羥丁基殼聚糖的制備及其與鼠胚胎成纖維細(xì)胞的生物相容性研究

孫偉 季翔 汪謨貞 方月娥 趙宇 汪春蘭

羥丁基殼聚糖的制備及其與鼠胚胎成纖維細(xì)胞的生物相容性研究

孫偉 季翔 汪謨貞 方月娥 趙宇 汪春蘭

目的制備溫敏型殼聚糖衍生物羥丁基殼聚糖（Hydroxybutyl chitosan，HBC），研究鼠胚胎成纖維細(xì)胞（Mouse embryonic fibroblasts，MEF）與HBC的相容性，探討羥丁基殼聚糖作為組織工程材料的可行性。方法對(duì)殼聚糖化學(xué)改性制備HBC，研究其最佳制備條件。使用不同溶劑對(duì)HBC進(jìn)行溶解實(shí)驗(yàn)；利用紅外光譜、掃描電鏡對(duì)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。從小鼠胚胎中分離培養(yǎng)MEF；MTT法測(cè)定HBC對(duì)MEF活性的影響。結(jié)果制備的4種HBC均能溶于水，55℃反應(yīng)14h的HBC 4水溶性較好。HBC溶液在37℃具有明顯的溶膠-凝膠的轉(zhuǎn)變，通過(guò)物理交聯(lián)形成凝膠并可逆。不同反應(yīng)條件下制得的4種HBC浸提液對(duì)MEF細(xì)胞的毒性均在0級(jí)或1級(jí)，表現(xiàn)出良好的生物相容性。結(jié)論成功制備羥HBC，HBC具有良好的溫度敏感性及體溫（37℃）下凝膠的特性，與MEF生物相容性良好，是一種具有應(yīng)用前景的新型組織工程材料。

羥丁基殼聚糖鼠胚胎成纖維細(xì)胞溫敏凝膠組織工程

殼聚糖作為一種天然的陽(yáng)離子聚合物，對(duì)生物體細(xì)胞無(wú)抗原性，無(wú)致突變作用，不會(huì)產(chǎn)生排斥反應(yīng)，是一種安全可靠的醫(yī)用高分子材料，近年來(lái)作為組織工程支架及載體材料研究廣泛[1-2]。但由于其具有復(fù)雜的雙螺旋結(jié)構(gòu)，大分子鏈上分布著許多氨基和羥基，能夠形成分子內(nèi)和分子間氫鍵，故殼聚糖的結(jié)晶性較高、溶解性較差，極大地限制了它的應(yīng)用。通過(guò)化學(xué)改性可在殼聚糖分子中的重復(fù)單元上引入不同基團(tuán)，生成相應(yīng)的衍生物。這樣既可改善殼聚糖的溶解性能，又可賦予殼聚糖更多的功能。

我們通過(guò)對(duì)殼聚糖進(jìn)行羥丁基化改性，制備具有溫敏特性的羥丁基殼聚糖（Hydroxybutyl chitosan，HBC），選用鼠胚胎成纖維細(xì)胞（Mouse embryonic fibroblasts，MEF），研究?jī)烧叩纳锵嗳菪?，探討HBC作為組織工程材料的可能性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

孕期14～16 d的孕小鼠4只（健康清潔級(jí)，體重不限），安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 材料與主要試劑

殼聚糖，普通型醫(yī)藥級(jí)，脫乙酰度90%（核磁方法測(cè)定），MW=4.0×105(黏度法)（浙江金殼生物化學(xué)有限公司）；環(huán)氧丁烷（1,2-Butylene Oxide）C4H8O，分子量72.11（東京化成工業(yè)株式會(huì)社）；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清（Hyclone公司）；噻唑藍(lán)（MTT）（Sigma公司）；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器

