泌尿系統(tǒng)組織工程支架材料膠原蛋白-殼聚糖及聚乙烯醇-絲膠的生物相容性評(píng)價(jià)

何竑超 李偉 竇紅靜 王曉晶 劉偉 孫康 沈周俊

泌尿系統(tǒng)組織工程支架材料膠原蛋白-殼聚糖及聚乙烯醇-絲膠的生物相容性評(píng)價(jià)

何竑超 李偉 竇紅靜 王曉晶 劉偉 孫康 沈周俊

目的評(píng)價(jià)復(fù)合材料膠原蛋白-殼聚糖、聚乙烯醇-絲膠作為泌尿系統(tǒng)組織工程支架的生物相容性和生物安全性。方法采用溶血實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)膠原蛋白-殼聚糖、聚乙烯醇-絲膠兩種復(fù)合材料對(duì)紅細(xì)胞功能和代謝的影響；采用皮膚致敏實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)兩種材料是否滿足體內(nèi)植入的要求；采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法評(píng)價(jià)膠原蛋白-殼聚糖、聚乙烯醇-絲膠兩種復(fù)合材料對(duì)泌尿上皮細(xì)胞和膀胱平滑肌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖的影響。結(jié)果膠原蛋白-殼聚糖和聚乙烯醇-絲膠的溶血率分別為1.86%和2.08%（均＜5%），兩種材料不引起溶血反應(yīng)。與陰性對(duì)照組相比，兩種材料皮膚致敏實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均為陰性，沒(méi)有致敏作用。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)（四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法）顯示兩種材料細(xì)胞毒性均為0級(jí)。結(jié)論復(fù)合生物材料膠原蛋白-殼聚糖、聚乙烯醇絲膠具有良好的生物相容性，有望作為組織工程支架材料，應(yīng)用于泌尿系統(tǒng)的修復(fù)重建。

膠原蛋白-殼聚糖聚乙烯醇-絲膠生物相容性組織工程

目前，對(duì)泌尿系統(tǒng)肌性管腔的修復(fù)主要采用自體器官替代的方法，但這種方法破壞了自身其他器官的完整性和連續(xù)性，而產(chǎn)生一系列不可避免的并發(fā)癥[1－2]。因此，組織工程技術(shù)成為未來(lái)泌尿系統(tǒng)修復(fù)重建的重要手段和發(fā)展方向。組織工程學(xué)是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)、材料科學(xué)和醫(yī)學(xué)生物工程學(xué)的基本原理，將體外培養(yǎng)擴(kuò)增后具有生物學(xué)活性及特定功能的細(xì)胞與支架材料復(fù)合，以修復(fù)及重建組織缺損，繼而恢復(fù)組織或器官的部分或全部功能[3]。支架材料是組織工程研究的核心內(nèi)容之一。本實(shí)驗(yàn)按照有關(guān)生物安全性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)天然復(fù)合材料膠原蛋白-殼聚糖和人工合成高分子復(fù)合材料聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol，PVA）-絲膠進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)，以探討其作為泌尿系統(tǒng)組織工程支架的生物相容性和生物安全性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性新西蘭大白兔12只（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供），2.0～2.4 Kg。其中，3只用于尿路上皮細(xì)胞及膀胱平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)和擴(kuò)增，另9只分為3組，用于皮膚致敏實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

膠原蛋白-殼聚糖、PVA-絲膠由上海交通大學(xué)材料學(xué)院研制提供。

1.3 尿路上皮細(xì)胞、膀胱平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)和擴(kuò)增

參照文獻(xiàn)[4]的方法進(jìn)行。

1.4 材料浸提液制備

浸提介質(zhì)為0.9%生理鹽水（按浸提介質(zhì)∶樣品表面積=1 mL∶3cm2），溶血實(shí)驗(yàn)中浸提介質(zhì)于37℃浸提1 h；致熱源實(shí)驗(yàn)、皮膚致敏實(shí)驗(yàn)中浸提介質(zhì)37℃浸提48 h，0.22 μm微孔濾器濾過(guò)除菌，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 溶血實(shí)驗(yàn)

