細菌通過聚酮合成酶途徑合成多不飽和脂肪酸的研究進展

萬霞，江木蘭*

(1.中國農業(yè)科學院油料作物研究所，湖北武漢430062;2.農業(yè)部油料作物生物學重點開放實驗室，湖北武漢430062)

細菌通過聚酮合成酶途徑合成多不飽和脂肪酸的研究進展

萬霞1，2，江木蘭1，2*

(1.中國農業(yè)科學院油料作物研究所，湖北武漢430062;2.農業(yè)部油料作物生物學重點開放實驗室，湖北武漢430062)

細菌利用聚酮合成酶途徑合成多不飽和脂肪酸是近年發(fā)現的新的脂肪酸合成途徑。這種途徑與常規(guī)的由脂肪酸去飽和酶和脂肪酸延長酶引導的脂肪酸合成途徑有著本質上的差別?？偨Y了近些年細菌利用聚酮合成酶合成多不飽和脂肪酸這一新途徑的研究狀況，重點闡明其分子機制，并對其研究趨勢及應用前景進行了展望。

細菌;聚酮合成酶;多不飽和脂肪酸

多不飽和脂肪酸是一類含有多個雙鍵的脂肪酸。多不飽和脂肪酸不僅是細胞膜的重要組成，還是一系列具有重要生理活性功能產物的重要前體物質。長鏈多不飽和脂肪酸一般指含有20個以上碳原子的多不飽和脂肪酸，主要存在于一些海洋魚類、真菌和藻類等真核生物中。上世紀80年代末，研究者發(fā)現原核生物中除藍細菌以外，某些細菌也能合成n-3途徑的長鏈多不飽和脂肪酸。并且這類細菌往往生活在比較特殊的環(huán)境中，如低溫深海中和海洋魚類的腸道中。尤其值得關注的是，這類細菌產生的不是常見的中長鏈多不飽和脂肪酸，如亞麻酸和亞油酸一類，而是稀有且具有高營養(yǎng)價值和生理活性的二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)［1-3］。一般認為，多不飽和脂肪酸是在線粒體或內質網上通過一系列的脂肪酸去飽和酶(fatty acid desaturase)催化的碳鏈脫飽和反應和由脂肪酸延長酶(fatty acid elongase)催化的延長反應而合成［4］。但近年來通過對產生DHA或EPA的一類海洋細菌進行研究后發(fā)現，除了這種常規(guī)合成途徑外，還存在一種獨特的不依賴于脂肪酸去飽和酶和脂肪酸延長酶的新途徑合成長鏈多不飽和脂肪酸［3，5-6］。在這一新途徑中，均發(fā)現一種存在于細胞質中、由多亞基組成的復合酶聚酮合成酶(polyketide synthase，PKS)，該酶與脂肪酸去飽和酶幾乎沒有同源性，但與脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，FAS)有相似的保守結構域，因而該途徑被稱為聚酮合成酶途徑(簡稱PKS途徑)。本文從聚酮合成酶途徑中關鍵基因的分子克隆與結構功能分析兩方面闡述其研究現狀，以期為相關研究提供參考。

1 PKS途徑中關鍵功能基因的克隆和異源表達

1.1 PKS途徑中關鍵功能基因的克隆及其類型

在1996年日本科學家首次報導了從海洋動物的腸道中新分離到一種能產生EPA的海洋細菌腐敗希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens SCRC2378)，該菌株中EPA含量占總脂肪酸含量的24%～40%，并且?guī)缀鯖]有檢測到C18到C20之間的多不飽和脂肪酸，說明該菌株中存在非常特別的合成EPA機制。隨后該研究小組從該菌株中克隆得到一段38 kbp的DNA片斷，該片斷含有8個大于1 kb的開發(fā)閱讀框，然而只有其中的5個開放閱讀框是合成EPA所必需的。這5個開放閱讀框分別被命名為pfaA、pfaB、pfaC、pfaD和pfaE［3］。隨后，研究者陸續(xù)從多個可以產生EPA或DHA的細菌中發(fā)現與pfa具有相似性的基因。Allen等［7］從深海發(fā)光桿菌(Photobacterium profundum SS9)中獲得了大小為33 kbp編碼EPA合成的基因簇pfaA、pfaB、pfaC、pfaD，但不包括編碼磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶(phosphopantetheinyl transferase，PPTase)的基因pfaE。Delong等［1］早在1986年就分離到1株可以產生DHA的海產弧菌(Vibrio marinus MP-1)，但直到1999年，Tanaka等［8］推測該菌株以PKS途徑來合成DHA，并根據已測序的全基因組序列來設計引物，最終克隆得到包含pfaA、pfaB、pfaC和pfaD基因簇的40 kbp的DNA片段。作者分析由于沒有克隆到pfaE，因而該基因簇一直未能在大腸埃希菌中成功表達。此外，在1株能產生EPA且嗜冷的希瓦氏菌(Shewanella sp.GA-22)中，雖然也發(fā)現了PKS合成途徑，但僅克隆得到pfaA和pfaC 2個基因片斷［9］。由于此擴增過程中用到的簡并引物是根據腐敗希瓦氏菌SCRC2378和深海發(fā)光桿菌SS9及海產弧菌MP-1中已報道的pfa序列來設計的，因此可能由于希瓦氏菌GA-22中pfaB、pfaD和pfaE基因與其他來源的基因同源性不高，而未能通過簡并引物擴增的方法獲得完整的pfa基因序列。