超低溫冰箱（SANYO公司，日本）；CO2培養(yǎng)箱（Heraeus公司，德國(guó)）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠）；84-1A型磁力攪拌器（上海司樂(lè)儀器有限公司）；透析袋（MW=8 000）（上海易佰聚經(jīng)貿(mào)有限公司）；FA1104型電子天平（上海精密儀器儀表有限公司）；VECTOR-22型FT-IR紅外光譜儀（Burker公司，德國(guó)）；X-650型掃描電子顯微鏡（日立公司，日本）；倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）；BIO-TEK ELX800全自動(dòng)酶標(biāo)儀（寶特儀器有限公司，美國(guó)）；培養(yǎng)瓶、離心管、細(xì)胞培養(yǎng)板（Falcon公司，美國(guó)）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 HBC合成

合成方法參考文獻(xiàn)[3-4]，經(jīng)改進(jìn)后合成羥乙基和羥丙基殼聚糖。殼聚糖的合成過(guò)程大致分為：堿化、改性、后處理。不同反應(yīng)條件下制成的HBC樣品見(jiàn)表1。

1.4.1.1 堿化

10 g NaOH固體置于燒杯中，加入10 mL蒸餾水使其溶解；加入2 g殼聚糖粉末，常溫?cái)嚢? h，充分溶脹后，放入-18℃冰箱中冰凍過(guò)夜；加入異丙醇20 mL，40℃攪拌1 h分散均勻，形成堿化殼聚糖2 g。

1.4.1.2 改性

2 g堿化殼聚糖，滴加環(huán)氧丁烷20 mL，一定溫度加熱，回流反應(yīng)一定時(shí)間（共制成4組樣品，表1），產(chǎn)物用無(wú)水乙醇沉淀，1/1（v/v)鹽酸中和pH至中性，得到羥丁基殼聚糖粗產(chǎn)物。

1.4.1.3 粗產(chǎn)物處理

粗產(chǎn)物無(wú)水乙醇洗滌，過(guò)濾，加入丙酮靜置沉淀，再經(jīng)丙酮/乙醚反復(fù)離心洗滌3次，干燥研磨后放入Mw=8 000的透析袋中，放入加有約500 mL去離子水的廣口塑料量杯中，置磁力攪拌器上動(dòng)態(tài)透析72 h，12 h更換透析用水1次，透析結(jié)束后產(chǎn)物經(jīng)50℃真空干燥，得精制白色粉末狀HBC產(chǎn)品。

1.4.2 羥丁基殼聚糖的溶解性實(shí)驗(yàn)

相同條件，準(zhǔn)備100 mL 1%醋酸水溶液、100 mL蒸餾水及100 mL 0.1 mol/L NaOH溶液3種溶液，判斷標(biāo)準(zhǔn)以100 mL溶液中溶解殼聚糖或HBC的質(zhì)量為依據(jù)，＞0.7為好，0.5～0.7為較好，0.3～0.5為一般，＜0.3為差。

1.4.3 HBC溫敏凝膠化特性研究

將l g HBC溶解在50 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液中，配制2%HBC溶液，振蕩混勻后，以少量0.02 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值。參照文獻(xiàn)[5]用試管倒置法研究HBC的溫敏特性，將裝有HBC溶液的試管直立置于不同溫度的恒溫水浴箱中，測(cè)試溫度范圍為18～50℃，記錄不同溫度下溶液的成凝膠行為。每隔約30 sec將試管45°傾斜，并觀察液面是否隨試管傾斜，當(dāng)觀察到液面不隨著試管傾斜45°而傾斜，則再恒溫約30 sec后，將試管倒置，溶液不再流動(dòng)，則定義此時(shí)的溫度為初始化凝膠溫度，達(dá)到初始凝膠化溫度后，恒溫一定時(shí)間，得到水凝膠。

