高效毛細管電泳在中醫(yī)藥領(lǐng)域的最新進展和應(yīng)用研究*

杜 旭

(天津市藥品檢驗所，天津 300070)

高效毛細管電泳(high performance capillary electrophoresis，HPCE)是上世紀80年代以來迅速發(fā)展的一種新型分離方法，具有高靈敏度、高分辨率、高速度、樣品用量低、成本低的優(yōu)點[1]。中藥品種繁多，藥材產(chǎn)地廣泛，成分復雜。高效毛細管電泳技術(shù)在中藥的定性定量檢測方面有重要的實用價值和非常好的應(yīng)用前景[2]。近年來，HPCE在中醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用得到了迅速開展，現(xiàn)將HPCE在中醫(yī)藥領(lǐng)域的最新進展和應(yīng)用研究綜述如下。

1 中藥材鑒別中的應(yīng)用

1.1中藥及其炮制品鑒定中的應(yīng)用 古今等[3]采用高效毛細管電泳法對冬蟲夏草、亞香棒冬蟲夏草、地蠶進行鑒別，區(qū)分其偽品，效果良好。劉萍等[4]用高效毛細管電泳法鑒別熊膽與猴膽和雞膽汁，有極高的市場價值。

1.2產(chǎn)地差異 白術(shù)為菊科植物白術(shù)的干燥根莖。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，在我國有著悠久的藥用歷史，具有補脾、益胃、燥濕、和中的功效。白術(shù)傳統(tǒng)主產(chǎn)于浙江盤安、新昌、嵊縣及安徽歙縣、黃山、寧國一帶。目前全國20多個省(自治區(qū))多有栽培，少有野生。左堅等[5]通過建立白術(shù)的高效毛細管電泳指紋圖譜，對不同產(chǎn)地的白術(shù)藥材品種質(zhì)量進行了比較，以建立白術(shù)優(yōu)良品種的規(guī)?；N植基地。

2 中藥有效成分測定中的應(yīng)用

HPCE法可用于多種中藥有效成分的分離和含量測定，如生物堿、黃酮類、苷類、有機酸類、醌類、酚類、香豆素類等。

2.1生物堿 生物堿在緩沖體系中大多帶有部分正電荷，一般可用毛細管區(qū)帶電泳(CZE)模式。李俊松等[6]建立了一種同時測定黃連飲片生品與炮制品中小檗堿、巴馬汀、藥根堿、木蘭堿和黃連堿的方法。王玉文等[7]采用非水毛細管電泳法測定金果欖中巴馬汀和藥根堿含量。朱金花等[8]采用膠束電動色譜中大體積進樣法分離測定蓮子心中的蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿，多種生物堿分離結(jié)果良好。王敏等[9]采用電化學發(fā)光法測定鹽酸小檗堿，分離效率高、分析速度快。

2.2黃酮類 黃酮類化合物有很多重要的生理活性，廣泛存在于植物中，多用毛細管膠束電動色譜(MECC)模式分離。陳興國等[10]建立了一種簡單快速的分離槲皮素、蕓香苷和綠原酸的反向遷移毛細管膠束電動色譜(RF-MEKC)新方法。劉菁等[11]測定絞股藍中蘆丁和槲皮素的含量, 王敬鵬等[12]采用化學發(fā)光法測定槐米中蘆丁和槲皮素的含量，具有分析時間短、樣品前處理簡便、進樣量少、有機溶劑消耗少、操作簡便的優(yōu)點。

2.3蒽醌類 蒽醌類化合物結(jié)構(gòu)中多有羥基和羧基。用CZE和MECC都能分析。如分離大黃中5種蒽醌類化合物，并測定掌葉大黃、唐古特大黃和藏邊大黃中的蘆薈大黃素、大黃素和大黃酸的含量。

2.4苷類 在苷類及其他藥物的分離分析方面，黃寶美[13]等建立了毛細管電泳-安培檢測法(CE-AD)測定蘆薈苷的含量。方法檢出限低，靈敏度高，為擴大蘆薈資源的應(yīng)用提供了可靠的科學依據(jù)。曾振興等[14]測定龍膽炮制前后龍膽苦苷的含量變化，結(jié)果表明龍膽經(jīng)過炮制后龍膽苦苷的含量均出現(xiàn)降低，但降低幅度存在較大差異，其原因為龍膽炮制過程中，溫度不易控制恒定，導致炮制效果不同，龍膽苦苷的損失程度也不同。楊慧文等[15]采用毛細管電泳法測定梔子金花丸中黃芩苷含量，與高效液相色譜法相比，具有樣品用量少、分析成本低等優(yōu)點，并減少了對環(huán)境的污染，可用于梔子金花丸的質(zhì)量控制。