試管中加入實(shí)驗(yàn)樣品浸提液0.2 mL、測(cè)試用紅細(xì)胞懸液0.2 mL和生理鹽水0.6 mL，混合均勻，37℃水浴60 min，750 r/min離心5 min，取上清液，545 nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度。以0.9%生理鹽水為陰性對(duì)照，蒸餾水為陽(yáng)性對(duì)照。每組設(shè)平行樣品5個(gè)。根據(jù)公式計(jì)算材料的溶血率，當(dāng)陰性對(duì)照組的吸光度＜0.03，陽(yáng)性對(duì)照組的吸光度=（0.8±0.30）時(shí)實(shí)驗(yàn)有效，實(shí)驗(yàn)樣品的溶血率≤5%時(shí)，可判斷樣品不具溶血作用。

1.6 皮膚致敏實(shí)驗(yàn)

取浸提液、0.9%生理鹽水（陰性對(duì)照）分別與弗氏完全佐劑等體積混合、充分混勻。在兔子的去毛區(qū)域作6點(diǎn)對(duì)稱皮內(nèi)注射，每個(gè)點(diǎn)相距10～20 mm。皮內(nèi)注射1周后，用已經(jīng)在浸提液、陰性對(duì)照液中浸泡至飽和的2 cm×4 cm大小濾紙黏附于注射局部，封閉固定48 h。2周后，再用在浸提液、陰性對(duì)照液中浸泡至飽和的濾紙黏附，封閉保留24 h。將濾紙取下后分別于1 h、24 h和48 h觀察黏附處的紅斑和水腫反應(yīng)。按照致敏反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，即無(wú)紅斑和水腫為0分，輕度紅斑和水腫為1分，明顯紅斑和水腫為2分，中度紅斑和水腫（直徑＜1 mm）為3分，重度紅斑或輕度焦痂和嚴(yán)重水腫（直徑＞1 mm）為4分，計(jì)算致敏反應(yīng)率，并對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.7 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

取體外培養(yǎng)的第3代的尿路上皮細(xì)胞（圖1）以2×107cells/L的濃度接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔加200 μL的無(wú)血清角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液（KSFM，Gibco公司）培養(yǎng)，放入5%CO2、37℃、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)液，各孔分別加入200 μL實(shí)驗(yàn)樣品（膠原蛋白-殼聚糖、PVA-絲膠）浸提液，每種實(shí)驗(yàn)樣品加5孔，陰性對(duì)照為KSFM培養(yǎng)液200 μL，再放入培養(yǎng)箱內(nèi)。24 h、72 h、120 h后各取出1塊培養(yǎng)板，每孔加四甲基偶氮唑鹽（MTT，Sigma公司）20 μL，4 h后加二甲基亞砜（DMSO）200 μL，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm下測(cè)定吸光度。相同方法，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)樣品與第3代膀胱平滑肌細(xì)胞（圖2）的毒性實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)液及陰性對(duì)照為DMEM培養(yǎng)液。按照公式計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖度，按6級(jí)毒性分級(jí)法計(jì)算毒性[5－6]。

圖1 第3代泌尿上皮細(xì)胞（倒置顯微鏡，40×）Fig.1Morphology observation of the 3rdpassage of urothelial cells(Inverted phase contrast microscope,40×)

圖3 第3代膀胱平滑肌細(xì)胞（倒置顯微鏡，40×）Fig.3Morphology observation of the 3rdpassage of bladder smooth muscle cells(Inverted phase contrast microscope,40×)

2 結(jié)果

2.1 溶血實(shí)驗(yàn)

陰性對(duì)照組的吸光度為（0.014±0.001）（＜0.03），陽(yáng)性對(duì)照組的吸光度為（0.832±0.018）（在0.8±0.30的范圍內(nèi)），表明實(shí)驗(yàn)有效。實(shí)驗(yàn)樣品膠原蛋白-殼聚糖和PVA-絲膠的溶血率分別為1.86%和2.08%，均≤5%，表明兩種材料體外實(shí)驗(yàn)無(wú)明顯溶血反應(yīng)（表1）。

2.2 皮膚致敏實(shí)驗(yàn)

復(fù)合材料膠原蛋白-殼聚糖、PVA-絲膠與陰性對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比無(wú)明顯差異，表明兩種材料在本實(shí)驗(yàn)條件下未表現(xiàn)出致敏作用（表2）。

2.3 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法，細(xì)胞為體外培養(yǎng)的第3代尿路上皮細(xì)胞和第3代膀胱平滑肌細(xì)胞。結(jié)果顯示，兩種材料的細(xì)胞毒性均為0級(jí)（表3、4）。

表1 溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1The results of hemolytic

表2 皮膚致敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2The results of skin sensitization test

表3 膠原蛋白-殼聚糖、PVA-絲膠與泌尿上皮細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3The results of MTT assay of the collagen-chitosan and polyvinyl alcohol-sericin on the urothelial cells

