激光捕獲顯微切割技術(shù)在胃腸道腫瘤研究中的應(yīng)用

邢 敬* 綜述 陳曉宇 審校

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院消化內(nèi)科 上海市消化疾病研究所（200001）

人體組織是由多種細(xì)胞組成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，實(shí)體瘤組織如胃腸道腫瘤不僅包含腫瘤細(xì)胞（實(shí)質(zhì)成分），還包含其他多種類(lèi)型的細(xì)胞和基質(zhì)（間質(zhì)成分），如各種炎性細(xì)胞、纖維結(jié)締組織等，因此通過(guò)直接研磨組織塊提取DNA、RNA、蛋白質(zhì)等進(jìn)行研究并不能確切反映腫瘤的生物學(xué)特性。隨著分子生物學(xué)研究的進(jìn)展而出現(xiàn)的芯片技術(shù)、腫瘤基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等高通量分析均需獲取單一純凈的細(xì)胞。雖然細(xì)胞培養(yǎng)可解決組織異質(zhì)性問(wèn)題，但體外培養(yǎng)的細(xì)胞脫離了體內(nèi)環(huán)境，缺乏細(xì)胞間的相互作用和神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)，不能完全反映細(xì)胞在體內(nèi)的真實(shí)情況。此外，體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞株多源自中晚期癌細(xì)胞，無(wú)法反映腫瘤發(fā)生早期的分子生物學(xué)特點(diǎn)。

激光捕獲顯微切割（laser capture microdissection,LCM）技術(shù)是一種在顯微鏡直視下，通過(guò)激光捕獲和切割從異質(zhì)性組織中獲得純凈目的細(xì)胞群或單個(gè)細(xì)胞的技術(shù)[1]。LCM系統(tǒng)最早于1996年由美國(guó)國(guó)立癌癥研究所的Emmert-Buck等設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)，并于次年實(shí)現(xiàn)商品化。該技術(shù)既解決了組織異質(zhì)性問(wèn)題，又不脫離體內(nèi)環(huán)境，很好地滿足了研究的需要，是連接病理學(xué)研究與分子生物學(xué)研究不可或缺的橋梁。迄今為止，LCM結(jié)合 PCR、RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR、二維電泳（2-DE）、蛋白質(zhì)印跡法、質(zhì)譜法等多種技術(shù)，已在乳腺、前列腺、胃、結(jié)直腸等多種組織器官的研究中得到廣泛應(yīng)用。目前使用的LCM系統(tǒng)主要包括 Arcturus PixCell IIe、Zeiss PALM MicroBeam和Leica AS LMD三種，三者各有其優(yōu)缺點(diǎn)。我國(guó)是胃癌高發(fā)地區(qū)，近年來(lái)結(jié)直腸癌的發(fā)病率亦逐漸升高。為此，本文對(duì)LCM的操作步驟及其與多種技術(shù)結(jié)合，在胃腸道腫瘤研究中的應(yīng)用作一綜述。

一、LCM的操作步驟

1.標(biāo)本的制備和保存

冰凍組織的制備和保存：手術(shù)切除或活檢標(biāo)本獲得后立即以O(shè)CT冰凍切片包埋劑包埋，液氮冷凍，-80℃冰箱干燥保存?zhèn)溆?。如不預(yù)先包埋，后續(xù)切片時(shí)仍需行OCT包埋，筆者等在工作實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)這樣可能會(huì)因組織凍融而影響研究結(jié)果。

石蠟包埋組織的制備和保存：所取組織塊三個(gè)維度均不宜大于5 mm。以醛類(lèi)為基礎(chǔ)的固定劑，如甲醛溶液（福爾馬林溶液）屬于交聯(lián)固定劑，可引起RNA降解，適用于DNA的分析，不適用于RNA和蛋白質(zhì)的分析；以醇類(lèi)為基礎(chǔ)的固定劑，如Methacarn液屬于蛋白沉淀固定劑，適用于RNA和蛋白質(zhì)的分析。從石蠟包埋組織中提取得到的活性分子，數(shù)量和質(zhì)量一般均低于冰凍組織[2]。由于常規(guī)病理標(biāo)本多為甲醛固定石蠟包埋（FFPE）保存，有學(xué)者嘗試從FFPE組織中提取RNA和蛋白質(zhì)行基因芯片或定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究，結(jié)果顯示可行[3,4]，其方法學(xué)仍有待進(jìn)一步探討。

