一種有效檢測(cè)水稻葉鞘低豐度蛋白的方法

王瑩,崔為同,楊明峰,沈世華＊

(1.中國(guó)科學(xué)院北京植物所,北京100093;2.中國(guó)科學(xué)院研究生院,北京100049)

蛋白質(zhì)組學(xué)研究已成為21世紀(jì)生命科學(xué)的重要戰(zhàn)略前沿,《科學(xué)》雜志將其列為六大研究熱點(diǎn)之一[1]。在后基因組時(shí)代蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展迅速,對(duì)于探索基因功能日趨重要[2]。作為有力的分子生物學(xué)手段,蛋白質(zhì)組學(xué)已被用來(lái)研究水稻(Oryza sativa)等作物生長(zhǎng)發(fā)育和環(huán)境脅迫下蛋白質(zhì)的表達(dá)[3-5]。

蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的關(guān)鍵步驟之一是樣品的制備和分離。盡管色譜、同位素親和標(biāo)簽(ICAT)和蛋白微列陣等技術(shù)已成功應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析[6,7],雙向凝膠電泳技術(shù)(2-DE)仍然是目前分析大量復(fù)雜蛋白樣品的常用工具[8]。樣品的制備是影響2-DE有效分辨率的關(guān)鍵因素,而蛋白分辨率可影響凝膠圖像質(zhì)量和蛋白分布[9]。蛋白樣品的電泳分離常被一種或幾種含量極度豐富的蛋白干擾,這些“超高豐度蛋白”限制低豐度蛋白的分辨率[10],而且數(shù)量龐大,可遮蓋鄰近蛋白點(diǎn)或影響其他蛋白點(diǎn)的電泳遷移[11,12]。例如,核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶(rubicso)是光合作用中CO2固定的關(guān)鍵酶,也是植物中含量最豐富的蛋白[13]。葉片中rubisco含量非常豐富,在電泳共遷移過(guò)程中影響或遮蓋鄰近蛋白點(diǎn)[14],進(jìn)而降低2-DE對(duì)低豐度蛋白的檢測(cè)率。

降低樣品體系復(fù)雜性,分離富集低豐度蛋白質(zhì)的各種預(yù)分離技術(shù)近年來(lái)發(fā)展較快,并與現(xiàn)有的分離技術(shù)相結(jié)合,大幅度提高了低豐度蛋白的檢測(cè)率[9,11,15-21]。但是,多數(shù)預(yù)分離技術(shù)比較昂貴或是耗時(shí)較長(zhǎng)。PEG沉淀法是其中一種能夠簡(jiǎn)單、快速地富集低豐度蛋白質(zhì)的預(yù)分離方法。Sun等[22]采用20%PEG預(yù)處理水稻蛋白樣品,rubisco大亞基為主的高豐度蛋白被分離到沉淀部分,取得很好的分離效果;Xi等[23]采用PEG分離法檢測(cè)擬南芥(Arabidopsis thaliana)中低豐度蛋白,報(bào)道rubisco大亞基可被16%PEG沉淀;Lee等[24]采用15%PEG分離法檢測(cè)了水稻幼苗葉片中響應(yīng)低溫脅迫的低豐度蛋白,取得了良好分離效果。

水稻、玉米(Zea mays)和小麥(Triticum aestivum)等禾谷類植物被廣泛研究[25-28]。葉鞘常被作為研究禾谷類作物庫(kù)源轉(zhuǎn)化的特殊器官[29],已有關(guān)于水稻灌漿期葉鞘蛋白質(zhì)組學(xué)分析的報(bào)道[30]。葉鞘也進(jìn)行一部分光合作用,因此該器官內(nèi)也含有大量光合作用相關(guān)酶類,尤其是 rubisco的存在嚴(yán)重干擾葉鞘低豐度蛋白的檢測(cè)和分析,目前尚無(wú)提高葉鞘低豐度蛋白鑒定率的報(bào)道。本研究分別采用15%和20%PEG預(yù)分離法富集低豐度蛋白,旨在探索一種葉鞘低豐度蛋白的鑒定方法,為單子葉植物葉鞘蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

