噬菌體生物擴(kuò)增法直接檢測(cè)痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥性的研究

邊澤源，楊蕓紅，何 川，涂少華，涂榮躍

(江西省胸科醫(yī)院，江西 南昌 330006)

結(jié)核病防治面臨的最大困難是耐藥結(jié)核菌的流行與傳播；快速準(zhǔn)確的一線抗結(jié)核藥物耐藥性測(cè)定是臨床制定合理化療方案的前提；異煙肼是最主要的一線抗結(jié)核藥物之一，還可以作為耐多藥結(jié)核病的標(biāo)志之一。因此，快速準(zhǔn)確測(cè)定異煙肼耐藥性具有重要意義。

國(guó)內(nèi)外已經(jīng)利用分枝桿菌噬菌體D29，對(duì)臨床分離的結(jié)核分枝桿菌菌株進(jìn)行耐藥性檢測(cè)的研究，結(jié)果顯示該方法有較高的特異性、敏感性[1，2]。但利用臨床分離菌株進(jìn)行耐藥性檢測(cè)仍需較長(zhǎng)時(shí)間(3～7周)，沒有真正達(dá)到快速檢測(cè)的目的。我們應(yīng)用噬菌體生物擴(kuò)增法對(duì)臨床痰標(biāo)本直接進(jìn)行異煙肼耐藥性檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果與常規(guī)絕對(duì)濃度法結(jié)果進(jìn)行比較，以評(píng)價(jià)PhaB法的臨床應(yīng)用價(jià)值?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1 .1 待檢痰標(biāo)本40例，痰涂片陽性：痰檢(1＋)30例，痰檢(2＋)9例，痰檢(3＋)1例。源于我院已確診為肺結(jié)核病住院病人、均為臨床擬診為耐藥的肺結(jié)核患者。

1.1 .2結(jié)核分枝桿菌噬菌體試劑盒 (含液體培養(yǎng)等)(FASTPlaque TBTM)購(gòu)自上海金浩科技發(fā)展有限公司，批號(hào)G-0340；生產(chǎn)企業(yè)：英國(guó)BIOTEC Laboratories ltd公司生產(chǎn)。

1.1 .3抗結(jié)核藥液的配制 異煙肼粉末(北京結(jié)核病控制中心參比實(shí)驗(yàn)室提供)用蒸餾水溶解成濃度為1mg/ml，-20℃保存?zhèn)溆?，使用時(shí)用液體培養(yǎng)基將藥物稀釋成 2μg/ml。

1.2 方法

1.2 .1痰標(biāo)本前處理 取合格痰標(biāo)本約5ml，加適量4%的氫氧化鈉，反復(fù)用玻璃棒攪打液化痰液15min；轉(zhuǎn)入50ml離心管，加液體培養(yǎng)基至50ml，4000 r/min離心15min，去上清液，沉淀物加入液體培養(yǎng)基洗滌1次，去上清液，沉淀物加入1.0ml液體培養(yǎng)基混勻。上述前處理標(biāo)本抗酸染色，根據(jù)鏡檢結(jié)果取 0.3ml適當(dāng)稀釋：1～10條/(1000×)稀釋 10倍；10～50 條/(1000×)稀釋 100；＞50 條/(1000×)稀釋 1000[3]。

1.2 .2藥物作用標(biāo)本中的MTB 取上述稀釋標(biāo)本0.1ml+0.1ml異煙肼+0.8ml液體培養(yǎng)基，無菌條件下轉(zhuǎn)移至反應(yīng)管中，37℃孵育48h；對(duì)照組，沉淀物加1m l液體培養(yǎng)基，不加藥物，37℃孵育48h。整個(gè)過程注意無菌操作。吸取1ml液體培養(yǎng)基加于反應(yīng)管中，為“陰性對(duì)照”；取50μl指示細(xì)胞溶液，用液體培養(yǎng)基稀釋106倍，隨后取1ml該稀釋液于反應(yīng)管中，為“陽性對(duì)照”。

1.2 .3噬菌體耐藥測(cè)定 噬菌體浸染、終止侵染、澆注平板、結(jié)果判斷參照文獻(xiàn)方法[4]。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：(無藥管噬菌斑-藥物作用管噬菌斑)/無藥管噬菌斑＞85%為敏感，反之為耐藥。

1.2 .4 MTB的絕對(duì)濃度法藥物敏感性檢測(cè)：同時(shí)取前處理后標(biāo)本按中國(guó)防癆協(xié)會(huì)制定的《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[5]進(jìn)行MTB的分離培養(yǎng)和異煙肼耐藥性的測(cè)定。

2 結(jié)果

兩種方法對(duì)40份痰標(biāo)本中MTB異煙肼耐藥性的檢測(cè)結(jié)果比較(見表1)，PhaB法耐藥23例，敏感17例；絕對(duì)濃度法檢測(cè)，耐藥28例，敏感12例。以絕對(duì)濃度法檢測(cè)結(jié)果為判斷標(biāo)準(zhǔn)，則PhaB法異煙肼耐藥性檢測(cè)的敏感性、特異性、準(zhǔn)確性分別是78.57%(22/28)、91.67%(11/12)、82.50%(33/40)。Kappa檢驗(yàn)，k＝0.63 P=0.00＜0.05，說明 PhaB 法與絕對(duì)濃度法檢測(cè)結(jié)果有較好的一致性。

