向文殿,林 佳
(武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院,湖北,武漢,430023)
我國(guó)魚類遺傳多樣性的研究技術(shù)及進(jìn)展
向文殿,林 佳
(武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院,湖北,武漢,430023)
隨著研究方法和實(shí)驗(yàn)技術(shù)的不斷發(fā)展,我國(guó)魚類遺傳多樣性的研究工作從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生化水平逐漸發(fā)展到了DNA水平,在此從幾個(gè)方面介紹了魚類遺傳標(biāo)記的發(fā)展和應(yīng)用現(xiàn)狀。
魚類;遺傳多樣性;研究技術(shù)
魚類是自然界中人類主要的動(dòng)物食品之一,具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。我國(guó)現(xiàn)有魚類3862種,占世界魚類總數(shù)的20.3%,占我國(guó)脊椎動(dòng)物總數(shù)的60.8%。分布在我國(guó)的淡水(包括沿海河口)魚類共有1050種,分屬于18目52科294屬;海洋魚類迄今記錄有3048種,隸屬288個(gè)科[1]。但由于我國(guó)追求經(jīng)濟(jì)高速發(fā)展,造成了魚類資源急劇下降[2]。一個(gè)魚類群體的遺傳多樣性越豐富,就越能適應(yīng)新的環(huán)境。反之,遺傳多樣性越小,會(huì)因?yàn)榄h(huán)境惡化、過度捕撈等影響,導(dǎo)致種群數(shù)量減少、遺傳衰退等現(xiàn)象,從而使遺傳多樣性貧乏,最終導(dǎo)致該物種滅絕概率的增加,且魚類遺傳多樣性的喪失是人類賴以生存資源的永久性喪失,因而保護(hù)其種質(zhì)資源非常重要。遺傳多樣性研究作為魚類資源保護(hù)的重要手段,起著關(guān)鍵作用。本文就遺傳多樣性研究的各種標(biāo)記進(jìn)行歸納總結(jié),旨在為魚類遺傳多樣性研究提供理論參考。
魚類中蛋白含量高,脂肪含量低是可溶的“不飽和脂肪酸”,肉質(zhì)鮮嫩,深受人們喜愛。魚類肉質(zhì)中含豐富的蛋白質(zhì)、脂肪酸、維生素和微量元素。魚類作為高蛋白、低熱量的食物,是一種比家禽、家畜都要優(yōu)越的動(dòng)物性食物[3]。
隨著生物學(xué)研究層次的提高和實(shí)驗(yàn)手段的不斷改進(jìn),檢測(cè)魚類遺傳結(jié)構(gòu)及多樣性的方法得到了迅速發(fā)展,從形態(tài)學(xué)水平(表型水平)、細(xì)胞學(xué)(染色體)水平、生理生化(蛋白質(zhì))水平發(fā)展到目前的分子水平。
魚類的形態(tài)學(xué)標(biāo)記是以魚的外部形態(tài)特征來檢測(cè)遺傳多樣性的技術(shù),分為傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分析和“框架法”多度量形態(tài)學(xué)分析。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)研究分兩類:(1)可量性狀分析:魚體各部分的測(cè)量值如全長(zhǎng)、體長(zhǎng)、體高等信息。(2)可數(shù)性狀分析:諸如脊椎骨、鰭條、側(cè)鱗線等的數(shù)目。通過對(duì)可量性狀和可數(shù)性狀的數(shù)據(jù)在不同群體間進(jìn)行逐對(duì)比較,分析魚類群體間的形態(tài)差異[4]?!翱蚣芊ā北葌鹘y(tǒng)的形態(tài)學(xué)分析方法在反映魚類形態(tài)差異方面更為有效,它是通過測(cè)量魚體外形輪廓若干特點(diǎn)間的間距,采用多元分析來描述魚的外部輪廓特征。劉建勇等[5]對(duì)我國(guó)沿海不同地理的鯔魚用聚類分析和判別分析及主成份分析的方法進(jìn)行了變量分析。李思發(fā)等[6]對(duì)紅鯉四個(gè)品系(興國(guó)紅鯉、玻璃紅鯉、荷包紅鯉、及甌江彩鯉)的形態(tài)差異和種系關(guān)系進(jìn)行分析,認(rèn)為把可量性數(shù)據(jù)和框架測(cè)定數(shù)據(jù)結(jié)合在一起,使用多元變量分析技術(shù),可增強(qiáng)魚類種內(nèi)不同群體間差異和親緣關(guān)系的研究。