將水稻9311(Oryza sativa ssp.indica cultivar 93-11)于正常水稻生長(zhǎng)季節(jié)種植于北京中國(guó)科學(xué)院植物研究所實(shí)驗(yàn)溫室內(nèi),常規(guī)水肥管理。自然光照下,生長(zhǎng)70 d左右,待水稻生長(zhǎng)至灌漿期,剪取水稻劍葉的葉鞘作為實(shí)驗(yàn)材料,液氮速凍后儲(chǔ)藏于-80℃冰箱里。

1.2 蛋白質(zhì)提取

1.2.1 Mg/NP-40法 蛋白質(zhì)提取方法參照Kim等[31]的方法,略作修改。將0.5 g材料在液氮中研磨成精細(xì)的粉末,然后加入3 mL預(yù)冷的Mg/NP-40提取液[0.5 mol/L T ris-HCl(pH 8.3),2%(v/v)乙基苯基聚乙二醇(NP-40),20 mmol/L氯化鎂,1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF),2%(v/v)β-巰基乙醇],在冰上充分研磨。4℃下12 791 r/min離心勻漿液10 min,棄沉淀。上清液中加入4倍體積丙酮,-20℃沉淀30 min。相同條件下再次離心后,棄上清。沉淀用丙酮清洗,4℃下12 791 r/min離心10 min,清洗3次。將沉淀真空干燥即得到可溶性全蛋白干粉(NF)。

1.2.2 Mg/NP-40法(PEG預(yù)分離) PEG沉淀方法參照Kim等[31]和Yang等[32]的方法,并作修改。將0.5 g材料在液氮中研磨成精細(xì)的粉末,然后加入3 mL預(yù)冷的Mg/NP-40提取液,在冰上研磨充分。4℃下12 791 r/min離心10 min,棄沉淀。上清中加入50%(w/v)PEG-4000至終濃度為15%或20%(w/v)?；靹?冰上沉淀30 min。4℃下12 791 r/min離心10 min。離心后上清加入4倍體積丙酮,置于-20℃沉淀30 min。4℃下12 791 r/min離心10 min,取沉淀用丙酮清洗4次后真空干燥得到15%或20%PEG預(yù)分離上清組分(AF1或BF1)。離心后沉淀用丙酮清洗4次,真空干燥得到15%或20%PEG預(yù)分離沉淀組分(AF2或BF2)。

1.3 雙向凝膠電泳

雙向凝膠電泳方法參照Yang等[32]的方法,略作修改。將蛋白干粉溶于裂解液:7 mol/L尿素,2 mol/L硫脲,4%(w/v)3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽,2%(v/v)兩性電解質(zhì)(pH 3.5～10),5%(v/v)β-巰基乙醇,1%(w/v)二硫蘇糖醇。NF、AF1、AF2、BF1和BF2蛋白上樣量均為600 μ g。第一向等電聚焦(IEF)在長(zhǎng)13cm、直徑3mm的玻璃管內(nèi)進(jìn)行。注射器灌膠[2%(v/v)NP-40,3.6%(w/v)丙烯酰胺,8 mol/L尿素,2.5%(v/v)兩性電解質(zhì)(pH 3.5～10),2.5%(v/v)兩性電解質(zhì)(pH 5～8)]。膠條聚合完全后,加入溶有蛋白樣品的裂解液,其上覆蓋30 μ L的50%裂解液。最后加入上槽電極緩沖液(20 mmol/L氫氧化鈉)及下槽電極緩沖液(6.67 mmol/L磷酸),等點(diǎn)聚焦200,400和800 V分別進(jìn)行0.5,15和1 h。聚焦完畢后,從凝膠管中取出膠條,放入平衡緩沖液[62.5 mmol/L Tris-HCL(pH 6.8),2.5%(w/v)十二烷基磺酸鈉,10%(v/v)甘油,5%(v/v)β-巰基乙醇]中。振蕩平衡2次,每次15 min。然后轉(zhuǎn)移膠條至分離膠濃度為15%,濃縮膠濃度為5%的聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)上端進(jìn)行第二向垂直電泳。雙向電泳后,使用0.1%的考馬斯亮藍(lán)R-250(CBB-R-250)染色。