近年來，隨著越來越多海洋細菌基因組測序的完成，人們發(fā)現無論是已報道能產生長鏈多不飽和脂肪酸的海洋細菌，或是推測能產生長鏈多不飽和脂肪酸的海洋細菌均含有類似于pfa系列的基因序列。根據pfa系列基因的排列方式，PKS合成途徑的關鍵基因大致分為3種類型。第1種類型最重要的特征是同一基因簇中包括所有pfaA、pfaB、pfaC、pfaD和pfaE 5個關鍵基因，這種類型主要分布在奧奈達希瓦氏菌(Shewanella oneidensis MR-1)、冷紅科爾韋爾氏菌(Colwellia psychrerythraea34H)以及腐敗希瓦氏菌SCRC2378為代表的海洋細菌中。盡管在腐敗希瓦氏菌SCRC2378的pfa基因簇中pfaE與其他4個基因并非連續(xù)排列，而是間隔了2個似乎并不相關的開放閱讀框，但該基因簇仍歸于這一類型［3］。第2種類型與第1種類型的差異不大，也包括5個完整的pfa系列基因，但pfaE與前4個基因不在同一基因簇中，例如海產弧菌MP-1的pfaE與其余4個pfa系列基因不在同一基因簇中，但功能上還是體現互補性［8］。第3種類型在1株假交替單胞菌(Pseudoaltermonas sp.Strain DS-12)中被發(fā)現，pfa系列基因位于同一基因簇，但只包括pfaA、pfaB、pfaC和pfaD 4個基因，而pfaE整合到pfaC基因的序列中形成pfaC/E，執(zhí)行雙功能。此外，pfaB與pfaC/E之間還被一個功能不相關的開放閱讀框所隔開(GenBank ABF00130)。

1.2 PKS途徑中關鍵基因的異源表達

盡管越來越多海洋細菌中參與長鏈多不飽和脂肪酸合成的PKS途徑關鍵基因被分析和克隆，但將這類基因在異源微生物中成功表達并獲得最終產物EPA或DHA的范例并不多見。據推測造成這一困難主要有兩點原因，一是由于完整的pfa基因簇一般都有30 kbp左右的大小，成功轉化異源微生物的幾率相對較小;二是目前已獲得的完整的pfa基因簇并不多。日本一科研小組首次報道將來源于腐敗希瓦氏菌SCRC2378中包含完整pfa基因簇的38 kbp片段轉入1株原核光合細菌聚球藻中，獲得了能夠產生EPA的基因工程藻株。經過初步的發(fā)酵條件優(yōu)化，該菌株可產生干重最高為0.64 mg/g的EPA［10］。隨后，同樣來自于腐敗希瓦氏菌SCRC2378中38 kbp的片段還被分別轉入大腸埃希菌JM109以及大腸埃希菌DH5α。不同培養(yǎng)條件下，重組大腸埃希菌產生EPA的含量可占總脂肪酸含量的6.3%～22%［3，11］。此外，來自于奧奈達希瓦氏菌MR-1的pfa基因簇被克隆并在大腸埃希菌中表達，重組細菌產生EPA的含量僅占到總脂肪酸含量的0.69%。但將該pfa基因簇放到含有l(wèi)acZ啟動子的多拷貝質粒pBluescript SK(+)中再轉入大腸埃希菌，重組菌株EPA的含量提高到占總脂肪酸含量的7.5%［12-13］。將來自于另一株可以合成EPA的希瓦氏菌BR-2的pfa基因簇直接在大腸埃希菌XL-Blue MR中表達，就可檢測到重組菌株EPA的含量占到總脂肪酸含量的7.5%［14］。目前所有的報道都是將pfa基因簇轉入原核生物，并使之產生長鏈多不飽和脂肪酸。在今后的研究中，可以嘗試將這類基因進行一定的修飾或改造后，轉入模式真核生物如畢赤酵母、釀酒酵母以及擬南芥中，合成這類稀有的長鏈多不飽和脂肪酸。

