總RNA，用純化的mRNA或細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以此為模板擴(kuò)增出VH和VL基因。抗體的可變區(qū)由超變區(qū)和骨架區(qū)兩部分組成，每個(gè)VH和VL的可變區(qū)包含3個(gè)超變區(qū)（CDR），它們共同構(gòu)成抗原的結(jié)合位點(diǎn)，也決定了每種抗體的特異性，其余結(jié)構(gòu)比較保守的可變區(qū)，呈B2片層排列，起到連接超變區(qū)的骨架作用，稱骨架區(qū)（FR）。在獲取可變區(qū)基因時(shí)，引物的設(shè)計(jì)可根據(jù)FR1和FR4的堿基組成和順序分別合成擴(kuò)增VH和VL基因的引物。在基因設(shè)計(jì)中應(yīng)盡可能保持親本抗體可變區(qū)序列的完整性和真實(shí)性。此外，scFv基因也可通過基因合成獲得，或者由生物來源及人工合成基因共同構(gòu)建。

scFv中的VH和VL是由柔性肽段Linker連在一起的，其取向有兩種方式：VH-Linker-VL或VL-Linker-VH，兩種構(gòu)建方式對(duì)scFv的特異性和親和力無明顯影響，但大腸桿菌分泌表達(dá)情況不同。此外，Linker對(duì)scFv的親和力有重要影響，它承擔(dān)著與CL和CH1穩(wěn)定作用相同的功能，使VH和VL自由折疊，從而維持VH和VL間的構(gòu)象。Linker長(zhǎng)度及性質(zhì)應(yīng)不干擾VH和VL的立體折疊,并且不對(duì)抗原結(jié)合部位造成妨礙。Linker長(zhǎng)度必須以不干擾正常功能區(qū)結(jié)構(gòu)或功能區(qū)間的接觸為標(biāo)準(zhǔn)。一般Linker不應(yīng)過短，至少含有10個(gè)氨基酸，過短可能干擾VH和VL的相互作用；接頭亦不應(yīng)過長(zhǎng)，以免影響抗原抗體結(jié)合。目前應(yīng)用最為廣泛的Linker是重復(fù)三次排列組合的4個(gè)甘氨酸和1個(gè)絲氨酸（（Gly4Ser）3）的15肽序列[4]。

在已知親本抗體可變區(qū)DNA基因的基礎(chǔ)上，scFv的構(gòu)建目前多可采用基因拼接方法，此法有兩種實(shí)現(xiàn)形式，即一種是將Linker設(shè)計(jì)在表達(dá)載體上，兩端各引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)供VH和VL的插入；另一種是重疊延伸拼接法（Splicing by overlap extension,SOE-PCR）[5]，即將Linker直接設(shè)計(jì)在擴(kuò)增VH、VL的引物中，并使連接兩者的引物有15個(gè)堿基以上的互補(bǔ)序列，將VH和VL擴(kuò)增產(chǎn)物混合，經(jīng)變性、復(fù)性及DNA聚合酶催化的延伸反應(yīng)，VH和VL通過所設(shè)計(jì)的互補(bǔ)序列，互為引物及模板合成scFv，再以VH、VL兩端引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即可得到完整的單鏈抗體，此法簡(jiǎn)單易行，不需要在接頭兩端設(shè)計(jì)內(nèi)切酶位點(diǎn)而引入不必要的氨基酸殘基。

1.2 單鏈抗體的表達(dá)