1.4.4 產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)表征

紅外光譜分析：采用KBr壓片法，將精制過(guò)的樣品與KBr混合壓片進(jìn)行測(cè)試。

掃描電鏡觀察：將制得的水凝膠放在冷凍干燥箱中冷凍干燥，選取樣品截面黏臺(tái)，鍍金后觀察。

1.4.5 MEF培養(yǎng)及HBC對(duì)MEF存活的影響

1.4.5.1 MEF的原代和傳代培養(yǎng)

從孕14～16 d的小鼠子宮取出胎鼠，反復(fù)消毒后用PBS和DMEM漂洗數(shù)次，剪下皮膚，將洗凈的組織塊剪成約1 mm3的小塊，置入含DMEM和10% FBS的MEF培養(yǎng)基中原代培養(yǎng)，得到MEF[6-7]。原代培養(yǎng)的細(xì)胞達(dá)到80%～90%成片融合后，傳代培養(yǎng)。將原培養(yǎng)液倒盡，PBS液漂洗2次，加入0.5 mL 0.25%胰酶消化，待細(xì)胞融合后，加2.5 mL含10% FBS的DMEM液終止消化，吹吸成細(xì)胞懸液，按1∶5的比例分裝入新培養(yǎng)瓶，放入37℃、5%CO2、飽和濕度條件下傳代培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均為第3～6代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的成纖維細(xì)胞。

1.4.5.2 MTT法檢測(cè)HBC對(duì)MEF生長(zhǎng)的影響

取3塊96孔板，每板分7組。CS原料浸提液組：取原料殼聚糖0.02 g，先用2 mL PBS液浸泡過(guò)夜（24 h），37℃下加入1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液過(guò)夜（24 h），高壓滅菌；4組HBC浸提液液組：將制成的4種HBC分別稱(chēng)取0.02 g，用2 mL PBS液浸泡過(guò)夜（24 h），37℃下加入1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液過(guò)夜（24 h），高壓滅菌備用；陰性對(duì)照組：?jiǎn)渭兗?xì)胞培養(yǎng)液（含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液）；陽(yáng)性對(duì)照組：5%苯酚水溶液。

將第3～6代的MEF制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×104cells/mL后，接種到96孔板中培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，將原培養(yǎng)液吸出，各孔加入相應(yīng)的待測(cè)樣品液200 μL，每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔。溫箱中培養(yǎng)48 h后取出96孔板，加入15 mg/mL MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；吸去上清液待結(jié)晶物完全溶解后，酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm吸光度[8]，并計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率（RGR）。細(xì)胞毒性評(píng)估將根據(jù)各組的細(xì)胞吸光度和RGR進(jìn)行評(píng)價(jià)，轉(zhuǎn)化為0～5級(jí)材料毒性評(píng)價(jià)[9]。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HBC溶解性實(shí)驗(yàn)

4種不同反應(yīng)條件下制得的HBC樣品和原料殼聚糖，相同條件下分別置于100 mL 1%醋酸水溶液、蒸餾水、0.1 mol/L NaOH溶液中（表2）。各組樣品均能溶于稀酸而不溶于堿性溶液，殼聚糖原料不溶于水，而改性后的HBC能溶于水，4種制備條件不同的殼聚糖溶解性也不同。70℃反應(yīng)產(chǎn)物由于溫度高，殼聚糖之間會(huì)產(chǎn)生交聯(lián)從而導(dǎo)致水溶性下降。從水溶液樣品上可見(jiàn)，HBC 1水溶性一般，溶液粘度較大；HBC 2反應(yīng)時(shí)間適中，水溶性較好；HBC 3反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致產(chǎn)物交聯(lián)現(xiàn)象產(chǎn)生，溶解度下降；降低反應(yīng)溫度并適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間（55℃反應(yīng)14 h）的HBC 4水溶性最好，已經(jīng)得到了無(wú)色澄清透明的羥丁基殼聚糖水溶液。

