經(jīng)前平顆粒對(duì)經(jīng)前期綜合征肝氣逆證模型大鼠不同腦區(qū)孕酮受體表達(dá)的影響

巢玉彬,張惠云

(山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥經(jīng)典理論教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東濟(jì)南 250355)

肝氣逆證是經(jīng)前期綜合征(PMS)的一個(gè)亞型,以煩躁易怒等情緒異常為主要臨床表現(xiàn)。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)PMS肝氣逆證發(fā)病與體內(nèi)性激素周期性變化失調(diào)有關(guān)[1],動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)肝氣逆證大鼠下丘腦孕酮受體(PR)的活性下降[2]。為進(jìn)一步明確PR在PMS發(fā)病中的作用機(jī)制,探討經(jīng)前平顆粒中樞內(nèi)的作用靶點(diǎn),本研究采用免疫熒光技術(shù)結(jié)合流式細(xì)胞儀、激光共聚焦顯微鏡研究了經(jīng)前平顆粒對(duì)PMS肝氣逆證模型大鼠下丘腦和頂區(qū)皮質(zhì)中孕酮受體(PR)表達(dá)水平、組織內(nèi)定位分布模式的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

雌性未孕SPF級(jí)SD大鼠30只,體質(zhì)量180～ 220 g,由山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物質(zhì)量許可證號(hào):SCXK(魯)20050015。

1.2 藥品與儀器

免疫熒光試劑盒(一抗為兔抗鼠PR多克隆抗體,二抗為山羊抗兔IgG-FITC,正常山羊封閉血清), Santa Cruz公司產(chǎn)品;L-多聚賴(lài)氨酸,上海創(chuàng)賽科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;經(jīng)前平顆粒,批號(hào) 040216,江蘇揚(yáng)子江藥業(yè)生產(chǎn);ST-A型數(shù)字脈沖生物刺激儀,山東中醫(yī)藥大學(xué)與濟(jì)南軍區(qū)空軍司令通信修配廠聯(lián)合研制;CT15RT臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),上海天美科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;激光流式細(xì)胞儀(FCM,BD FACS Calibur 420),激光共聚焦顯微鏡(LSCM,Zeiss LSM 510),轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)(LEICA RM 2015)。

1.3 模型的建立與檢測(cè)方法

1.3.1 受試大鼠篩選

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前動(dòng)物預(yù)適應(yīng)環(huán)境 1周,大鼠飼養(yǎng)于晝夜顛倒環(huán)境,每天21:00開(kāi)燈,9:00關(guān)燈。預(yù)適應(yīng)結(jié)束后,采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)篩選得分相近大鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)方法,見(jiàn) 1.3.4。

1.3.2 大鼠動(dòng)情周期確定

采用陰道涂片鏡檢法確定正常未孕大鼠的動(dòng)情期[3]。具體步驟如下:用滴管吸取少量生理鹽水滴于大鼠陰道反復(fù)吸取 2～3次,將吸出液涂于載玻片上,使其自然風(fēng)干。用無(wú)水乙醇固定2～5min,用吉姆薩染液充分附著10～30 min,沖洗,干燥,40倍顯微鏡下鏡檢。各期細(xì)胞形態(tài)見(jiàn)表 1。

同時(shí)大鼠動(dòng)情周期評(píng)定輔助采用宏觀行為藥理學(xué)觀察方法[4]:將雌鼠引入雄鼠籠中,觀察大鼠動(dòng)情行為(跳躍,奔走,搖耳,弓背,雄鼠擊打雌鼠背部)確定大鼠動(dòng)情周期,同時(shí)阻止雄鼠爬跨雌鼠。大鼠動(dòng)情前期/動(dòng)情期(即動(dòng)情周期接受期)動(dòng)情行為活躍,而動(dòng)情間期/動(dòng)情后期(即動(dòng)情周期非接受期)動(dòng)情行為減退或消失,中間間隔約2 d左右。最后選取曠場(chǎng)得分相近、動(dòng)情行為規(guī)則出現(xiàn)且活躍、處于動(dòng)情周期非接受期的大鼠納入本實(shí)驗(yàn)。

