不同來源微量元素鐵、鋅、錳、銅對羅非魚生長、代謝和非特異性免疫力的影響

林仕梅 潘 瑜 羅 莉 馬 霞 詹若蕊 毛述宏

微量元素是動物維持生命和生產(chǎn)必不可少的營養(yǎng)素之一,在動物飼料中含量雖少,但它們直接或間接地參與機(jī)體幾乎所有生理和生化過程,與動物生長和健康密切相關(guān)。微量元素缺乏或過量都會導(dǎo)致動物生物化學(xué)的、結(jié)構(gòu)的和功能性的病理學(xué)變化[1-2]。當(dāng)今對微量元素的認(rèn)識,無論是從動物種類上、微量元素形式上,還是微量元素供給量以及比例上都有巨大的變革和突破,它對動物的生長、繁殖、免疫、抗病、體形、體色以及肉質(zhì)等都會產(chǎn)生較大的影響[2-4]。影響微量元素生物利用率的因素很多,如動物機(jī)體的生理狀態(tài)、微量元素的化學(xué)形式和數(shù)量以及飼料中存在的一些抗?fàn)I養(yǎng)因子[5-6]。動物對微量元素利用的高低還取決于其吸收狀況,而微量元素的形式是影響其吸收

和利用的主要因素之一。通常,水產(chǎn)飼料中都是以無機(jī)鹽形式補(bǔ)充微量元素。無機(jī)鹽形式的微量元素存在著難吸收、生物利用率低、生化功能差和對環(huán)境污染大的缺點(diǎn)。氨基酸微量元素具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、分子量低、易吸收、生物學(xué)效價高等特點(diǎn)[7-8],已引起動物營養(yǎng)學(xué)家和飼料生產(chǎn)者的高度關(guān)注[9-10],并已廣泛地應(yīng)用到畜禽飼料工業(yè)中[4,7,11],而在水產(chǎn)飼料中相關(guān)的研究報道較少,少量的報道也僅局限在單一的氨基酸微量元素上[12-13],有關(guān)復(fù)合氨基酸微量元素的研究則未見報道。為此,本試驗以吉富羅非魚(Oreochromis niloticus)為試驗對象,在實用飼料配方的基礎(chǔ)上,探討氨基酸微量元素對羅非魚生長、代謝和非特異性免疫力的影響,以期為氨基酸微量元素在水產(chǎn)飼料中的科學(xué)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

微量元素鐵 (Fe)、鋅(Zn)、錳 (Mn)、銅 (Cu)分別以無機(jī)微量元素、氨基酸微量元素和氨基酸微量元素組合體形式添加到吉富羅非魚實用飼料(粗蛋白質(zhì) 32%,總能 14 MJ/kg)中,組成3種試驗飼料,其中無機(jī)微量元素為 FeSO4?H2O、ZnSO4? H2O、MnSO4? H2O、CuSO4? 5H2O,均為飼料級,由成都蜀星飼料有限公司提供;氨基酸微量元素為氨基酸螯合鐵[Fe 15%(15.42%),氨基酸(AA)30%]、氨基酸螯合鋅 [Zn 15%(15.46%),AA 30%]、氨基酸螯合錳[Mn 10%(10.11%),AA 20%]、氨基酸螯合銅[Cu 15%(15.35%),AA 30%],由施普諾生物技術(shù)(成都)有限公司提供,括號內(nèi)為實測值;氨基酸微量元素組合體為氨基酸與 Fe、Zn、Mn、Cu螯合的組合體,即按比例稱取微量元素混勻后,與氨基酸進(jìn)行螯合反應(yīng)配制而成,其中 Fe 8.98%、Zn 4.18%、Mn 1.46%、Cu 0.24%,均為實測值,由施普諾生物技術(shù)(成都)有限公司提供。

試驗飼料 1(無機(jī)組)中微量元素 Fe、Zn、Mn、Cu的添加量分別為 160、80、28、4 mg/kg,試驗飼料 2(有機(jī)組)和 3(有機(jī)組合體組)中 Fe、Zn、Mn、Cu添加量均為試驗飼料 1添加量的 50%,即分別為 80、40、14、2 mg/kg。 3種試驗飼料中 Fe、Zn、Mn、Cu保持相同的比例 ,即均為 40∶20∶7∶1。此外,以不添加微量元素 Fe、Zn、Mn、Cu的試驗飼料為對照飼料。試驗飼料組成及營養(yǎng)水平見表 1。飼料原料均為符合國家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的飼料級原料,飼料原料均粉碎過 40目篩,飼料調(diào)質(zhì)溫度為80℃,分別制成直徑為 2.5 mm的硬顆粒飼料,60℃烘干后保存于 -15℃冰柜中備用。