3 討論

表1 PhaB法與絕對(duì)濃度法檢測(cè)結(jié)果比較

由于結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)緩慢，常規(guī)藥敏試驗(yàn)需3～7周或更長(zhǎng)時(shí)間，不能滿足臨床需要；快速培養(yǎng)儀測(cè)定系統(tǒng)盡管可顯著縮短時(shí)間，但需特殊儀器設(shè)備，價(jià)格昂貴；分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)雖有快速、靈敏的優(yōu)點(diǎn)，但操作煩瑣、技術(shù)要求高，難在臨床常規(guī)應(yīng)用。

PhaB法是一種快速、簡(jiǎn)便的測(cè)定MTB耐藥性的新方法，是由Wilson等[1]于1997年建立，并用于利福平和異煙肼的耐藥性測(cè)定。因與常規(guī)的耐藥性檢測(cè)結(jié)果符合率高，普遍認(rèn)為這是一種極具發(fā)展前景的新方法，使其在結(jié)核病的研究中備受關(guān)注[6-8]?；驹硎欠种U菌噬菌體D29既能感染緩慢生長(zhǎng)的MTB，又能感染快速生長(zhǎng)的恥垢分枝桿菌，因此當(dāng)藥物與MTB作用一定時(shí)間后，耐藥菌能繼續(xù)生長(zhǎng)，并被隨后加入的噬菌體所感染，而敏感株因被藥物殺死，不能被噬菌體感染，未進(jìn)入菌體內(nèi)的噬菌體則被隨后加入的殺毒劑殺死，進(jìn)入菌體內(nèi)的噬菌體不受影響，而在菌體內(nèi)大量繁殖，并將細(xì)菌裂解，釋放出的噬菌體可立即感染隨后加入的指示細(xì)胞，并使其裂解，由于指示細(xì)胞繁殖迅速，所以24h觀察到在培養(yǎng)皿上出現(xiàn)明顯噬菌斑。因此，只要根據(jù)噬菌斑的有無及數(shù)量的多少即可判斷待檢菌株的耐藥性。

由于MTB生長(zhǎng)緩慢，目前多數(shù)研究是用臨床已分離菌株進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，達(dá)不到快速的目的。鑒于國(guó)內(nèi)尚無直接對(duì)痰標(biāo)本中的MTB進(jìn)行耐藥性檢測(cè)研究的報(bào)道，我們參照文獻(xiàn)[4]并略作改進(jìn)，設(shè)計(jì)建立了直接對(duì)痰標(biāo)本快速測(cè)定異煙肼耐藥性的噬菌體生物擴(kuò)增法。本研究結(jié)果表明，PhaB法具有較高的敏感性和特異性，與Shriprakash Kalantri等研究結(jié)果相符[9]。

由此可見，噬菌體生物擴(kuò)增法直接檢測(cè)痰標(biāo)本中異煙肼耐藥性，對(duì)及時(shí)篩查耐藥肺結(jié)核患者有重要的參考價(jià)值,該法簡(jiǎn)單、快速、不需要特殊儀器設(shè)備，4d即可獲得耐藥性測(cè)定結(jié)果，基本能夠滿足臨床診治需求；而且又有較高的敏感性和特異性，非常適合基層推廣使用。此外，PhaB法將活耐藥結(jié)核菌株裂解，對(duì)于有效預(yù)防、控制耐多藥結(jié)核分支桿菌的傳播具有重要意義。

[1]Wilson SM,Al-Suwaidi Z,McNerney R,et al.Evaluation of a new rapid bacteriophage-based method for the drug susceptibilty testing of Mycobacterium tuberculosis[J].NatMed,1997,34:465-468.

[2]王 潔,崔振玲,胡忠義,等.噬菌體法同時(shí)檢測(cè)四種一線抗結(jié)核藥物耐藥性[J].中華傳染病雜志,2006,24(2):102-105.

[3]劉錫光.現(xiàn)代診斷微生物學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2002:726.

[4]彭 麗,陳保文,沈小兵,等.噬菌體生物擴(kuò)增法與改良羅氏比例法在結(jié)核桿菌藥敏檢測(cè)中的比較[J].中國(guó)防癆雜志,2005,27(1):18-22.

[5]中國(guó)防癆協(xié)會(huì)基礎(chǔ)專業(yè)委員會(huì)編著.結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程[M].中國(guó)教育文化出版社,2006.

[6]Carriere C,Riska P,Zimhony O,et al.Conditional replicating luciferase reporter phages:improved sensitivity for rapid detection and assessment of drug susceptibility ofmycobactetrium tuberculosis[J].J Clin Microbiol,1997,35(12):3232-3239．

[7]胡忠義,倪蓮娣,張瑩蓉,等.噬菌體生物擴(kuò)增法在分枝桿菌鑒定和藥敏試驗(yàn)中的應(yīng)用[J].中國(guó)防癆雜志,2003,25(增):63-64.

[8]韓喜琴,高微微,李傳友,等.噬菌體擴(kuò)增法快速篩選結(jié)核分枝桿菌對(duì)抗結(jié)核藥物敏感性的研究[J].中國(guó)防癆雜志,2003,25(增):54.

[9]Kalantri S,PaiM,Pascopella L,et al.Bacteriophage-based tests for the detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical specimens:a systematic review and metaanalysis[J]. BMC Infectious Diseases,2005,5:59.