顯微鏡技術(shù)的發(fā)展,使人們建立了通過染色體和帶型分析技術(shù)來鑒別客觀物種分類和核型演化,主要是染色體核型,包括染色體數(shù)目、大小、隨體、著絲點(diǎn)位置和帶型(C帶、G帶和N帶等),它們分別反映了染色體結(jié)構(gòu)上和數(shù)量上的遺傳多態(tài)性來揭示魚類的遺傳變異情況[7]。周伯春[8]等對(duì)我國(guó)海產(chǎn)的條石鯛、金錢魚、星斑裸頰鯛注射植物血球凝集素和秋水仙素進(jìn)行核型制片,用以研究三種魚類種屬間的親緣關(guān)系。鐘聲平[9]等采用PHA體內(nèi)注射法制備了我國(guó)七帶石斑魚頭腎組織染色體標(biāo)本并進(jìn)行了核型分析,探討七帶石斑魚的演化地位。
魚類蛋白質(zhì)水平的研究是以基因表達(dá)的直接產(chǎn)物蛋白質(zhì)為遺傳標(biāo)記,而同工酶所指的是來源相同、催化同一化學(xué)反應(yīng)而蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)、組成不相同的一類酶。根據(jù)同工酶結(jié)構(gòu)中氨基酸序列或組成的不同,在電泳時(shí)的遷移率不同來揭示魚類的遺傳變異[10]。孟彥[11]等對(duì)采自湖北荊州的月鱧和烏鱧6個(gè)組織中的乳酸脫氫酶(LDH)和蘋果酸脫氫酶(MDH)進(jìn)行了分析,研究了兩者的生化遺傳特性和遺傳差異。李敏[12]等對(duì)貴州的5種野生魚的肝、腎組織中的EST同工酶進(jìn)行了研究,并以酶譜為性狀結(jié)合數(shù)值分類法計(jì)算了EST同工酶的聯(lián)合系數(shù),分析了5種魚之間的親緣關(guān)系。
1.4.1 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)
RFLP 技術(shù)由 Bostein(1980)[13]首次提出。該技術(shù)是由限制性酶切位點(diǎn)的插入、缺失、重排或點(diǎn)突變所引起的基因型間限制片段長(zhǎng)度差異這一概念作為一種分子標(biāo)記用于遺傳作圖。由于RFLP技術(shù)分析所需的DNA量比較大,而且檢測(cè)步驟多,檢測(cè)時(shí)要用到放射性同位素等因素限制了RFLP技術(shù)的使用范圍。使得分子量較小、容易純化的DNA樣品如線粒體DNA、葉綠體DNA、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的RFLP分析得到了發(fā)展和應(yīng)用。張敏瑩[14]等對(duì)我國(guó)長(zhǎng)江下游銅魚線粒體DNA的控制區(qū)(D-loop區(qū))和細(xì)胞色素b(Cytb)遺傳多樣性進(jìn)行了PCR-RFLP分析,發(fā)現(xiàn)銅魚線粒體DNA遺傳多樣性較低。王淞[15]等對(duì)湖北監(jiān)利、江西瑞昌、湖南長(zhǎng)沙3個(gè)長(zhǎng)江野生鰱和天津?qū)幒?個(gè)人工繁殖群體進(jìn)行了mtDNA D-loop區(qū)段的RFLP分析,發(fā)現(xiàn)只有寧河人工繁殖群體的多樣性指數(shù)最高。
1.4.2 微衛(wèi)星DNA(Microsatellite DNA)
微衛(wèi)星(Microsatellite)又稱簡(jiǎn)單序列(simple sequence repeat,SSR),重復(fù) DNA 是由 1—6 個(gè)核苷酸為重復(fù)單位組成的長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)核苷酸的重復(fù)序列,在染色體上呈隨機(jī)分布,由于重復(fù)次數(shù)不同及重復(fù)程度不同而造成了每個(gè)座位的多態(tài)性。微衛(wèi)星中最常見的是兩個(gè)核苷酸的重復(fù)單位,如(AT)n[16]。
微衛(wèi)星標(biāo)記以其多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性和可靠性倍受關(guān)注,在水生生物的種群遺傳多樣性分析中得到了廣泛的使用。史方[17]等使用微衛(wèi)星標(biāo)記評(píng)估了我國(guó)烏江彭水水電站對(duì)泉水魚的影響。研究表明水電站建成后造成了阻隔,對(duì)生態(tài)環(huán)境的連通性及壩上壩下魚類的交流產(chǎn)生了不利,影響了物種的遺傳多樣性。全迎春[18]等應(yīng)用微衛(wèi)星對(duì)東北大口鲇的2個(gè)群體進(jìn)行了多態(tài)性分析,完成了該魚種的種群遺傳分析。