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗魚選用當(dāng)年培育的全雄性吉富羅非魚魚苗,取自重慶璧山縣魚種場。馴食適應(yīng)環(huán)境 10 d后,選取體質(zhì)健壯、規(guī)格整齊、平均體重為(27.2±0.1)g的吉富羅非魚 360尾,隨機(jī)分成4組,每組設(shè) 3個重復(fù),每個重復(fù) 30尾魚,以重復(fù)為單位飼養(yǎng)在室內(nèi)淡水循環(huán)玻璃水族箱(有效體積為 250 L)中。日投喂率為體重的 4% ～6%,每天 08:30、12:30和 17:30各投喂 1次,每 2周稱重 1次,根據(jù)體重調(diào)整投飼量。每天早上清除箱內(nèi)糞便,并換水 1/4。飼養(yǎng)時間為 8周。養(yǎng)殖水源為曝氣自來水,試驗期間定時對水質(zhì)進(jìn)行監(jiān)控,養(yǎng)殖全程水溫為(27.8±2.2)℃,pH為 7.4±0.4,溶解氧 ＞6.5 mg/L,氨氮 ＜0.50 mg/L,亞硝酸鹽 氮 ＜0.06 mg/L。

1.3 指標(biāo)測定與方法

飼養(yǎng)試驗結(jié)束,禁食 24 h后稱重,計算特定生長率、成活率、蛋白質(zhì)效率和飼料系數(shù);每箱取 3尾魚作為全魚樣品,用于體組成的測定;每箱取 3尾魚于尾靜脈取血,置 4℃冰箱過夜,于 4℃條件下以 6 000 r/min離心 10 min,收集血清,-20℃保存?zhèn)溆?每箱取 3尾魚采用搗毀脊髓法處死,取出肝胰臟,立即放入液氮罐中速凍,然后轉(zhuǎn)入-80℃低溫冰箱保存。肝胰臟勻漿液在 10 000×g 4℃條件下離心 30 min,取上清液作為酶活性分析樣品,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

飼料原料及魚體樣品均在 105℃烘干至恒重,然后進(jìn)行營養(yǎng)成分測定。采用凱氏定氮法測定樣品的總氮含量,將測定結(jié)果乘以 6.25即得粗蛋白質(zhì)含量,粗脂肪含量采用索氏抽提法測定,粗灰分含量采用高溫(550℃)灰化法測定[14]。

肝胰臟谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、銅鋅超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)以及血清過氧化氫酶(CAT)、堿性磷酸酶(AKP)和溶菌酶活性均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測定。GOT、GPT的活性單位定義為每毫克組織蛋白質(zhì)與基質(zhì)在 37℃下作用 60 min,生成 1μmol丙酮酸所需要的酶為 1個卡門氏單位;T-SOD、CuZn-SOD的活性單位定義為每毫克組織蛋白質(zhì)在 1 mL反應(yīng)液中超氧化物歧化酶(SOD)抑制率達(dá) 50%時所反應(yīng)的SOD量為 1個國際單位(U);CAT的活性單位定義為 25℃、p H 7.0條件下,每分鐘分解 1μmol CAT所需的酶的量為 1個國際單位;AKP的活性單位定義為 100 mL血清在 37℃與底物作用 15 min產(chǎn)生 1 mg酚所需要的酶的量為 1個金氏單位;溶菌酶的活性單位定義為每分鐘吸光值減少 0.001所需血清的量為 1個國際單位。組織中蛋白質(zhì)含量采用Bradford[15]方法測定。

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(air-dry basis) %

1.4 計算公式

特定生長率(specific growth rate,SGR,%d)=100×[ln末重(g)-ln初重(g)]/試驗天數(shù)(d);

蛋白質(zhì)效率(protein efficiency ratio,PER,%)=100×魚體增重(g)/蛋白質(zhì)攝人量(g);