表4 膠原蛋白-殼聚糖、PVA-絲膠與膀胱平滑肌細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4The results of MTT assay of the collagen-chitosan and polyvinyl alcohol-sericin on the bladder smooth muscle cells

3 討論

泌尿系統(tǒng)組織工程支架材料主要有3種：①天然材料，如異種膠原和殼聚糖等；②人工合成材料，如聚乙醇酸（PGA）、聚乳酸（PLA）等；③脫細(xì)胞基質(zhì)，如膀胱黏膜下脫細(xì)胞基質(zhì)（BAMG）和小腸黏膜下脫細(xì)胞基質(zhì)（SIS）等[7－8]。Atala等[9]采用BAMG支架治療脊髓膜膨出伴膀胱功能異常取得成功；徐月敏等[10]成功使用脫細(xì)胞基質(zhì)修復(fù)復(fù)雜、長(zhǎng)段尿道狹窄。但與天然材料和人工合成材料相比，脫細(xì)胞基質(zhì)并無(wú)優(yōu)勢(shì)，首先脫細(xì)胞基質(zhì)取材較為復(fù)雜，且不能重復(fù)性大規(guī)模生產(chǎn)，另外機(jī)械特性和理化性狀無(wú)法調(diào)控。

膠原蛋白和殼聚糖是組織工程常用的材料。單純的膠原蛋白物理強(qiáng)度差、降解速度快[11]；單純的殼聚糖材料脆性較大、細(xì)胞黏附性低[12]。因此，我們將膠原蛋白與殼聚糖按9∶1比例共混，以冷凍干燥法制備膠原蛋白-殼聚糖支架。該支架為三維多孔結(jié)構(gòu)，孔徑在100～300 μm之間，孔徑率達(dá)95%以上，且孔隙之間相互連通，有利于細(xì)胞的黏附增殖和營(yíng)養(yǎng)成分的滲透。純絲膠在水中的溶失率大、力學(xué)性能較差，難以直接作為醫(yī)用材料使用，而PVA則具有良好的成膜性和較高的強(qiáng)度[13]。我們采用冷凍-解凍法制備PVA-絲膠支架，PVA與絲膠的比例為1∶1。

溶血實(shí)驗(yàn)的目的是通過(guò)樣品在體外與血液直接接觸，測(cè)定紅細(xì)胞釋放的血紅蛋白量以評(píng)價(jià)材料對(duì)紅細(xì)胞功能和代謝的影響。根據(jù)我國(guó)GB/T16886-2001醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，非直接接觸血液的醫(yī)用生物材料的溶血率應(yīng)＜5%。本實(shí)驗(yàn)中，膠原蛋白-殼聚糖和PVA-絲膠的溶血率分別為1.86%和2.08%，表明兩種材料不引起溶血反應(yīng)，能滿足醫(yī)用生物材料的應(yīng)用要求。皮膚致敏實(shí)驗(yàn)是將一定量實(shí)驗(yàn)樣品或其浸提液與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮膚接觸，以檢測(cè)實(shí)驗(yàn)樣品引起皮膚致敏反應(yīng)的可能性。結(jié)果表明，膠原蛋白-殼聚糖、PVA-絲膠兩種材料滿足體內(nèi)植入的要求。四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法可檢測(cè)實(shí)驗(yàn)樣品對(duì)細(xì)胞造成的毒性損害程度，對(duì)材料的細(xì)胞毒性進(jìn)行定量評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)表明，復(fù)合材料膠原蛋白-殼聚糖、PVA-絲膠和泌尿上皮細(xì)胞、膀胱平滑肌細(xì)胞具有良好的細(xì)胞相容性。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種復(fù)合生物材料無(wú)細(xì)胞毒性，生物相容性良好，有望成為較理想的泌尿系統(tǒng)組織工程支架材料。

[1]Bisson I,Kosinski M,Ruault S,et al.Acrylic acid grafting and collagen immobilization on poly(ethylene tereph-thalate)surfaces for adherence and growth of human bladder smooth muscle cells [J].Biomaterials,2002,23(15):3149-3158.

[2]Niels-Erik J.Overcoming the stigma of complications of continent cutaneous diversion//Lee CT,Wood DP.Current clinical urology: bladder cancer[M].New York:Humana Press,2010,216-225.

[3]Atala A.Regenerative medicine and tissue engineering in urology [J].Urologic Clinics of North America,2009,36(2):199-209.