2.切片的制備

冰凍切片的制備：冰凍切片機(jī)預(yù)先以75%乙醇擦拭、晾干，切片厚度以5～10μm為宜，不宜過(guò)厚。其中第一張切片行HE染色，用于病理診斷和顯微切割時(shí)的對(duì)照（如包含目的細(xì)胞），明確切片上包含目的細(xì)胞后方可繼續(xù)切片并固定于適當(dāng)?shù)妮d玻片上。如不立即行后續(xù)操作，切片可-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

石蠟切片的制備：連續(xù)切片，厚度以10μm為宜。其中一張切片行HE染色用于病理診斷和顯微切割時(shí)的對(duì)照，其余根據(jù)所使用的LCM系統(tǒng)固定于適當(dāng)?shù)妮d玻片上，常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

3.切片的染色：用于RNA和蛋白質(zhì)分析的冰凍切片染色前需預(yù)先在70%乙醇中固定0.5～1 min。用于辨別顯微切割目的細(xì)胞的染色方法多樣，包括甲基綠、甲苯胺藍(lán)、蘇木精、HE、AB-PAS、免疫組化染色等，可根據(jù)需要選用。然而在染色過(guò)程中，細(xì)胞中的RNA或蛋白質(zhì)可能會(huì)被破壞，從而影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。有研究[5]探討了不同染色方法對(duì)冰凍切片中小鼠漿細(xì)胞瘤細(xì)胞RNA的影響，發(fā)現(xiàn)甲基綠染色對(duì)RNA的影響最小，其次為HE染色和免疫熒光染色，Nissl染色影響最大。單獨(dú)蘇木精染色對(duì)蛋白質(zhì)的影響較小[6]。筆者等曾嘗試對(duì)冰凍切片行快速HE染色，顯微切割后提取DNA、RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行研究，取得良好效果。

4.目的細(xì)胞的切割：各類(lèi)LCM系統(tǒng)的組成大致包括顯微鏡、固態(tài)近紅外激光二極管、激光控制器、控制顯微鏡載物臺(tái)的操縱桿、CCD照相機(jī)、彩色監(jiān)視器等。顯微鏡通常與個(gè)人電腦連接，用于激光的控制和圖像的保存。首先將切片置于顯微鏡載物臺(tái)上。以Arcturus PixCell IIe LCM系統(tǒng)為例，操作需在顯微鏡直視下進(jìn)行，根據(jù)形態(tài)學(xué)或免疫組化染色選擇目的細(xì)胞，以裝有乙烯乙酸乙烯（EVA）聚合物膜的塑料轉(zhuǎn)移帽覆蓋欲切割的區(qū)域，按下按鈕發(fā)射近紅外激光脈沖，瞬間使目的細(xì)胞上不耐熱的EVA膜融化并與目的細(xì)胞結(jié)合，移動(dòng)操縱桿，將目的細(xì)胞從異質(zhì)性組織中切割下來(lái)。每張切片的總捕獲時(shí)間以不超過(guò)40 min為宜。Zeiss PALM MicroBeam LCM系統(tǒng)是以激光脈沖將目的細(xì)胞彈射進(jìn)收集管中。Leica AS LMD LCM系統(tǒng)是以紫外激光脈沖將帶有目的細(xì)胞的聚萘二甲酸乙二醇酯（PEN）膜切割下來(lái)，膜受重力作用落入收集管中。筆者等在使用Leica AS LMD LCM系統(tǒng)的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，由于靜電吸引和空氣擾動(dòng)，切下的膜可能會(huì)吸附在切片背面或飄至別處，因此在切割時(shí)應(yīng)注意防止這些因素的干擾。細(xì)胞收集完成后即可根據(jù)需要進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如不立即進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，可將所收集的細(xì)胞置于EP管中，-80℃保存?zhèn)溆?。有研究[7]顯示，使用LCM系統(tǒng)（Arcturus PixCell）獲得的胃癌細(xì)胞純度如達(dá)到70%，其基因表達(dá)譜檢測(cè)結(jié)果與非顯微切割標(biāo)本相比可存在明顯差異，表明通過(guò)LCM技術(shù)獲取純凈細(xì)胞進(jìn)行研究，結(jié)果更為準(zhǔn)確可信。