2 PKS途徑中關鍵基因的結構及其功能

2.1 PKS途徑中關鍵基因的結構分析

從目前已報道的結果可以看出，pfa基因簇的存在是海洋細菌通過PKS途徑合成EPA或DHA的必需條件。進一步對這類細菌中pfa基因簇進行分析發(fā)現，盡管pfa基因簇的基本框架結構相似，但某些結構域還是有許多獨特之處。在第1類和第2類的pfa基因簇中，pfaA一般包括3-酮脂酰合成酶(3-ketoacyl synthase)、丙二酰輔酶A:酰基載體蛋白?；D移酶(malonyl coenzyme A: acyl carrier protein acyltransferase)以及3-酮脂酰ACP還原酶(3-ketoacyl-ACP reductase)的典型結構域，因而被認為是編碼一個多功能的蛋白。pfaC一般包括2個3-酮脂酰合成酶典型結構域的重復序列以及2～3個3-羥癸酰ACP脫水酶(3-hydroxydecanoyl-ACP dehydratases)典型結構域的重復序列。據報道，奧奈達希瓦氏菌MR-1、腐敗希瓦氏菌SCRC2378和深海發(fā)光桿菌SS9中pfaC的第二個類似3-酮脂酰合成酶的編碼區(qū)被證實是一種碳鏈延長因子［7，15-16］。值得注意的是，目前發(fā)現所有負責EPA合成的pfaC中均有3個類似于fabA的3-羥癸酰ACP脫水酶的典型結構域，而所有負責DHA合成的pfaC中均只有2個3-羥癸酰ACP脫水酶的典型結構域，而另外一個處于中間位置的結構域卻和fabZ/A具有同源性。pfaB和pfaD編碼的蛋白一般包括3-酮脂酰合成酶、?；D移酶(acyltransferase)以及烯酰還原酶(enoyl reductase)的典型結構域［11，17］。目前僅在產生DHA的海產弧菌MP-1［18］和冷紅科爾韋爾氏菌34H［18］中發(fā)現PfaB蛋白含有典型的3-酮脂酰合成酶結構域。海產弧菌MP-1的PfaB盡管含有典型的3-酮脂酰合成酶結構域，卻惟獨缺少一段包括活性位點在內的序列［19］。假交替單胞菌DS-12中pfa基因簇的結構比較獨特，不同于以上任何一種情況。該菌株的PfaB蛋白具有2個3-酮脂酰合成酶的典型結構域，而PfaC/E蛋白同時具有磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶和2個3-羥癸酰ACP脫水酶的結構域。并且，存在于pfaC/E基因下游的pfaD基因中，包含一段與烯酰還原酶(enoyl reductase)同源的序列［20］。

在pfa基因簇中，相對于pfaABCD基因而言，目前對pfaE的研究最為透徹。參與EPA或者DHA合成的pfaE基因，又稱為磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶基因，一般被認為是一個大的基因家族。依據推測的蛋白質大小和核心區(qū)結構組成可將這個家族歸為2種類型的Sfp型的磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶基因家族。第1種具有P0、P1a和P1b 3個核心區(qū)，主要負責EPA和DHA的合成;第2種具有1A、P1a'和P1b'3個核心區(qū)，主要負責多聚酮和非核糖體肽的合成，且在結構上類似于第1種類型。例如，在基因組已經測序的深海發(fā)光桿菌SS9中，分析pfaE基因(GenBank: CAG23685)的結構屬于典型的第1類Sfp型磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶基因。

2.2 PKS途徑中關鍵基因的互補功能分析

目前，對以腐敗希瓦氏菌SCRC2378為代表的合成EPA的細菌和以海產弧菌MP-1為代表的合成DHA的細菌研究較為清楚，因此大部分的研究是以這2株細菌為模型來分析PKS途徑中pfa系列基因的互補功能。最初研究人員發(fā)現腐敗希瓦氏菌SCRC2378中的pfaABCD 4個基因在大腸埃希菌中表達，重組菌株不能合成EPA，但將來自海產弧菌MP-1中861個堿基對組成的pfaE基因和來自腐敗希瓦氏菌SCRC2378中的pfaABCD 4個基因在大腸埃希菌中共表達時，重組菌株產生了約占總脂肪酸成分12%的EPA。這一互補試驗有力證實了pfaE基因編碼的磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶是PKS途徑介導n-3類多不飽和脂肪酸合成的必需酶［15-16］。但將pfaA基因的活性中心突變后，再來重復以上互補實驗，發(fā)現無論有無pfaE基因存在，重組菌株都不能合成EPA。以上實驗說明pfaA基因的功能在EPA合成中也是必需的［16］。若將腐敗希瓦氏菌SCRC2378中pfaBCDE 4個基因和海產弧菌MP-1中pfaABCD 4個基因共表達時，重組菌株既可以合成EPA又可以合成DHA［20］。