1.4 蛋白質(zhì)凝膠掃描及圖像分析

脫色后的凝膠用UMAX掃描儀掃描。使用ImageMaster凝膠分析軟件對(duì)凝膠進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

所得數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 14.0軟件統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 2-DE圖譜

為測(cè)試PEG分離法是否適用于灌漿期水稻葉鞘低豐度蛋白的鑒定,分別將可溶性全蛋白(NF)、15%PEG預(yù)分離的上清蛋白(AF1)、15%PEG預(yù)分離的沉淀蛋白(AF2)、20%PEG預(yù)分離的上清蛋白(BF1)和20%PEG預(yù)分離的沉淀蛋白(BF2)進(jìn)行2-DE(圖1)。

經(jīng)ImageMaster 2D Platinum軟件分析,并計(jì)算各提取方法所檢測(cè)到的總蛋白種類(表1)。15%和20%PEG沉淀法預(yù)分離上清分別檢測(cè)到642和806個(gè)蛋白點(diǎn),而沉淀分別檢測(cè)到882和695個(gè)蛋白點(diǎn)。TCA/丙酮法檢測(cè)到733個(gè)蛋白點(diǎn),除去上清與沉淀中重疊的蛋白點(diǎn),15%和20%PEG沉淀法檢測(cè)到的蛋白點(diǎn)分別為1 042和1 023個(gè)。15%和20%PEG沉淀法所得的蛋白點(diǎn)大概相同,均顯著(P<0.05)高于TCA/丙酮法檢測(cè)到的蛋白點(diǎn)數(shù)。

圖1 PEG預(yù)分離各組分與對(duì)照凝膠電泳圖譜Fig.1 Comparison of 2-DE gel electrophoresis protein patterns of Mg/NP-40 method with PEG fractionation(AF1,AF2,BF1,BF2)and no PEG fractionation(NF)

表1 不同分離方法的2-DE圖譜上蛋白點(diǎn)數(shù)Table 1 Number of spots of different methods

2.2 rubisco大亞基

NF的2-DE圖譜上rubisco大亞基蛋白點(diǎn)影響或遮蓋其周圍的蛋白點(diǎn)(圖2)。經(jīng)PEG沉淀后AF1和BF1圖譜上的rubisco大亞基顯著減小(P<0.05)。采用ImageMaster 2D軟件分析,以計(jì)算rubisco大亞基相對(duì)蛋白點(diǎn)體積在經(jīng)PEG沉淀后的變化(圖3)。未經(jīng)PEG預(yù)分離的全蛋白圖譜上,rubisco大亞基占全部蛋白的16.9%。經(jīng)15%PEG沉淀后,rubisco大亞基下降55.9%,20%PEG沉淀后下降92.7%?？梢?jiàn),20%PEG沉淀rubisco的效果較好。

2.3 低豐度蛋白

與未經(jīng)PEG分離提取的蛋白2-DE圖譜相比較,PEG預(yù)分離后上清蛋白2-DE圖譜上檢測(cè)到的蛋白點(diǎn)的數(shù)目增多。如圖4所示,僅在2-DE圖譜的B和C兩個(gè)小區(qū)域上,PEG預(yù)分離法的采用使得可檢測(cè)蛋白點(diǎn)的數(shù)目顯著增多。