目前單鏈抗體主要在原核表達(dá)系統(tǒng)E.coli中進(jìn)行表達(dá)。大腸桿菌生長(zhǎng)快速,易于操作，轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高，可在短時(shí)間內(nèi)大規(guī)模地生產(chǎn)抗體蛋白，便于純化、分析和應(yīng)用，而且攜帶外源DNA的大腸桿菌的轉(zhuǎn)移僅需最少量的DNA，應(yīng)用大腸桿菌的抗體工程相對(duì)便宜[6-7]。然而，大腸桿菌不能對(duì)重組抗體進(jìn)行翻譯后的糖基化修飾，具有一定的局限性,但目前尚沒有證據(jù)表明糖基化與抗原結(jié)合能力有直接關(guān)系。大腸桿菌表達(dá)scFv主要有兩種形式：一種是表達(dá)為包涵體或非包涵體的不可溶蛋白，表達(dá)產(chǎn)量高，可達(dá)菌體蛋白的5%～30%，但產(chǎn)生的蛋白常常沒有活性，需經(jīng)體外溶解、復(fù)性、重新折疊、色譜純化等許多步驟，方可獲得有活性的單鏈抗體[8]；另一種是分泌性表達(dá)，即在信號(hào)肽序列的指導(dǎo)下，scFv分泌到周質(zhì)腔或培養(yǎng)液中，并完成二硫鍵的形成和肽鏈折疊，成為有活性的可溶性表達(dá)產(chǎn)物。后者可直接表達(dá)出有活性的scFv，但產(chǎn)量低，每升僅含數(shù)毫克[9-10]。

另外，scFv亦可在真核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)。由真核細(xì)胞表達(dá)而形成的抗體分子與天然蛋白質(zhì)一樣能形成鏈間和鏈內(nèi)二硫鍵，維持正確的蛋白構(gòu)象以及翻譯后糖基化加工，并分泌到細(xì)胞外，成為功能性抗體分子。目前，用于表達(dá)單鏈抗體的真核細(xì)胞主要有酵母細(xì)胞、COS細(xì)胞、CHO細(xì)胞、植物細(xì)胞等[11-14]。

2 單鏈抗體庫技術(shù)

單鏈抗體庫技術(shù)是繼雜交瘤技術(shù)之后，在抗體研究領(lǐng)域中出現(xiàn)的又一重大進(jìn)展。該技術(shù)的產(chǎn)生基于三項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展：反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增全套免疫球蛋白可變區(qū)基因、大腸桿菌表達(dá)分泌功能性免疫球蛋白分子片段的成功，以及噬菌體表面表達(dá)技術(shù)的建立。其主要步驟如下：①從免疫或未免疫的生物細(xì)胞中分離抗體可變區(qū)基因；②PCR擴(kuò)增抗體基因片段，隨機(jī)克隆入相應(yīng)載體，從而形成組合文庫；③轉(zhuǎn)化細(xì)菌,表達(dá)產(chǎn)物通過多輪抗原親和吸附，最終篩選出特異性抗體片段。該項(xiàng)技術(shù)的根本優(yōu)勢(shì)在于有效的實(shí)現(xiàn)了基因型和表型的連接，從而使單鏈抗體基因的人工體外進(jìn)化和親和成熟得以實(shí)現(xiàn)，在生物體外即可獲得具有良好生物學(xué)活性的表達(dá)產(chǎn)物。目前，單鏈抗體庫技術(shù)的發(fā)展非常迅速，在抗體表達(dá)和展示手段上，除了較為成熟的噬菌體展示技術(shù)和核糖體展示技術(shù)外，還有細(xì)菌展示、酵母展示、質(zhì)粒展示和mRNA表面展示等多種新型技術(shù)[15]。本文主要闡述目前較為成熟的噬菌體展示和核糖體展示技術(shù)。

2.1 噬菌體展示抗體庫技術(shù)

Smith等于1985年將人工合成的多肽基因插入噬菌體外周蛋白的基因中，并成功地將合成的多肽以多肽－外周蛋白融合的形式表達(dá)到噬菌體的表面，這就是噬菌體表面展示技術(shù)（Phage display）的開始[16]。該技術(shù)的基礎(chǔ)是把外源多肽或蛋白和噬菌體的某種外殼蛋白融合表達(dá)于噬菌體表面，一方面,外源多肽或蛋白被展示于噬菌體表面，具有空間上的可接近性；另一方面，噬菌體殼內(nèi)具有外源多肽或蛋白的編碼序列，由此建立了表型和基因型的聯(lián)系，便于進(jìn)行大規(guī)模的有效篩選和體外進(jìn)化。