隨后由于從深海發(fā)光桿菌SS9中未克隆得到pfaE基因，因此研究人員將來自于枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)和1株希瓦氏菌(Shewanella sp.SC2A)中的pfaE基因與深海發(fā)光桿菌SS9中的pfaABCD 4個基因在大腸埃希菌中共表達，但重組菌株未能合成EPA［8］。分析原因可能是由于枯草芽胞桿菌和希瓦氏菌SC2A中的pfaE基因均屬于第2類的Sfp型磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶基因。近2 a，由于深海發(fā)光桿菌SS9的基因組測序完成，已有研究人員從該菌株中克隆得到全長為690 bp的pfaE基因，并與海產弧菌MP-1中的pfaABCD 4個基因在大腸埃希菌中共表達，最終也實現了重組菌株合成DHA，并且DHA的含量占到總脂肪酸含量的2%［21］。深海發(fā)光桿菌SS9中pfaE基因則屬于典型的第1類Sfp型磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶基因。

最近，日本北海道大學的學者又在研究PKS途徑關鍵基因的功能方面取得了突破性進展。他們將來源于海產弧菌MP-1中負責合成DHA的 pfaABCDE 5個基因與來源于腐敗希瓦氏菌SCRC2378中負責合成EPA的單獨的pfaA、pfaB、pfaC、pfaD和pfaE 5個基因分別連接并在大腸埃希菌中進行共表達。結果發(fā)現，只有當來源于海產弧菌MP-1中pfaABCDE 5個基因與來源于腐敗希瓦氏菌SCRC2378中的pfaB共表達時，重組菌株可以同時合成EPA和DHA。而海產弧菌MP-1中pfaABCDE 5個基因與腐敗希瓦氏菌SCRC2378中其他基因共表達時，重組菌株都不能同時合成EPA和DHA。該實驗說明pfaB是產生EPA最為關鍵的基因。在此基礎上，他們還設計了一個有趣的實驗，將來源于腐敗希瓦氏菌SCRC2378的pfaABCDE 5個基因與海產弧菌MP-1中的pfaB在大腸埃希菌中共表達，結果重組菌株僅能產生EPA;而若將來源于腐敗希瓦氏菌SCRC2378的pfaACDE 4個基因與海產弧菌MP-1中的pfaB在大腸埃希菌中共表達時發(fā)現，重組菌株不僅能產生EPA還能產生DHA［22］。由此推測，負責EPA合成的pfaB基因比負責DHA合成的pfaB基因合成效率更高，又或者在EPA和DHA合成過程中，Pfa蛋白復合物存在特定的底物競爭機制。但無論是哪種可能，都不能否認pfaB基因是決定PKS途徑合成終產物十分關鍵的基因。