表1 大鼠動(dòng)情周期卵巢變化及陰道涂片的組織學(xué)變化

1.3.3 分組與給藥

取處于動(dòng)情周期非接受期大鼠 30只,隨機(jī)分為正常對(duì)照組、PMS肝氣逆證模型對(duì)照組、經(jīng)前平顆粒組,每組 10只。正常對(duì)照組正常飼養(yǎng),其他兩組采用電刺激法復(fù)制PMS肝氣逆證大鼠模型[5]:大鼠置入可調(diào)式激惹、噪音、脈沖電刺激籠內(nèi),設(shè)置脈沖電壓2 700～3 300 V,中等強(qiáng)度電流0.5 mA,脈寬0.3 s,間隔時(shí)間白天5 min,夜晚10min,連續(xù)造模5 d。經(jīng)前平顆粒組大鼠在造模同時(shí)給予經(jīng)前平顆粒灌胃給藥,劑量10 g/kg,給藥體積10μL/g,相當(dāng)于人體臨床8倍劑量;PMS肝氣逆證模型對(duì)照組和正常對(duì)照組給予等體積的生理鹽水,每日9:00給藥,每日1次,連續(xù)給藥5 d。

1.3.4 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)方法[6]

100 cm×100 cm×50 cm曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱,周壁底面為黑色,底面用白線(xiàn)劃分為面積相等的 25塊,沿墻的格稱(chēng)為外周格,其余稱(chēng)為中央格。操作者握住大鼠尾根部 1/3處,小心放入曠場(chǎng)正中格,用攝像系統(tǒng)記錄動(dòng)物3min的行為變化。記錄得分值。①水平得分:動(dòng)物穿越底面方塊數(shù)為水平活動(dòng)得分(4爪均進(jìn)入的方格方可記數(shù),為水平運(yùn)動(dòng)得分)。②垂直得分:直立次數(shù)為垂直活動(dòng)得分(兩前爪騰空或攀附墻壁,為垂直運(yùn)動(dòng)得分)。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)總分=①+②。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物篩選和造模后模型評(píng)價(jià)各進(jìn)行 1次測(cè)定。

1.3.5 免疫熒光結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)

末次給藥后,大鼠迅速斷頭,剝離下丘腦、頂區(qū)皮質(zhì),冰上勻漿。冷生理鹽水懸浮,1 200 r/min離心洗滌8min,棄上清液,過(guò)300目篩。沉淀加入0.25%多聚甲醛溶液室溫固定1 h,后0.01 M PBS離心清洗,棄上清液。沉淀加入70%甲醇溶液4℃固定1 h,離心,棄上清液,PBS懸浮離心清洗1次。上述細(xì)胞懸液加一抗(1∶200)及0.1%Triton X-100 4℃過(guò)夜, PBS懸浮離心洗滌2次。二抗室溫孵育30 min,PBS洗滌 3次。冷生理鹽水定容,過(guò) 300目篩。用流式細(xì)胞儀檢測(cè),Cellquest軟件處理數(shù)據(jù)和圖像。

1.3.6 免疫熒光結(jié)合激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)

大鼠斷頭后,取下丘腦和頂區(qū)皮質(zhì),4%多聚甲醛固定,系列酒精脫水,二甲苯透明,常規(guī)石蠟包埋。切片厚度 5μm,鋪有多聚賴(lài)氨酸的玻片展片。石蠟切片脫蠟,山羊血清封閉,一抗4℃過(guò)夜,0.1M PBS (pH 7.4)沖洗。二抗37℃孵育20min,0.1 M PBS (pH 7.4)沖洗,Zeiss LSM 510激光共聚焦顯微鏡檢測(cè),Zeiss LSM 510 Image Exam iner圖像分析軟件半定量分析相對(duì)熒光強(qiáng)度,受體表達(dá)量以相對(duì)熒光強(qiáng)度表示。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)(BZ_139_2138_999_2156_1045)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示,多組比較采用單因素方差分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,以P＜0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 造模結(jié)果

2.1.1 行為學(xué)觀察

與對(duì)照組比較,模型組大鼠活動(dòng)量大,對(duì)外界刺激敏感,用電筆較易激惹,出現(xiàn)精神緊張、相互對(duì)峙、怒目而視、毛豎立、相互追逐及撕咬等現(xiàn)象;而給予經(jīng)前平顆粒預(yù)防治療組,大鼠變化不明顯。