飼料系數(shù)(feed conversion ratio,FCR)=總干物質(zhì)攝食量(g)/魚體總增重(g);

成活率(survival rate,SR,%)=100×終末魚尾數(shù) (只)/初始魚尾數(shù)(只)。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)均以平均值表示,采用 SPSS 11.0對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA),若差異達(dá)到顯著,則進(jìn)行 Tukey多重比較,顯著性水平為 P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同來源微量元素 Fe、Zn、Mn、Cu對羅非魚生長性能的影響

由表 2可知,飼料中補(bǔ)充不同來源的微量元素Fe、Zn、Mn、Cu后,羅非魚的末重 、SGR均顯著升高(P＜0.05),同時有機(jī)組和有機(jī)組合體組羅非魚的末重、SGR均顯著高于無機(jī)組(P＜0.05)。各組羅非魚的 PER表現(xiàn)出與 SGR相同的趨勢。此外,有機(jī)組羅非魚的末重、PER均顯著高于有機(jī)組合體組(P＜0.05)。羅非魚的 FCR與 PER表現(xiàn)出相反的趨勢,即對照組 ＞無機(jī)組 ＞有機(jī)組合體組 ＞有機(jī)組,各組間差異均達(dá)到顯著水平(P＜0.05)。試驗期間,各組羅非魚的成活率均為 100%。

表2 不同來源微量元素 Fe、Zn、Mn、Cu對羅非魚生長性能的影響Table 2 Effects of different sources of iron,zinc,manganese and copper on growth performance of tilapia

2.2 不同來源微量元素 Fe、Zn、Mn、Cu對羅非魚體組成的影響

由表 3可知,不同來源微量元素 Fe、Zn、Mn、Cu對羅非魚魚體干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分含量以及肥滿度的影響均無顯著差異(P＞0.05)。

表3 不同來源微量元素 Fe、Zn、Mn、Cu對羅非魚體組成的影響Table 3 Effects of different sources of iron,zinc,manganese and copper on body composition of tilapia %

2.3 不同來源微量元素 Fe、Zn、Mn、Cu對羅非魚肝胰臟代謝酶活性的影響

由表 4可知,飼料中補(bǔ)充不同來源的微量元素Fe、Zn、Mn、Cu后,羅非魚肝胰臟 GPT和 GOT活性顯著升高(P＜0.05)。羅非魚肝胰臟 GPT活性表現(xiàn)為:對照組 ＜無機(jī)組 ＜有機(jī)組合體組 ＜有機(jī)組,各組間差異均達(dá)到顯著水平(P＜0.05)。各組羅非魚的 GOT表現(xiàn)出與 GPT相同的趨勢,但有機(jī)組合體組與有機(jī)組間差異不顯著(P＞0.05)。

表4 不同來源微量元素 Fe、Zn、Mn、Cu對羅非魚肝胰臟代謝酶活性的影響Table 4 Effects of different sources of iron,zinc,manganese and copper on the metabolic enzyme activities in hepatopancreas of tilapia 卡門氏單位/mg

2.4 不同來源微量元素 Fe、Zn、Mn、Cu對羅非魚非特異性免疫指標(biāo)的影響

由表 5可知,飼料中補(bǔ)充微量元素 Fe、Zn、Mn、Cu后,羅非魚肝胰臟 T-SOD、CuZn-SOD和血清的CAT、AKP、溶菌酶活性均顯著升高(P＜0.05)。有機(jī)組羅非魚肝胰臟 T-SOD活性最高,其次是有機(jī)組合體組,隨后是無機(jī)組,對照組最差。羅非魚肝胰臟CuZn-SOD活性以有機(jī)組合體組最高,其次是有機(jī)組,隨后是無機(jī)組,對照組最差。羅非魚血清 CAT活性表現(xiàn)為:對照組 ＜無機(jī)組 ＜有機(jī)組合體組 ＜有機(jī)組,各組間差異均達(dá)到顯著水平(P＜0.05)。有機(jī)組合體組與有機(jī)組羅非魚血清 AKP和溶菌酶活性均顯著高于無機(jī)組和對照組(P＜0.05),但無機(jī)組與對照組間以及有機(jī)組合體組與有機(jī)組間均差異不顯著(P＞0.05)。