3 PKS途徑研究展望

EPA和DHA這一類具有重要生理活性功能的稀有多不飽和脂肪酸主要來源于海洋魚類。但由于環(huán)境污染對魚類的毒害以及海洋魚類產量的不穩(wěn)定等因素，造成EPA和DHA這類多不飽和脂肪酸產量有限因而價格昂貴［23］。通過PKS途徑合成EPA或DHA，相對于傳統(tǒng)的脂肪酸去飽和酶和脂肪酸延長酶合成途徑而言，具有以下優(yōu)勢:首先，經由PKS途徑合成的多不飽和脂肪酸具有高度的單一性，如腐敗希瓦氏菌SCRC2378、冰海希瓦氏菌(Shewanella gelidimarina ACAM456T)等僅合成EPA而不合成DHA，而海產弧菌MP-1等細菌僅合成DHA而不合成EPA。少數例外，如從海洋魚類腸道中分離到的1株未鑒定種屬的細菌SCRC-21406、細菌16C1以及弧菌屬的1株細菌T3615［3，24］可同時產生EPA和DHA，但往往DHA的含量(約占總脂肪酸含量的5%)遠高于EPA的含量(約占總脂肪酸含量的1%)。至目前為止，尚未發(fā)現PKS代謝途徑除EPA和DHA以外的長鏈脂肪酸等前體物或中間產物出現，而經由真核生物中常規(guī)途徑合成的多不飽和脂肪酸不僅有終產物還有多種前體物質存在。其次，PKS途徑合成多不飽和脂肪酸的過程不依賴于氧分子的存在。無論在有氧條件還是厭氧條件下，這類細菌都可以通過此途徑來完成多不飽和脂肪酸的合成過程;與此不同，真核生物只能在有氧條件下通過常規(guī)途徑來合成各類多不飽和脂肪酸。最后，經由PKS途徑合成的多不飽和脂肪酸需要更少的還原能量，如NADPH。盡管細菌通過PKS途徑合成多不飽和脂肪酸有以上優(yōu)點，但同時也有一定的局限性。絕大部分利用PKS途徑來合成多不飽和脂肪酸的細菌都是從海水中或海洋生物中分離得到的海洋細菌。因此，這類細菌幾乎都在低溫條件下生存，并且也只能在較低的溫度下合成多不飽和脂肪酸。溫度一旦超過一定范圍，雖然有些細菌仍可以生長，但已不再合成多不飽和脂肪酸。另外，這類細菌往往是嗜鹽菌。有研究者發(fā)現這類細菌主要分布在6個屬中，這其中僅2株細菌冷海希瓦氏菌(Shewanella frigidimarina)和日本希瓦氏菌(Shewanella japonica)不嗜鹽，但這2株菌仍然在一定濃度的NaCl存在條件下生長較好［25］。這一現象提示，今后可利用遺傳修飾或定向進化等手段來改變這類細菌合成多不飽和脂肪酸的反應條件，如構建耐高溫或耐低鹽濃度的工程菌株，使其更適合于應用研究。

迄今為止，研究者們已逐步深入了解以海洋細菌為代表的原核生物如何通過PKS途徑來合成EPA和DHA這類多不飽和脂肪酸，但具體機制方面仍有許多不解之謎。譬如，海洋細菌都是通過pfaABCDE基因簇這一固定模式來合成EPA或DHA，并且不同來源的pfaABCDE基因之間也具有很高的相似性，但最終合成的多不飽和脂肪酸卻不一樣，說明一定還存在某種未知機制來決定最終的產物合成。依據已有的研究結果，推測可能是Pfa系列蛋白的相互作用來影響最終產物的合成，但這一推測還需更多的實驗來證實。此外，研究者們發(fā)現一種細胞內中鏈脂肪酸合成的抑制劑淺藍菌素可以促進許多海洋細菌中EPA和DHA的合成［7，26］。目前已經證實脂肪酸合成基因簇(fab)是參與細胞內18碳以內中鏈脂肪酸合成的關鍵基因［19］。因此，下一步的研究方向可以利用已經建立的PKS途徑pfaABCDE基因簇以及fab基因簇的體外重組體系來研究海洋細菌中PKS途徑與中鏈常規(guī)脂肪酸合成途徑間的相關系。

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Advanced in Biosynthesis of Polyunsaturated Fatty Acids by Bacterial Polyketide Synthase Pathway

WAN Xia1，2，JIANG Mu-lan1，2
(1.Oil Crops Res.Inst.of Chn.Acad.of Agric.Sci.，Wuhan 430062;2.Key Lab.for Biol.Sci.of Oil Crops，Minist of Agric.，Wuhan 430062)

Biosynthesis of polyunsaturated fatty acids(PUFAs)in bacteria by polyketide synthase pathway is a newly found way recently.This pathway is fundamentally distinct from previously recognized conventional pathway that needs fatty acid desaturases and elongases of saturated fatty acids.Some research advances on biosynthesis of PUFAs in bacteria by polyketide synthase pathway was summarized in this paper and emphasized on research situation in the molecular mechanism of this pathway，in addition，the research trends in this field and application prospect of this pathway was also speculated on.

bacteria;polyketide synthase;polyunsaturated fatty acids

Q939.1

A

1005－7021(2011)01－0068－06

國家自然科學基金(3100078);農業(yè)部油料作物生物學重點開放實驗室開放課題(201012);

國家公益性科研院所專項資金(200903)

萬霞女，助理研究員，博士。研究方向為微生物油脂和多不飽和脂肪酸代謝工程。E-mail:melaninwx@yahoo.com.cn

*通訊作者。Tel:027-86838791，E-mail:mljiang@oilcrops.cn

2010-12-20;

2011-01-20