2.1.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)得分對(duì)比

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)水平得分反映動(dòng)物的興奮性,垂直得分反映動(dòng)物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)程度,曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)總分是動(dòng)物探索行為及興奮性的總體反映。結(jié)果表明,較正常對(duì)照組大鼠,模型對(duì)照組大鼠水平得分、垂直得分及曠場(chǎng)總分均增加,垂直得分差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),說(shuō)明此組大鼠活動(dòng)興奮性及認(rèn)知能力均有顯著性升高,結(jié)合宏觀行為學(xué)觀察初步判定模型制備成功;較模型對(duì)照組大鼠,經(jīng)前平顆粒組大鼠水平得分、垂直得分及曠場(chǎng)總分均顯著減少(P＜0.01,P＜0.05),說(shuō)明經(jīng)前平顆粒對(duì)PMS肝氣逆證模型大鼠有明顯預(yù)防治療作用。見(jiàn)表 2。

表2 各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)得分比較 分,±s

表2 各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)得分比較 分,±s

注:與正常對(duì)照組對(duì)比,*P＜0.05;與模型對(duì)照組對(duì)比,#P＜0.05,##P＜0.01。

組 別 動(dòng)物數(shù) 水平得分 豎直得分 總分正常對(duì)照組 10 26.5±14.20 8.3±2.60 38.7±25.70模型對(duì)照組 10 36.4±23.57 15.4±4.95* 43.2±32.96經(jīng)前平顆粒組 10 24.0±13.94## 6.6±1.58## 34.3±10.26#

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

見(jiàn)圖 1,2和表 3。由圖可以看出:與正常對(duì)照組大鼠相比,模型對(duì)照大鼠下丘腦和頂區(qū)皮質(zhì)中 PR蛋白均顯著降低(P＜0.05),經(jīng)前平顆粒組大鼠下丘腦和頂區(qū)皮質(zhì)PR蛋白表達(dá)量較模型對(duì)照組均顯著升高(P＜0.01,P＜0.05),恢復(fù)至正常水平。

表3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)定量統(tǒng)計(jì)結(jié)果比較分,±s

注:與正常對(duì)照組對(duì)比,*P＜0.05;與模型對(duì)照組對(duì)比,#P＜0.05,##P＜0.01。

組 別 動(dòng)物數(shù) 下丘腦 頂區(qū)皮質(zhì)正常對(duì)照組 10 18.5±2.42 13.3±1.69模型對(duì)照組 10 15.5±2.63* 11.2±1.60*經(jīng)前平顆粒組 10 19.5±2.94## 13.6±1.58#

2.3 激光共聚焦顯微鏡定位表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

由圖 3,4可以看出:模型對(duì)照組大鼠下丘腦和頂區(qū)皮質(zhì)神經(jīng)元PR蛋白表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著少于正常對(duì)照組,陽(yáng)性細(xì)胞內(nèi)熒光減弱。與模型對(duì)照組相比,經(jīng)前平顆粒組大鼠相同腦組織中 PR陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加明顯,陽(yáng)性神經(jīng)元中熒光強(qiáng)度也明顯回升。熒光強(qiáng)度定量分析證實(shí),與正常對(duì)照組相比,模型對(duì)照組大鼠下丘腦神經(jīng)元PR蛋白表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)下降(P＜0.01),見(jiàn)表 4。在下丘腦和頂區(qū)皮質(zhì)中,正常對(duì)照組大鼠PR的陽(yáng)性細(xì)胞彌散分布,而模型對(duì)照組大鼠陽(yáng)性細(xì)胞少而且趨向于邊緣,經(jīng)前平顆粒組大鼠細(xì)胞分布模式則趨于正常,見(jiàn)圖 3、圖 4。結(jié)果表明,與正常對(duì)照組相比,模型對(duì)照組和經(jīng)前平顆粒組大鼠下丘腦PR陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞分布模式均發(fā)生不同程度變化。

圖3 大鼠下丘腦PR定位分布免疫熒光照片 (熒光染色,×200)

圖4 大鼠頂區(qū)皮質(zhì)PR定位分布免疫熒光照片 (熒光染色,×200)