2.5含有機酸類藥材 有機酸成分解離后帶負電荷，以CZE模式分析時，在中性成分后出峰，分析時間較長。蒜氨酸是大蒜中重要的生物活性物質(zhì)，是大蒜素的前體，馬曉麗等[16]研究采用高效毛細管電泳法測定大蒜中蒜氨酸含量，試驗中配制了不同pH值的磷酸緩沖液，用以考查pH值對分離效果的影響。隨著pH值的增大，保留時間延長，選用pH值為6.0的緩沖液，分離時間短，峰形佳。石雪等[17]采用毛細管電泳-電化學檢測(CE-ED)法，對不同品種竹葉和竹葉茶中的活性成分香蘭素、香草酸、順式阿魏酸、對羥基苯甲醛、對羥基苯甲酸、咖啡酸和對香豆酸同時進行定性定量分析，為不同品種竹葉的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

2.6含蛋白質(zhì)多肽類藥材 這類化合物在除等電點以外的pH值條件下帶有電荷，因而可以用CZE模式來分離測定。阮桂平等[18]研究表明冬蟲夏草中化學成分的高效毛細管電泳研究主要集中在冬蟲夏草中多糖類、蛋白質(zhì)和核苷類物質(zhì)。定性方面主要是應(yīng)用高效毛細管電泳指紋圖譜鑒別冬蟲夏草，定量方面主要是對冬蟲夏草中核苷成分進行研究。

2.7含多糖類藥材 馬曉麗[19]等實驗首次采用柱前衍生化方法，用毛細管電泳法研究大蒜多糖的單糖組成，以期為大蒜資源的開發(fā)和利用提供基礎(chǔ)依據(jù)。王艷杰等[20]實驗采用Beckman MDQ型高效毛細管電泳儀對純化后的五味子多糖進行單糖組分的分析，通過五味子多糖圖譜與混合單糖圖譜的比較，可以鑒別出大部分單糖的組成成分，為今后進一步深入研究五味子多糖提供實驗參考。

3 中藥復方制劑的成分分析

中藥復方制劑由多種藥材組成，成分復雜。目前控制其質(zhì)量的方法是測定其中一種或多種主要活性成分的含量，常用的分析手段是HPLC。在HPCE成功地用于中藥材成分分析以后，很多分析工作者對多種成分的同時測定進行了深入研究。如羅敏等[21]測定了戊己丸中鹽酸小檗堿與芍藥苷的含量，考查了藥典法、冷浸法和超聲法對鹽酸小檗堿和芍藥苷提取效率的影響，發(fā)現(xiàn)冷浸法提取的含量最低，超聲提取與藥典法提取含量相差不大，由于藥典法的步驟煩瑣，故選用甲醇超聲提取的方法。盧玲等[22]測定了仲草膠囊中槲皮素與綠原酸的含量，結(jié)果表明，在12～20 kV范圍內(nèi)，槲皮素和綠原酸峰高變化很小，遷移時間和分辨率均隨著工作電壓的升高而降低。劉丹等[23]測定一清顆粒中7種成分的含量，方中大黃的活性成分是蒽醌類化合物，黃芩含有黃酮成分，黃連的有效成分為小檗堿等生物堿。鑒于化合物為弱酸性多羥基化合物，應(yīng)選擇堿性緩沖體系。硼酸鹽能與多羥基化合物形成配位鍵，增加負電性，是分離這幾種物質(zhì)的良好體系。

4 中藥安全控制

4.1毒性成分質(zhì)量控制 桂附地黃丸為傳統(tǒng)中藥制劑，由肉桂、附子、熟地黃、山茱萸等8味中藥組成，具有溫補腎陽的作用，臨床上主要用于治療腰膝酸軟，肢冷尿頻。方中附子含有痕量成分烏頭堿，現(xiàn)代藥理研究證實其具有抗炎、免疫抑制、麻醉止痛、抗腫瘤、降血壓等作用。但烏頭堿的毒性很強，人口服烏頭堿0.2 mg即可出現(xiàn)惡心、嘔吐、頭暈、眼花、脈緩、呼吸困難、神志不清、心律紊亂等中毒現(xiàn)象。然而，由于目前附子沒有統(tǒng)一的炮制方法，因此，為控制藥品質(zhì)量，保證用藥安全，李琚沫等[24]采用毛細管電泳法對桂附地黃丸中痕量毒性成分烏頭堿進行質(zhì)量控制。