3 討 論

本試驗結(jié)果表明,氨基酸微量元素能夠顯著改善羅非魚的生長,是羅非魚飼料中最有效的微量元素補(bǔ)充形式,這與在虹鱒、斑點(diǎn)叉尾鮰上的研究結(jié)果一致[12-13,16]。眾所周知,微量元素 Fe、Zn、Mn、Cu是人類和動物生長的必需營養(yǎng)素。Zn缺乏明顯抑制胰島素樣生長因子 -Ⅰ(IGF-Ⅰ)、受體生長激素和生長激素結(jié)合蛋白 mRNA的表達(dá)[17-18]。像IGF-Ⅰ一樣,Zn能夠促進(jìn)骨膠原蛋白的合成,繼而刺激骨骼的生長[19-20]。補(bǔ) Zn能顯著提高 IGF-Ⅰ基因表達(dá)水平,與 ZnSO4相比,蛋氨酸鋅更大幅度地提高 IGF-Ⅰ mRNA表達(dá),從而有效地促進(jìn)小鼠生長[21]。本試驗中氨基酸微量元素的供給量僅為無機(jī)鹽微量元素的 50%,卻能夠顯著促進(jìn)羅非魚的生長。Paripatananont等[12]的試驗也證明,當(dāng)用蛋氨酸鋅代替 ZnSO4時,可使斑點(diǎn)叉尾鮰飼料中 Zn的需要量減少 70%。微量元素螯合物中的金屬離子在配位體(如氨基酸)的保護(hù)下,可有效地抵御與其他離子生成難溶的無機(jī)鹽,緩解礦物質(zhì)間的拮抗競爭作用,從而減少了營養(yǎng)物質(zhì)的損失,增強(qiáng)了其吸收利用的程度。此外,氨基酸微量元素既是機(jī)體吸收金屬離子的主要形式,又是動物體內(nèi)合成蛋白質(zhì)過程中的中間物質(zhì),所以氨基酸微量元素不僅吸收快,而且可以節(jié)省許多生化過程,節(jié)約體能消耗[22],這些因素致使氨基酸微量元素比無機(jī)微量元素具有更高的生物學(xué)效價。在其他動物如豬[23]、雞[24-25]、山羊[11]、鮑魚[26]上也有類似的研究報道。

以天然飼料來構(gòu)成動物飼料往往缺乏 1種或數(shù)種微量元素,需要在飼料中額外添加。本試驗結(jié)果表明,飼料中補(bǔ)充微量元素后羅非魚的生長性能得到顯著的改善。這說明羅非魚飼料中補(bǔ)充微量元素是非常必要的。微量元素生物利用率的研究多集中在無機(jī)微量元素方面,而有關(guān)有機(jī)微量元素或飼料中微量元素生物利用率的研究報道則較少。本試驗中,氨基酸微量元素的添加量僅為無機(jī)微量元素的50%,卻能顯著提高羅非魚的生長,說明有機(jī)微量元素的利用率高于無機(jī)微量元素。再者,有機(jī)微量元素產(chǎn)品價格較高,而且對這類有機(jī)產(chǎn)品的化學(xué)特性還缺乏一種行之有效的檢測方法,如產(chǎn)品螯合率的定量測定,這些因素限制了其研究和應(yīng)用。因此,無論從提高魚類生產(chǎn)的效益,還是從環(huán)境保護(hù)角度來講,以氨基酸(肽)微量元素作為水產(chǎn)動物飼料添加劑,具有廣闊的應(yīng)用前景,深入研究適合動物機(jī)體的最佳螯合物結(jié)構(gòu)形式、最佳添加比例以及氨基酸(肽)微量元素的作用機(jī)制也是非常迫切的。

表5 微量元素 Fe、Zn、Mn、Cu對羅非魚非特異性免疫指標(biāo)的影響Table 5 Effects of different sources of iron,zinc,manganese and copper on non-specific immune indices in tilapia