噬菌體展示技術(shù)是一個(gè)極為有效的篩選體系，它將序列不相同的一組多樣化的蛋白或肽鏈表達(dá)到噬菌體表面即可得到一個(gè)基因文庫,如通過隨機(jī)合成制備的短肽庫,利用其表型與基因型的統(tǒng)一以及其易于擴(kuò)增的特性，可很容易地從基因文庫篩選出與某種靶分子具有特異結(jié)合能力的克隆。將文庫與固相化的靶分子一起溫育，表達(dá)有靶分子配體的噬菌體顆粒就會(huì)結(jié)合于固相，洗去游離的噬菌體顆粒，將結(jié)合于固相的噬菌體洗脫下來,感染宿主菌進(jìn)行擴(kuò)增，可使特異性菌體得到100～1 000倍的富集。然后再重復(fù)這一過程。這種“吸附-洗脫-擴(kuò)增”的富集過程具有顯而易見的優(yōu)越性：簡(jiǎn)便易行，省時(shí)省力，一輪篩選1～2 d即可完成；篩選能力極強(qiáng),無容量限制,足以應(yīng)付目前技術(shù)所能產(chǎn)生的庫容；可直接得到特異克隆所含有的DNA，便于進(jìn)一步的基因操作。噬菌體展示技術(shù)不但可用來篩選針對(duì)任何靶標(biāo)的親和性多肽,而且能夠用來分析蛋白質(zhì)間相互作用[17]。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，20世紀(jì)90年代初，噬菌體展示技術(shù)應(yīng)用到抗體基因的克隆和表達(dá)，它將編碼抗體分子片段的基因與噬菌體外殼蛋白基因末端融合,使表達(dá)的抗體附著在噬菌體顆粒表面成熟的衣殼蛋白上,從而形成噬菌體抗體文庫。它將組建億萬種不同特異性抗體可變區(qū)基因文庫、抗體在大腸桿菌功能性表達(dá)與高效快速的篩選手段結(jié)合起來，產(chǎn)生了噬菌體抗體庫技術(shù)，成為一個(gè)非常強(qiáng)有力的抗體開發(fā)工具。這一技術(shù)的成功徹底改變了抗體制備的傳統(tǒng)途徑，給抗體基因的篩選工作帶來了革命性的變革，使抗體技術(shù)進(jìn)入到了基因工程抗體時(shí)代。

噬菌體展示抗體庫技術(shù)采用固相化抗原經(jīng)“親和吸附-洗脫-擴(kuò)增”數(shù)個(gè)循環(huán)，可方便、高效地篩選出特異性好、親和力強(qiáng)的噬菌體抗體，含有特異性抗體基因的噬菌體可以直接感染表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行大量生產(chǎn)，也可對(duì)獲得的抗體基因進(jìn)行突變改造以進(jìn)一步提高其特異性和親和性。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是將抗體的基因型和表型緊密聯(lián)系起來；可繞過雜交瘤技術(shù)，不需要復(fù)雜的基因工程技術(shù)；抗體基因篩選的范圍廣；技術(shù)穩(wěn)定、可靠、生產(chǎn)周期短；可規(guī)模化生產(chǎn)；適用范圍廣，既可用于抗體制備，也適用于其他蛋白如激素、酶、藥物、隨機(jī)多肽等的生產(chǎn)[18-19]。

2.2 核糖體展示抗體庫技術(shù)（Ribosome display）

在噬菌體展示技術(shù)發(fā)展的基礎(chǔ)上，近年來，一種新的完全不依賴于細(xì)胞的新技術(shù)-核糖體展示技術(shù)日趨成熟，其文庫容量不受細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的影響,文庫的多樣性和篩選效率得到大大提高，顯示出誘人的應(yīng)用前景。