二、LCM結(jié)合多種技術(shù)在胃腸道腫瘤研究中的應(yīng)用

1.DNA的分析：腸型胃癌的發(fā)生是一個(gè)多階段、多步驟的過(guò)程，然而胃癌前病變的克隆狀態(tài)及其與細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)的關(guān)系仍未完全闡明。Wang等[8]使用Arcturus Lcc1704 Veritas LCM系統(tǒng)，根據(jù)HE染色結(jié)果從FFPE組織中分離病變和正常胃黏膜上皮細(xì)胞，行人雄激素受體基因PCR以分析其克隆形成能力，結(jié)果顯示單克隆起源率隨腸化生、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變至腸型胃癌的多階段癌變進(jìn)程而逐級(jí)增高（16%、22%、69%和100%），在一定程度上與Ki-67的表達(dá)率相關(guān)，提示克隆狀態(tài)的檢測(cè)可能用于評(píng)估胃癌易感性。

目前認(rèn)為大多數(shù)胃腸道間質(zhì)瘤（GISTs）存在 c-kit或PDGFRA基因激活突變，兩者突變?cè)贕IST發(fā)生早期其起源細(xì)胞Cajal間質(zhì)細(xì)胞（ICCs）向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過(guò)程中起重要作用。Nakajima等[9]使用Arcturus PixCell II LCM系統(tǒng)，根據(jù)KIT免疫組化染色結(jié)果獲得10例散發(fā)性GIST患者FFPE組織中GIST鄰近區(qū)域的ICCs，通過(guò)PCR和直接DNA測(cè)序檢測(cè)了兩種基因的突變情況，發(fā)現(xiàn)無(wú)一例患者存在這兩種基因突變，提示除c-kit和PDGFRA基因突變外，GIST的發(fā)生還可能與其他分子事件有關(guān)。

結(jié)直腸癌的發(fā)生除經(jīng)典腺瘤-腺癌途徑外，尚有de novo途徑和鋸齒狀途徑。研究發(fā)現(xiàn)BRAF基因突變與結(jié)直腸鋸齒狀病變顯著相關(guān)，非鋸齒狀病變中該基因突變罕見(jiàn)，而KRAS基因突變主要與非鋸齒狀增生性息肉相關(guān)。增生性異型隱窩灶（ACF）是公認(rèn)的結(jié)腸癌前病變，Rosenberg等[10]使用Veritas LCM系統(tǒng)從冰凍切片中分離ACF細(xì)胞，通過(guò)直接PCR測(cè)序檢測(cè)了55個(gè)ACF樣本中兩種基因的突變情況，發(fā)現(xiàn)鋸齒狀與非鋸齒狀增生性ACF的BRAF突變率分別為63%和3%，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩組間KRAS突變率無(wú)明顯差異（19%對(duì)42%），表明BRAF基因突變與鋸齒狀增生性ACF顯著相關(guān)，該病變是結(jié)直腸癌鋸齒狀發(fā)生途徑中的早期或可能的起始步驟。

微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI）和雜合性缺失（LOH）與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。Roa等[11]使用Arcturus PixCell I LCM系統(tǒng)，根據(jù)甲基綠染色結(jié)果從94例胃癌活檢標(biāo)本石蠟包埋組織中的淋巴細(xì)胞（對(duì)照）、腸化生和胃癌區(qū)域獲得相應(yīng)細(xì)胞群，通過(guò)放射性標(biāo)記PCR檢測(cè)MSI和LOH發(fā)生情況，發(fā)現(xiàn)83%的胃癌和54%的腸化生中存在LOH，高級(jí)別MSI（MSIH）存在于11.7%的胃癌和17%與MSI-H表型胃癌相關(guān)的腸化生中，表明腸化生在遺傳學(xué)上具有高度不穩(wěn)定性。為驗(yàn)證MSI在胃黏膜腸化生上皮中頻發(fā)的假說(shuō)，Garay等[12]于胃癌高危地區(qū)收集了58例非胃癌腸化生（包括完全性和不完全性腸化生）個(gè)體的活檢標(biāo)本，使用Arcturus PixCell LCM系統(tǒng)，根據(jù)HE染色結(jié)果從乙醇固定石蠟包埋組織中取得化生上皮細(xì)胞，通過(guò)放射性標(biāo)記PCR行MSI分析，結(jié)果顯示無(wú)一例個(gè)體存在MSI，表明MSI在非胃癌個(gè)體的腸化生上皮中屬罕發(fā)事件。