[4]盧慕峻,王忠,周廣東,等.組織工程化膀胱壁復(fù)層結(jié)構(gòu)的體外構(gòu)建[J].中華泌尿外科雜志,2007,28:82-85.

[5]Santucci RA,Barber TD.Rwsorbable extracellular matrix grafts in urologic reconstruction[J].Int Braz J Urol,2005,31(3):192-203.

[6]朱衛(wèi)東,徐月敏,馮超,等.冷凍后真空抽干膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)的生物相容性[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2009,13(21):4011-4014.

[7]Atala A.Tissue engineering for the replacement of organ function in the genitourinary system[J].Am J Transplant,2004,4(6):58-73.

[8]汪繼洪,徐月敏.泌尿系統(tǒng)組織工程支架材料的發(fā)展與應(yīng)用[J].中國(guó)組織工程臨床研究與臨床康復(fù),2010,14(29):5493-5497.

[9]Atala A,Bauer SB,Soker S,et al.Tissue engineered autologous bladder for patients needing cystoplasty[J].Lancet,2006,367(9518): 1241-1246.

[10]Xu YM,Qiao Y,Sa YL,et al.Urethral reconstruction using colonic mucosa graft for complex strictures[J].J Urol,2009,182(3):1040-1043.

[11]Griffon DJ,Sedighi MR,Schaeffer DV,et al.Chitosan Scaffolds: interconnective pore size and cartilage engineering[J].Acta Biomater, 2006,2(3):313-320.

[12]Perets A,Baruch Y,Weisbuch F,et al.Enhancing the vascularization of three-dimensional porous alginate scaffolds by incorporating controlled release basic fibroblast growth factor microspheres[J]. J Biomed Mater Res A.2003;65(4):489-497.

[13]高洋,馮屏,田曉慧,等.以檸檬酸作交聯(lián)劑改善絲膠/聚乙烯醇熱固化膜的性能[J].蠶業(yè)科學(xué),2010,36(1):91-96.

Biocompatibility Evaluation of Collagen-Chitosan and Polyvinyl Alcohol-Sericin as Tissue Engineered Scaffold in Urinary System

HE Hongchao1,LI Wei2,DOU Hongjing2,WANG Xiaojing1,LIU Wei3,SUN Kang2,SHEN Zhoujun1.1 Department of Urology,Ruijin Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200025,China;2 School of Materials Science and Engineering and Institute of Composite Materials,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200240, China;3 Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:SHEN Zhoujun(E-mail:shenzj6@sina.com);SUN Kang (E-mail:ksun@sjtu.edu.cn).

ObjectiveTo investigate the biocompatibility of collagen-chitosan and polyvinyl alcohol-sericin as tissue engineered scaffold in urinary system.MethodsHemolytic test was performed to evaluate these materials′(collagenchitosan and polyvinyl alcohol-sericin)impact on the function and metabolism of erythrocyte.Skin sensitization test was used to investigate the feasibility of these materials as the implantation materials for human body.Cytotoxicity test(MTT assay)was used to evaluate these materials′influence on the growth and proliferation of cultured cells(urothelial cells and bladder smooth muscle cells).ResultsThe hemolytic rate of collagen-chitosan and polyvinyl alcohol-sericin was 1.86%and 2.08% respectively(＜5%),and no hemolytic effect was observed.Skin sensitization test showed no difference between experimental groups(collagen-chitosan group and polyvinyl alcohol-sericin group)and control group,which indicated that these materials meet the requirements of implantation.The MTT assay showed that cytotoxicity score of collagen-chitosan and polyvinyl alcohol-sericin were both grade 0.ConclusionBoth of collagen-chitosan and polyvinyl alcohol-sericin have good biocompatibility and should be safe and promising in urinary reconstruction as tissue engineered scaffold.

Collagen-chitosan;Polyvinyl alcohol-sericin;Biocompatibility;Tissue engineering

Q813.1+1，R318.08

A

1673－0364（2011）02－0089－04

2011年2月20日；

2011年3月21日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2011.02.007

上海交通大學(xué)醫(yī)工（理）交叉重點(diǎn)項(xiàng)目（YG2009ZD202）。

200025上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院泌尿外科（何竑超，王曉晶，沈周?。?00240上海市上海交通大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，上海交通大學(xué)復(fù)合材料研究所（李偉，竇紅靜，孫康）；200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科（劉偉）。

沈周俊（E-mail：shenzj6@sina.com）；孫康（E-mail：ksun@sjtu.edu.cn）。