核糖體展示技術(shù)是20世紀(jì)90年代由Plückthun實(shí)驗(yàn)室在多聚核糖體展示技術(shù)的基礎(chǔ)上改進(jìn)而來的一種完全在體外利用功能性蛋白相互作用進(jìn)行篩選的新技術(shù)，它將正確折疊的蛋白及其mRNA同時(shí)結(jié)合在核糖體上，形成mRNA-核糖體-蛋白質(zhì)三聚體，使目的蛋白的基因型和表型聯(lián)系起來[20]。核糖體展示技術(shù)基本原理是：通過PCR擴(kuò)增目的基因的cDNA文庫，同時(shí)引入T7啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)及莖環(huán)結(jié)構(gòu)，將其轉(zhuǎn)錄成mRNA，在無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)（原核的E.coli S30無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)或真核的兔紅細(xì)胞網(wǎng)質(zhì)裂解系統(tǒng)）中進(jìn)行翻譯，使目的基因的翻譯產(chǎn)物展示在核糖體表面，形成“mRNA-核糖體-蛋白質(zhì)”三元復(fù)合物，構(gòu)成核糖體展示的蛋白文庫，之后利用相應(yīng)的抗原從翻譯混合物中進(jìn)行液相親和篩選，以乙二胺四乙酸（EDTA）解離結(jié)合的核糖體復(fù)合物或以特異抗原洗脫整個(gè)復(fù)合物，并從中分離mRNA。通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）提供下一輪展示的模板，所得DNA進(jìn)入下一輪富集，最終篩選出高親和力的抗體分子[21]。

核糖體展示抗體庫技術(shù)利用抗原抗體特異性結(jié)合的特性，便于蛋白富集和抗體文庫篩選；因其篩選抗體的整個(gè)過程均在體外進(jìn)行，不需要經(jīng)過大腸桿菌轉(zhuǎn)化的步驟，故而不受宿主細(xì)胞及轉(zhuǎn)染效率的限制，較噬菌體展示技術(shù)省時(shí)、省力，可以構(gòu)建更高容量、更高質(zhì)量的抗體庫，更易于篩選高親和力抗體，以及采用體外進(jìn)化的方法對(duì)抗體性質(zhì)進(jìn)行改造[22]。核糖體展示抗體庫技術(shù)代表了抗體工程技術(shù)的未來發(fā)展趨勢(shì)，使基因重組抗體技術(shù)發(fā)展到一個(gè)嶄新的階段。

3 單鏈抗體在農(nóng)獸藥殘留分析方面的應(yīng)用研究

近年來，隨著基因重組抗體技術(shù)日益成熟，單鏈抗體庫技術(shù)在農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染檢測(cè)領(lǐng)域已有不少報(bào)道。Alcocer等以抗乙基毒死蜱單抗的良種雜交瘤細(xì)胞作為抗體基因來源，構(gòu)建噬菌體抗體庫，并以大腸桿菌為載體表達(dá)、制備了高親和力、高特異性的抗乙基毒死蜱單鏈抗體[23]。2002年，Kramer等同樣以單抗雜交瘤細(xì)胞和大腸桿菌表達(dá)載體為基礎(chǔ)[24]，構(gòu)建了噬菌體抗體庫，制備了抗阿特拉津的單鏈抗體，并通過基因定點(diǎn)誘變技術(shù)對(duì)該抗體庫進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化、改善，使scFv對(duì)阿特拉津的敏感性提高了25倍，相應(yīng)的ELISA檢測(cè)限由5.1 μg·kg-1降至0.2 μg·kg-1，同時(shí)其親和力也由1.27×10-8提高至7.64×10-10。Li等用甲胺磷模擬物對(duì)Balb/c小鼠進(jìn)行免疫，利用免疫脾細(xì)胞為基因來源獲取mRNA，構(gòu)建噬菌體抗體庫，最終得到三株特異性較強(qiáng)的單鏈抗體。在競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)中，三株重組抗體的IC50分別為46.25、35.39和17.99 μg·kg-1[25]。