1.4.3 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA(Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD)
RAPD 技術(shù)是由 Williams(1990)[19]和 Welsh(1990)[20]兩個(gè)研究小組同時(shí)發(fā)展起來的一項(xiàng)DNA多態(tài)性檢測(cè)技術(shù),其原理是采用隨機(jī)合成的較短的單個(gè)隨機(jī)引物對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。孟立霞[21]等運(yùn)用RAPD的技術(shù)對(duì)四川雅礱江流域的2屬5種(亞種)裂腹魚類的親緣關(guān)系進(jìn)行分析,得到了和形態(tài)學(xué)研究一致的結(jié)果。孟彥羽[22]等運(yùn)用RAPD對(duì)采自海南、浙江、江蘇和河北等近海海域的4個(gè)地理群體銀鯧進(jìn)行了遺傳多樣性分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)江蘇群體的遺傳多樣性最高,而海南的銀鯧群體多樣性較低。
1.4.4 內(nèi)部簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Inter Simple Sequence Repeats,ISSR)
ISSR技術(shù)的基本原理就是在SSR的3’或5’端加錨1—4個(gè)嘌呤或嘧啶堿基,然后以此為引物,對(duì)兩側(cè)具有反向排列SSR的一段DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增,然后進(jìn)行電泳、染色,根據(jù)譜帶的有無及相對(duì)位置來分析不同樣品間ISSR標(biāo)記的多態(tài)性[23]。吳興兵[24]等使用ISSR技術(shù)對(duì)我國(guó)的青魚、草魚、鰱、鳙、團(tuán)頭魴、翹嘴紅鲌和鱖7個(gè)經(jīng)濟(jì)魚類進(jìn)行了遺傳多樣性分析。韓曉磊[25]等對(duì)我國(guó)長(zhǎng)江蘇州段的野生鳡魚、赤眼鱒和草魚進(jìn)行了簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間擴(kuò)增的遺傳分析,發(fā)現(xiàn)三種魚在形態(tài)分類在屬上是同一水平,且鳡魚和草魚的親緣關(guān)系較近。
1.4.5 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Amplified Fragment Length Polymorphism,AFLP)
AFLP技術(shù)是由荷蘭Keygene公司科學(xué)家Zebeau Marc(1993)發(fā)明創(chuàng)建的一種DNA分子標(biāo)記新技術(shù)[26],它不僅具備了其它DNA分子標(biāo)記技術(shù)所具有的特點(diǎn),多態(tài)性豐富,共顯性表達(dá),不受環(huán)境影響,無復(fù)等位效應(yīng),而且還具有帶紋豐富,用樣量小,靈敏度高,快速高效等特殊優(yōu)點(diǎn)。佟廣香等[27]對(duì)我國(guó)野生哲羅魚種質(zhì)資源遺傳多樣性的AFLP分析發(fā)現(xiàn)哲羅魚資源減少影響了其種群的遺傳多樣性,應(yīng)采取及時(shí)有效的措施對(duì)野生哲羅魚資源進(jìn)行保護(hù)。
1.4.6 DNA測(cè)序分析及單核苷酸多態(tài)性分析技術(shù)
DNA序列測(cè)定是直接從遺傳物質(zhì)DNA的核苷酸組成上檢測(cè)遺傳變異,分析對(duì)象可分為線粒體DNA和核DNA兩種,它能提供基因組特異區(qū)域的完全的遺傳信息。核DNA受到人們關(guān)注的是核糖體DNA,對(duì)于真核生物的研究主要為ITS區(qū)域[28]。魚類線粒體DNA的研究區(qū)域主要為細(xì)胞色素b(Cytb)區(qū)域、3個(gè)細(xì)胞色素c(Cytc)氧化酶的亞單位(COⅠ、Ⅱ、Ⅲ)區(qū)域和線粒體控制區(qū)(D-環(huán)區(qū))[29]。