2.RNA的分析：RNA為基因表達(dá)產(chǎn)物，通過(guò)LCM技術(shù)獲得純凈細(xì)胞行RNA分析能更準(zhǔn)確地反映基因表達(dá)情況。既往觀點(diǎn)認(rèn)為轉(zhuǎn)錄因子RUNX3是胃抑癌基因編碼產(chǎn)物。Friedrich等[13]聯(lián)合使用LCM（Arcturus PixCell IIe LCM系統(tǒng)，F(xiàn)FPE組織切片，HE染色）和定量RT-PCR，發(fā)現(xiàn)胃黏膜上皮中RUNX3 mRNA表達(dá)水平極低，且不受腫瘤轉(zhuǎn)化和幽門(mén)螺桿菌（H.pylori）感染的影響，胃間質(zhì)中RUNX3 mRNA呈高表達(dá)，表達(dá)水平與H.pylori誘導(dǎo)的胃炎程度相關(guān)。鑒于RUNX3在胃黏膜上皮中低表達(dá)且在胃癌中未見(jiàn)表達(dá)下調(diào)，不支持RUNX3為胃抑癌基因的假說(shuō)。

類(lèi)肝素酶與腫瘤侵襲和血管生成相關(guān)。Wang等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，如以常規(guī)組織標(biāo)本行RT-PCR，所有胃癌原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)和幾乎所有配對(duì)正常胃黏膜組織中均可檢測(cè)到類(lèi)肝素酶轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)；如聯(lián)合使用LCM（Arcturus LM200 LCM系統(tǒng)，冰凍切片，HE染色）和 RT-PCR，原發(fā)灶胃癌細(xì)胞和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞的類(lèi)肝素酶表達(dá)率分別為47%和95%，配對(duì)正常胃黏膜上皮細(xì)胞中則無(wú)類(lèi)肝素酶表達(dá)，原發(fā)灶胃癌細(xì)胞中的類(lèi)肝素酶表達(dá)與腫瘤侵襲（Borrmann分型、胃壁浸潤(rùn)深度）和淋巴播散范圍密切相關(guān)。該研究結(jié)果表明聯(lián)合使用LCM與RT-PCR是進(jìn)行分子水平分析的可靠方法。

目前關(guān)于胃腸道腫瘤遺傳學(xué)改變的全面、準(zhǔn)確的信息欠缺。Wu等[15]采用LCM（Arturus PixCell II LCM系統(tǒng)，冰凍切片，HistoGeneTMLCM Frozen Section Staining Kit染色）結(jié)合RNA線性擴(kuò)增和cDNA微陣列技術(shù)檢測(cè)胃癌基因表達(dá)譜，鑒定出504個(gè)能區(qū)分胃癌與非胃癌的基因，準(zhǔn)確性高于99%。Wang等[16]采用LCM（Leica LCM系統(tǒng)，冰凍切片，甲苯胺藍(lán)染色）結(jié)合cDNA微陣列技術(shù)比較正常胃組織、胃癌原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的差異基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)了四個(gè)在胃癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用的基因，其中OPCML、RNASE1、YES1的表達(dá)模式類(lèi)似抑癌基因（原發(fā)灶中表達(dá)較正常組織下調(diào)，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中進(jìn)一步下調(diào)），ACK1的表達(dá)模式類(lèi)似原癌基因。后續(xù)以結(jié)腸癌為對(duì)象的研究證實(shí)上述基因在結(jié)腸癌中的表達(dá)模式與在胃癌中相同[17]，提示這些基因可能作為腫瘤侵襲、進(jìn)展的生物學(xué)標(biāo)記。

3.蛋白質(zhì)的分析：通過(guò)LCM技術(shù)獲得純凈細(xì)胞，結(jié)合2-DE、蛋白質(zhì)印跡法、質(zhì)譜法等技術(shù)的研究是尋找有價(jià)值的腫瘤蛋白質(zhì)標(biāo)記的重要途徑。Zhang等[18]采用比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法，聯(lián)合LCM（Leica LCM系統(tǒng)，冰凍切片，甲基綠染色）與SDS-PAGE、18O標(biāo)記、nano-HPLC-MS/MS技術(shù)鑒別胃癌的生物學(xué)標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)與配對(duì)非癌胃黏膜上皮細(xì)胞相比，胃癌細(xì)胞中有42種蛋白表達(dá)上調(diào)，36種蛋白表達(dá)下調(diào)。 Cheng等[19]聯(lián)合使用導(dǎo)航 LCM（Arcturus PixCellα LCM系統(tǒng)，冰凍切片，蘇木精染色）與2-DE技術(shù)，對(duì)惡性與非惡性胃賁門(mén)上皮細(xì)胞進(jìn)行了比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究，結(jié)果顯示癌細(xì)胞中有15種蛋白表達(dá)上調(diào)，8種蛋白表達(dá)下調(diào)，其功能涉及代謝、分子伴侶、抗氧化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖和分化。上述發(fā)現(xiàn)有助于闡明胃癌發(fā)生的分子機(jī)制，并為胃癌的早期診斷和治療提供可能的臨床生物學(xué)標(biāo)記和治療靶點(diǎn)。