目前,氨基酸微量元素的研究僅局限在單一氨基酸的單一微量元素螯合物方面[12-13]。本試驗探討了復(fù)合氨基酸微量元素 (Fe、Zn、Mn、Cu)對羅非魚生長的影響,國內(nèi)外還未見這方面的研究報道。結(jié)果表明,羅非魚的生長效果得到顯著改善。一方面可能是復(fù)合氨基酸微量元素減輕或避免了微量元素間拮抗競爭作用,并且氨基酸(肽)的微量元素螯合物具有類似二肽的結(jié)構(gòu),又消減了氨基酸吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)的競爭;另一方面位于五元或六元環(huán)螯合物中心的金屬可以通過小腸絨毛刷狀緣,以氨基酸或肽的形式被吸收,從而使微量元素吸收和利用效率提高[27]。本試驗中,氨基酸微量元素組合體的作用效果雖優(yōu)于無機(jī)微量元素,但要低于單一氨基酸微量元素的同時添加,這還需要從組合比例、配位體以及螯合強(qiáng)度等方面深入研究。

轉(zhuǎn)氨酶與動物體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝密切相關(guān),通常被認(rèn)為是肝臟功能正常與否的標(biāo)志,當(dāng)肝臟細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)受損時,GOT和 GPT釋放進(jìn)入血液造成血液轉(zhuǎn)氨酶活性升高。本試驗中,有機(jī)組羅非魚肝胰臟蛋白質(zhì)代謝酶 GOT和 GPT活性最高,有機(jī)組合體組次之,無機(jī)組再次之,對照組最低,表明飼料中蛋白質(zhì)的利用受到影響,PER的變化趨勢也進(jìn)一步證實了這個看法。這在一定程度上是因為肝胰臟受到損傷的緣故所致,說明不同來源的微量元素對肝胰臟的影響程度是不同的。

氨基酸微量元素由于其特殊的結(jié)構(gòu),較好的化學(xué)穩(wěn)定性,能夠減少吸收過程中自由基的形成,增強(qiáng)殺菌能力,調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力,提高抗病及抗應(yīng)激能力,從而提高動物的生產(chǎn)性能[28]。魚體內(nèi)有天然的抗氧化系統(tǒng)去除自由基,以維持正常的生理功能,其中包括 CAT、SOD等抗氧化酶[29],這 2種酶的測定常用于間接反映體內(nèi)自由基反應(yīng)的動態(tài)變化及組織損傷情況,而 Zn、Mn、Cu是 SOD的組成成分,Fe作為 CAT的輔助因子,是保持其活性所不可缺少的。AKP的活性可以作為預(yù)測臨床疾病診斷及環(huán)境污染程度的重要指標(biāo),在機(jī)體的防御中起著重要作用,Zn是 AKP的重要組成部分。溶菌酶是魚體內(nèi)重要的非特異性免疫因子,是魚體生理防御水平的重要標(biāo)志,其活性受遺傳、溫度、食性等諸多因素的影響。本試驗中添加不同來源的微量元素 Fe、Zn、Mn、Cu后,不同程度提高了魚體營養(yǎng)水平,進(jìn)而提高了羅非魚血清的溶菌酶活性。因此,微量元素對于機(jī)體的防御系統(tǒng)是相當(dāng)重要的。本研究表明氨基酸微量元素顯著提高了羅非魚的非特異性免疫力,證實了Tan等[26]關(guān)于氨基酸螯合態(tài)微量元素可提高魚體抗病力的判斷。Paripatananont等[12]的研究也表明,蛋氨酸鋅替代硫酸鋅后可提高斑點(diǎn)叉尾鮰經(jīng) Edwardsiella ictaluri攻毒后的存活率。Dudley-Cash[30]報道,給肉雞補(bǔ)充蛋氨酸錳和蛋氨酸鋅可減少肉雞球蟲病的發(fā)生,降低因球蟲病所致的死亡率。這些研究表明,飼料中不同來源的微量元素能夠顯著影響?zhàn)B殖動物的免疫系統(tǒng),從而使其免疫應(yīng)答反應(yīng)出現(xiàn)差異。由此可見,氨基酸微量元素對于維持動物機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)和提高抗病力是不可缺少的營養(yǎng)素添加劑。

4 結(jié) 論

①羅非魚飼料中適當(dāng)添加微量元素是必要的,但不同形態(tài)的微量元素的促生長效果也不盡相同。

②氨基酸微量元素比無機(jī)微量元素能更有效地促進(jìn)羅非魚的生長,降低飼料系數(shù)。

③氨基酸微量元素能夠顯著提高羅非魚的非特異性免疫力,可以廣泛應(yīng)用于羅非魚的養(yǎng)殖生產(chǎn)。

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