各類遺傳多樣性研究技術(shù)在魚類研究中取得了很大的進(jìn)展。在種群遺傳結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系分析方面:牟希東[30]等用RAPD對(duì)金魚的5品系草金、紅龍睛、鶴頂紅、水泡、黑壽的遺傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)行了研究;馬春艷[31]以中國(guó)近海的5屬11種的鳀科魚類為研究對(duì)象,分析其線粒體16SrRNA片段,探討了中國(guó)鳀科魚類的親緣關(guān)系。在系統(tǒng)發(fā)育方面:馬春艷[32]等對(duì)中國(guó)沿海鯧屬的銀鯧、中國(guó)鯧、翎鯧的mtDNA的細(xì)胞色素b基因片段進(jìn)行了PCR擴(kuò)增,分析了鯧屬魚類的系統(tǒng)進(jìn)化及親緣關(guān)系;呂鳳義[33]等對(duì)我國(guó)4種鲿科魚類的mtDNA的控制區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,通過遺傳距離和系統(tǒng)分析了親緣關(guān)系;梁日深[34]對(duì)我國(guó)石鱸科的4屬10種魚類的S7核糖體蛋白基因內(nèi)含子1部分序列特征,采用MP法和NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析其親緣關(guān)系。在種質(zhì)鑒定方面:張平[35]等提出運(yùn)用RAPD-SCAR在魚類可以使種質(zhì)鑒定更準(zhǔn)確高效,縮短魚類的育種周期;夏軍紅[36]對(duì)細(xì)胞色素b進(jìn)行PCR擴(kuò)增,進(jìn)行了鯛科魚類的種類鑒定分析。在遺傳圖譜構(gòu)建和遺傳育種方面:張研[37]運(yùn)用微衛(wèi)星技術(shù)、RAPD技術(shù)和AFLP技術(shù)對(duì)我國(guó)的鯉魚進(jìn)行了分子標(biāo)記研究并構(gòu)建了鯉魚的遺傳連鎖圖譜,為培育出生長(zhǎng)快、抗病強(qiáng)、適應(yīng)集約化的鯉魚提供了理論依據(jù)。
上述的各種研究方法并不相互排斥,都能提供許多有價(jià)值的信息,因此,對(duì)幾種研究方法結(jié)合運(yùn)用,能為遺傳多樣性研究提供更為充分而全面的信息。而這些技術(shù)在魚類的遺傳學(xué)研究、保護(hù)生物學(xué)、漁業(yè)資源管理方面有著廣闊前景。
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Research techniques and progress of fish genetic diversity in China
XIANG Wen-dian,LIN-Jia
(School of biology and Pharmaceutical Engineering,Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023,China)
With the development of research methods and experimental techniques,the research of fish genetic diversity has developed from morphological,cytological,biochemcial level to DNA molecular level.This review summarized the research progress on fish genetic markers and the current situation of application.
fish;genetic diversity;research methods;
Q 14
A
1009-4881(2011)03-0029-05
10.3969/j.issn.1009-4881.2011.03.008
2011-03-08.
向文殿(1986-),男,碩士研究生,E-mail:xiangwend@163.com.