表2 HBC的溶解性實(shí)驗(yàn)Table 2The solubility test of HBC

2.2 HBC溫敏凝膠特性

通過(guò)試管倒置法，逐漸提高水浴溫度，測(cè)得4組HBC樣品均具有溫敏特性，能夠在體溫（37℃）下轉(zhuǎn)變?yōu)槟z，各組初始凝膠化溫度分別為34℃、20℃、22℃和29℃。HBC凝膠化臨界溫度20℃左右，在37℃時(shí)，HBC材料可以順利轉(zhuǎn)變?yōu)槟z狀態(tài)。

2.3 紅外光譜和掃描電鏡分析

經(jīng)干燥研磨后的羥丁基殼聚糖為纖維狀的白色粉末，均能溶于水。選取水溶性最好的HBC 4為代表，進(jìn)行紅外光譜和掃描電鏡分析。殼聚糖經(jīng)過(guò)羥丁基化改性后，得到側(cè)鏈帶疏水基團(tuán)的殼聚糖鏈。圖1為HBC 4樣品的紅外光譜圖，圖中箭頭所示為特征官能團(tuán)的吸收峰；1 462 cm-1處-CH3吸收峰的出現(xiàn)為判斷羥丁基已經(jīng)取代原有基團(tuán)的最明顯特征，此外還有C-O吸收峰變強(qiáng)并移動(dòng)至1 060 cm-1附近。

圖1 HBC4的紅外光譜圖Fig.1The IR image of HBC 4

HBC溶液在37℃時(shí)轉(zhuǎn)變?yōu)槟z狀態(tài)。當(dāng)溫度低于凝膠化溫度時(shí)，HBC溶液為可注射的流動(dòng)黏性液體，當(dāng)溫度高于初始化凝膠溫度或達(dá)到37℃，加熱后即轉(zhuǎn)變?yōu)椴涣鲃?dòng)的固態(tài)凝膠。凝膠的形成是由氫鍵、離子間的相互吸引力和疏水力等物理作用形成。將制備的凝膠進(jìn)行冷凍干燥，將其截面通過(guò)掃描電鏡觀測(cè)HBC水凝膠的微觀形貌，發(fā)現(xiàn)HBC水凝膠具有多孔性的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，空間網(wǎng)絡(luò)較大，網(wǎng)間空隙較?。▓D2）。此種結(jié)構(gòu)有利于吸收水份和藥物，可以作為藥物模型的載體和組織工程支架材料。

圖2 HBC凝膠的掃描電鏡圖Fig.2HBC semisolid observed by SEM

2.4 HBC對(duì)MEF的細(xì)胞毒性

MTT法檢測(cè)各組吸光度及RGR、毒性級(jí)別，根據(jù)細(xì)胞毒性與RGR的關(guān)系[9]，可見(jiàn)原材料殼聚糖及制備的4種HBC材料細(xì)胞毒性為0級(jí)或1級(jí)。HBC的4個(gè)樣品對(duì)MEF細(xì)胞作用的RGR值與陰性對(duì)照相比無(wú)顯著性差異，與相應(yīng)的殼聚糖樣品的比較也沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），而與陽(yáng)性對(duì)照間差異顯著（P＜0.05）。因此，可認(rèn)為殼聚糖及其衍生物HBC具有良好的生物相容性。

3 討論

運(yùn)用組織工程的方法修復(fù)外傷等導(dǎo)致的組織缺損，要求支架材料具有良好的生物相容性、理化性質(zhì)和適宜的降解速率。殼聚糖作為一種自然界中存量極其豐富的堿性多糖，本身具有多種生物活性，其分子鏈上分布著許多氨基和羥基，化學(xué)性質(zhì)非?；顫?，通過(guò)改性后的殼聚糖衍生物改善了其水溶性，能夠更好地為細(xì)胞提供繁殖所需的三維生長(zhǎng)支架，在組織工程、藥物及基因傳輸?shù)难芯恐?，殼聚糖作為新型的支架材料和緩釋載體應(yīng)用前景廣闊[1，10]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)殼聚糖進(jìn)行羥丁基化改性，成功制備了水溶性良好的HBC，能在37℃時(shí)轉(zhuǎn)變?yōu)槟z，具有良好的溫敏特性。制備的HBC的凝膠化溫度范圍在20～34℃之間。凝膠的掃描電鏡顯示HBC凝膠是一種多孔性的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，空間網(wǎng)絡(luò)較大，網(wǎng)間空隙合適，可供藥物及大分子蛋白質(zhì)填充于凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中。