表4 各組大鼠下丘腦、頂區(qū)皮質(zhì)相對(duì)熒光強(qiáng)度對(duì)比 分,±s

表4 各組大鼠下丘腦、頂區(qū)皮質(zhì)相對(duì)熒光強(qiáng)度對(duì)比 分,±s

注:與正常對(duì)照組比較,**P＜0.01。

組 別 動(dòng)物數(shù) 下丘腦 頂區(qū)皮質(zhì)正常對(duì)照組 10 1 153.7±58.78 584.3±45.16模型對(duì)照組 10 1 020.4±84.37** 552.8±37.14經(jīng)前平顆粒組 10 1 082.2±94.62 558.9±30.41

3 討 論

PMS發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,可能是多因素作用的結(jié)果,具體病因尚不清楚[7]。不過(guò)已有證據(jù)顯示,PMS軀體和心理癥狀與精神因素、體液潴留、催乳素(PRL)排出增多、雌激素/孕激素(P)比例失常及β-內(nèi)啡肽、5-羥色胺(5-HT)、γ-氨基丁酸(GABA)、腎上腺素(E)能神經(jīng)系統(tǒng)等有關(guān)[8]。體內(nèi)孕酮的變化不僅可以影響下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞[9],還與調(diào)節(jié)情緒和行為的5-HT能、NE能、GABA能系統(tǒng)及單胺氧化酶密切相關(guān)[10-12]。孕酮發(fā)揮調(diào)節(jié)情緒和行為的作用要通過(guò)孕酮受體介導(dǎo),其中樞內(nèi)受體結(jié)合位點(diǎn)分布于視前區(qū)、室旁核、下丘腦前部、腹內(nèi)側(cè)核、弓狀核和正中隆起,另外內(nèi)側(cè)基底下丘腦也包含重要的孕酮受體神經(jīng)元[13]。Wolfe CA等[14]研究結(jié)果表明,PR在大鼠下丘腦和邊緣葉的表達(dá)量及分布模式不僅具有性別差異,而且隨月經(jīng)周期變化而變化。

經(jīng)前平顆粒主要有白芍、香附、川楝子(炒)、柴胡、川芎、枳殼、豆蔻、半夏(姜制)、木香、甘草組成,專(zhuān)為治療經(jīng)前期緊張綜合征肝氣逆證而研制,具有平肝理氣、除脹止痛,佐以和胃之功效。臨床研究證明,經(jīng)前平顆粒治療PMS可能與調(diào)節(jié)患者血清/尿液E2、P、PRL、5-HT、E和NE紊亂有關(guān)[15-16];實(shí)驗(yàn)研究顯示,除前述遞質(zhì)和激素外,經(jīng)前平顆粒還可調(diào)控受試動(dòng)物血清一氧化氮(NO)及超氧化物歧化酶(SOD)等[17-19],對(duì)中樞 5-HT、DA等單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)[20]、內(nèi)嗎啡肽[21]和雌激素受體[22]等與 PMS密切相關(guān)物質(zhì)的失調(diào)也具有顯著糾正作用,但對(duì)中樞 PR與PMS肝氣逆證關(guān)系的研究和報(bào)道則相對(duì)欠缺。

本實(shí)驗(yàn)采用電刺激造模方法復(fù)制PMS肝氣逆證動(dòng)物模型,曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)合宏觀行為學(xué)觀察初步判定模型制備是成功的;免疫熒光技術(shù)結(jié)合流式細(xì)胞儀、激光共聚焦顯微鏡研究證實(shí)經(jīng)前平顆粒能夠顯著上調(diào) PMS肝氣逆證大鼠下丘腦和頂區(qū)皮質(zhì)PR表達(dá)水平,恢復(fù)其中 PR陽(yáng)性細(xì)胞正常分布模式的趨勢(shì)明顯。上述發(fā)現(xiàn)表明,PMS肝氣逆證發(fā)病與中樞PR密切相關(guān),下丘腦和頂區(qū)皮質(zhì)中PR可能是經(jīng)前平顆粒的重要作用靶位,這也為進(jìn)一步研究該病證中樞發(fā)病機(jī)制及新藥研發(fā)提供了部分依據(jù)。

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