參照Krishnan和Natarajan[33]的方法,將PEG預(yù)分離上清蛋白2-DE膠上表達(dá)上調(diào)3倍以上,且在可溶性全蛋白圖譜上很微弱或檢測(cè)不到的蛋白點(diǎn),認(rèn)為是PEG預(yù)分離法檢測(cè)到的低豐度蛋白點(diǎn)。使用ImageMaster 2D軟件,將AF1和BF1的2-DE圖譜分別與NF進(jìn)行比較分析。結(jié)果顯示,AF1的2-DE膠上可檢測(cè)到低豐度蛋白點(diǎn)共有62個(gè),而B(niǎo)F1可檢測(cè)到119個(gè)。顯然,20%PEG沉淀法可檢測(cè)到灌漿期水稻葉鞘中更多種類的低豐度蛋白。

圖2 PEG預(yù)分離法沉淀 rubisco大亞基效果Fig.2 PEG fractionation decreased rubisco large subunit in 2-DE analysis

圖3 不同分離方法2-DE圖譜rubisco大亞基相對(duì)豐度百分比Fig.3 Relative spot volume of rubisco large subunit using different methods

3 討論

在現(xiàn)今的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中,低豐度蛋白備受關(guān)注。細(xì)胞或組織中受體分子、信號(hào)分子等參與基因表達(dá)調(diào)控的蛋白均是低豐度蛋白,而在細(xì)胞中拷貝數(shù)眾多的高豐度蛋白,如rubisco等一般不參與基因調(diào)控[8]。結(jié)合雙向凝膠電泳的預(yù)分離技術(shù)已成為蛋白質(zhì)組學(xué)中分析低豐度蛋白的有力工具。

圖4 PEG分離法增加2-DE圖譜上可檢測(cè)低豐度蛋白點(diǎn)數(shù)目Fig.4 15%and 20%PEG fractionation increased detectable proteins in 2-DE analysis

以rubisco為主的高豐度蛋白的存在嚴(yán)重影響葉片低豐度蛋白的檢測(cè)和分析,文獻(xiàn)報(bào)道PEG分離法主要是分離沉淀rubisco大亞基[22-24]。本研究采用簡(jiǎn)便PEG預(yù)分離方法去除水稻葉鞘中的rubisco,探索適用于水稻葉鞘低豐度蛋白的檢測(cè)方法。前人報(bào)道證明PEG可有效分離沉淀rubisco,而不同樣品蛋白的預(yù)分離所需PEG濃度不同。本研究分別采用15%和20%PEG,以測(cè)定適用于葉鞘低豐度蛋白檢測(cè)的PEG濃度。

與未經(jīng)PEG預(yù)分離的方法相比較,15%PEG沉淀可使rubisco大亞基相對(duì)蛋白點(diǎn)體積下降55.9%,而20%PEG沉淀法可降低92.7%。采用20%PEG預(yù)分離水稻葉鞘蛋白,可有效去除rubisco大亞基。PEG預(yù)分離的目的是富集低豐度蛋白,15%PEG沉淀法可檢測(cè)到62個(gè)低豐度蛋白,而20%PEG可檢測(cè)到119個(gè)。證明20%PEG對(duì)于灌漿期水稻葉鞘高豐度蛋白的減少和低豐度蛋白的富集效果顯著。與傳統(tǒng)的未經(jīng)PEG預(yù)分離的TCA/丙酮法相比,采用15%和20%PEG分別預(yù)分離后經(jīng)2-DE檢測(cè)到的全蛋白種類均顯著升高(P<0.05),而2種濃度PEG沉淀方法所檢測(cè)到全蛋白種類差異并不顯著。由此看來(lái),20%PEG預(yù)分離方法不僅適于低豐度蛋白的鑒定,也適用于全蛋白表達(dá)的鑒定。

4 結(jié)論

PEG沉淀法是富集低豐度蛋白的方法之一。本研究采用水稻葉鞘為材料,分析了不同濃度PEG對(duì)rubisco的分離效果。研究發(fā)現(xiàn),20%PEG分離法非常適合于鑒定水稻葉鞘中的低豐度蛋白,這些工作可為進(jìn)一步研究水稻葉鞘差異蛋白質(zhì)組學(xué)提供參考。

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