作為一種新的組織工程支架材料，在進(jìn)行體內(nèi)功能實(shí)驗(yàn)之前，須首先檢測(cè)其生物相容性，確定對(duì)生物體細(xì)胞無(wú)毒無(wú)害才能使用。我們從胎鼠中培養(yǎng)獲取大量的MEF[6-7]，原代培養(yǎng)MEF后，傳代培養(yǎng)，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第3～6代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用MTT法進(jìn)行評(píng)價(jià)。本實(shí)驗(yàn)制備的HBC材料的毒級(jí)為0～1級(jí)，具有良好的生物相容性，符合組織工程材料的應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)。

我們制備HBC溫敏水凝膠材料的方法簡(jiǎn)單、安全、符合環(huán)保要求；與MEF復(fù)合培養(yǎng)結(jié)果表明，HBC對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯不良影響。HBC是一種可注射的、具有良好生物相容性和生物可降解性的材料，可作為藥物遞送載體及修復(fù)組織缺損的支架材料?？勺⑸湫蜏孛羲z具有自體適應(yīng)性，可體溫凝化，這是一般水凝膠所不具備的。

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Preparation of Hydroxybutyl Chitosan and Its Biocompatibility Evaluation with Mouse Embryonic Fibroblasts

SUN Wei1,JI Xiang2,WANG Mozhen2,FANG Yue′e2,ZHAO Yu1,WANG Chunlan1.1 Deperment of Plastic Surgery,First Affiliated Hospital of Anhui Medical University,Hefei 230022,China;2 University of Science and Technology of China, Hefei 230026,China.Corresponding author:WANG Chunlan(Email:wangchunlan9@163.com);ZHAO Yu(E-mail: zhaoyuzj@yahoo.com.cn).

ObjectiveTo prepare and study the biocompatibility of Hydroxybutyl chitosan(HBC)with mouse embryonic fibroblasts(MEF)in vitro.To investigate the feasibility of using HBC as tissue engineering materials.MethodsThe HBC were prepared by chitosan chemically modified and the best preparation conditions were summarized.Different solvents were used on HBC for the solubility test.The structure of the HBC was characterized by IR and scanning electron microscopy (SEM).MEFs were isolated and cultivated from mouse embryo.The biocompatibility of HBC is investigated by using the MTT assay.ResultsAll the four HBC samples could dissolve in water and HBC 4 which was acted 14 hours at 55℃have better water-solubility.HBC solution can rapidly transform to semisolid at body temperature(37℃)and revert to its solvated state by physical crossliking at lower temperature.MEF cultured with four kinds of leachates of HBC were investigated by the MTT assay and the cytotoxicity of HBC was in graded 0 and 1.ConclusionHBC was prepared successfully with good thermosensitivity and could be transformed into gelation at body temperature(37℃).HBC presented good biocompatibility with MEFs and could be used as tissue engineering materials.

Hydroxybutyl chitosan;Mouse embryonic fibroblasts;Thermosensitive hydrogel;Tissue engineering

Q813.1+1，R318.08

A

1673－0364（2011）02－0085－04

2010年12月26日；

2011年1月20日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2011.02.006

230022安徽省合肥市安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形外科（孫偉，趙宇，汪春蘭）；230026安徽省合肥市中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)（季翔，汪謨貞，方月娥）。

汪春蘭（E-mail:wangchunlan9@163.com）；趙宇（E-mail:zhaoyuzj@yahoo.com.cn）。