90%的結(jié)直腸癌死亡病例與原發(fā)腫瘤的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散有關(guān)。Lin等[20]采用定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法，聯(lián)合使用LCM（Arcturus PixCell IIe LCM系統(tǒng)，冰凍切片，核固紅染色）與2-DE技術(shù)從980個(gè)蛋白中鑒別與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子標(biāo)記，結(jié)果顯示肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白transgelin是預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的最佳候選生物學(xué)標(biāo)記，ROC曲線下面積為0.868（P=0.002）。

確定腫瘤細(xì)胞的蛋白質(zhì)信號(hào)通路激活狀態(tài)，是進(jìn)行腫瘤個(gè)體化生物靶向治療時(shí)患者選擇和分層的基礎(chǔ)。Silvestri等[21]結(jié)合LCM（Arcturus Pixcell II系統(tǒng)，冰凍切片，HE染色）和反相蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)比較了結(jié)直腸癌標(biāo)本癌細(xì)胞與腫瘤間質(zhì)細(xì)胞中75種已知參與了腫瘤進(jìn)展的蛋白質(zhì)的磷酸化情況及其表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞的蛋白質(zhì)激活特征存在顯著差異；非顯微切割全組織樣本與配對(duì)LCM樣本相比，測(cè)得的蛋白質(zhì)信號(hào)激活譜明顯不同。該結(jié)果表明LCM技術(shù)對(duì)獲取足量腫瘤細(xì)胞行蛋白質(zhì)信號(hào)通路激活特征的檢測(cè)具有重要意義。

三、展望

LCM技術(shù)于顯微鏡直視下獲取純凈目的細(xì)胞，解決了組織異質(zhì)性問(wèn)題，與手工切割相比準(zhǔn)確、方便、快捷，大大提高了后續(xù)研究的準(zhǔn)確性，對(duì)于研究胃腸道腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制以及尋找新的診斷和治療靶點(diǎn)具有重要意義。然而，目前LCM技術(shù)仍存在一些缺點(diǎn)和問(wèn)題有待改進(jìn)，如蠟塊保存的組織易發(fā)生降解，從中提取RNA、蛋白質(zhì)進(jìn)行分析有一定難度，相關(guān)試劑盒有待開(kāi)發(fā)；染色效果不盡理想，需具備豐富的病理學(xué)知識(shí)才能準(zhǔn)確辨別目的細(xì)胞，且單純根據(jù)形態(tài)學(xué)特征無(wú)法區(qū)分不同細(xì)胞亞型，需進(jìn)一步開(kāi)發(fā)辨別目的細(xì)胞的快速免疫組化和免疫熒光技術(shù)；獲得的細(xì)胞總量較少，行蛋白質(zhì)組學(xué)研究較為困難，需解決如何利用盡量少的細(xì)胞甚至單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究的問(wèn)題。此外，筆者等在工作實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)顯微切割足量的目的細(xì)胞需耗費(fèi)大量時(shí)間和精力，亦給LCM技術(shù)的廣泛應(yīng)用帶來(lái)很大阻礙。近年導(dǎo)航LCM、自動(dòng)LCM等新技術(shù)陸續(xù)出現(xiàn)，從蠟塊中提取生物大分子的試劑盒的研究以及通過(guò)免疫組化、免疫熒光技術(shù)辨別目的細(xì)胞的方法亦已取得一定進(jìn)展。相信隨著技術(shù)的進(jìn)步，LCM作為一項(xiàng)具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)的技術(shù)與其他多種技術(shù)相結(jié)合，將在胃腸道腫瘤和腫瘤學(xué)以及其他多個(gè)學(xué)科的研究中發(fā)揮更大作用。

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