此外，單鏈抗體庫技術(shù)近年來也開始滲入到獸藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域。Korpimaki等利用噬菌體抗體庫技術(shù)制備的重組抗體對(duì)13種磺胺類藥物的交叉反應(yīng)率明顯優(yōu)于傳統(tǒng)單克隆抗體。隨后又對(duì)重組抗體進(jìn)行改造，應(yīng)用獲得的重組抗體建立了能對(duì)18種磺胺類藥物進(jìn)行多殘留檢測(cè)的熒光免疫分析方法[26-28]。國內(nèi)潘科等利用噬菌體展示技術(shù)在雜交瘤細(xì)胞基礎(chǔ)上制備出抗鹽酸克倫特羅重組抗體，其對(duì)克倫特羅的敏感性優(yōu)于其親本代單克隆抗體，交叉反應(yīng)性與單克隆抗體相似[29]。此外，筆者等利用核糖體展示技術(shù)在雜交瘤細(xì)胞基礎(chǔ)上制備出了抗磺胺二甲嘧啶重組抗體[30]。由此可預(yù)知，單鏈抗體技術(shù)在未來農(nóng)獸藥殘留分析中將占據(jù)重要地位。

綜上所述，隨著分子生物學(xué)、分子免疫學(xué)的發(fā)展及各種抗體庫技術(shù)的日趨成熟，單鏈抗體現(xiàn)已廣泛滲入到農(nóng)獸藥等小分子化合物的殘留分析領(lǐng)域中，與此同時(shí)將在未來發(fā)揮重大作用。它借助基因重組抗體技術(shù)，將同類或不同類多種農(nóng)獸藥分子的單鏈抗體基因整合到一起，建立抗體庫，篩選天然重組抗體，并運(yùn)用抗體-獸藥分子定量構(gòu)效關(guān)系模型、氨基酸序列對(duì)比和蛋白質(zhì)同源模擬等技術(shù)進(jìn)一步改造，有望獲得可用于獸藥多殘留快速免疫分析的廣譜性抗體，從而為發(fā)展簡(jiǎn)便、快速、高效的農(nóng)獸藥多殘留免疫分析技術(shù)提供一條嶄新途徑。

4 單鏈抗體技術(shù)的不足與展望

單鏈抗體技術(shù)經(jīng)過了近30年的發(fā)展，從體內(nèi)展示發(fā)展到體外獲得目標(biāo)分子，取得了許多應(yīng)用成果，但是其篩選獲得的一些靶標(biāo)在實(shí)際應(yīng)用時(shí)仍然存在一些問題，如親和力較低，穩(wěn)定性較差，半衰期短等。例如有些單鏈抗體親和力低于其親本單克隆抗體，這就成為它在免疫分析等應(yīng)用中的一個(gè)制約因素，后續(xù)我們可以通過親和力成熟對(duì)單鏈抗體的親和力進(jìn)行改進(jìn)，或者通過構(gòu)建多價(jià)抗體來增加抗體的功能親和性。但是隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，各種技術(shù)手段及分子進(jìn)化水平的不斷提高，上述制約因素將會(huì)被一一剔除。總之，單鏈抗體技術(shù)與其他技術(shù)相比，其優(yōu)勢(shì)是十分明顯的，它以其無可比擬的文庫容量和成熟簡(jiǎn)便的進(jìn)化手段必將顯現(xiàn)其巨大的潛力，在蛋白質(zhì)互作，功能蛋白和多肽的篩選，蛋白分子定向改造，小分子化合物單鏈抗體制備和新藥研制開發(fā)等方面將發(fā)揮重要作用。

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