4.2非法添加化學成分 劉敏等[25]采用毛細管電泳的方法檢測中藥制劑舒骨寧中非法添加的西藥雙氯芬酸鉀,建立的CE檢測方法快速、簡便、溶劑用量少、檢測限符合檢測要求，可作為快速打假的一種手段。

4.3配伍禁忌 有文獻表明黃連與黃芩配伍后可拮抗黃連對紅細胞的損害作用。李偉等[26]通過毛細管電泳法研究認為黃連與黃芩配伍后，共煎液中黃連生物堿和黃芩中黃酮類成分的含量降低的原因，是由于黃連中的生物堿成分與黃芩中的黃酮類化合物形成了沉淀。同樣，黃連和大黃、甘草共煎也會產(chǎn)生沉淀，而且黃連和甘草共煎產(chǎn)生的沉淀能溶于人工胃液。由于中藥方劑傳統(tǒng)入藥方式為湯劑，其配伍共煎后產(chǎn)生的沉淀大部分以混濁液的形式一起服用，而沉淀一般是兩類成分形成的復合物，進入體內(nèi)，受環(huán)境影響不斷解離，起到緩釋的作用，對臨床療效的影響不大，而對于相關(guān)的成藥，由于制備工藝中的過濾步驟除去了大部分沉淀，勢必對其療效造成較大影響。因此，建議在黃連相關(guān)新藥研制中，應(yīng)該采用分煎方式，盡量避免有效成分的損失；傳統(tǒng)的湯劑入藥也可以考慮分煎的方式，以提高療效，降低費用。

5 中藥指紋圖譜的建立

毛細管電泳非常適合水溶性或醇溶性成分的分離分析，是進行中藥質(zhì)量控制的綠色分析方法。其中毛細管區(qū)帶電泳及毛細管凝膠電泳(CGE)的分析對象為可解離的物質(zhì)或帶電荷的物質(zhì)，適用于分離中藥中的生物堿、黃酮及其苷、香豆素類、有機酸類、氨基酸類、核酸類、多肽類及蛋白質(zhì)類等化合物。采用膠束電動毛細管色譜除了能分析上述物質(zhì)外，還能分析中性分子，因此適用于各類物質(zhì)的分析[27]。

中藥制劑成分復雜，目前其質(zhì)量控制的方法多是測定其中一種或幾種指標成分的含量，但這種方法不能完全體現(xiàn)出中藥制劑的整體質(zhì)量，在尚不清楚全部化學成分的情況下，通過色譜、光譜、波譜、質(zhì)譜等儀器分析所得物質(zhì)群指紋圖譜展現(xiàn)了這種可能性。目前指紋圖譜已成為國際公認的控制中藥或天然藥物質(zhì)量最有效的手段。孫國祥等[28]建立了復方丹參滴丸的HPCE法，為復方丹參滴丸制劑的質(zhì)量控制提供了檢測方法。時存義等[29]建立黃芩的毛細管電泳指紋圖譜，并對黃芩苷進行含量測定，由于雜質(zhì)對毛細管柱壽命無影響，分辨能力強，能較好地與干擾物分離，精密度高，有機溶劑消耗少，測定成本低，在中藥有效成分的分離檢測中顯示了較好前景。孫國祥等[30]建立復方丹參滴丸毛細管電泳指紋圖譜，結(jié)果表明，HPCE靈敏度高，適于中成藥中多種有效成分的同時測定。楊宏濤等[31]對苦參的毛細管電泳數(shù)字化指紋圖譜進行了研究，認為圖譜特征明顯、專屬性強，為該藥物的質(zhì)量控制提供了科學依據(jù)。林丈津等[32]建立蓮子心提取物的指紋圖譜，并對該方法學進行考查，認為該方法可作為控制蓮子心提取物質(zhì)量的方法。劉金丹等[33]對甜瓜蒂進行了研究，結(jié)果表明HPCE法分離操作簡便，進樣量小，分離完全，峰形正常，線性范圍較寬，重現(xiàn)性好。孫國祥等[34]經(jīng)對通宣理肺丸進行方法學考查，認為毛細管電泳法精密度高、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好。戈早川等[35]研究烏梢蛇的膠束電動毛細管色譜指紋圖譜時發(fā)現(xiàn)毛細管易沖洗再生，可保持高效，使各成分的分離較佳。荊國祥等[36]認為毛細管電泳法對玄參有效化學成分的定量提供了一條新的途徑。

6 中藥藥理研究及新藥開發(fā)

現(xiàn)代藥理學研究已明確藥物都有其“靶基因”。近年國內(nèi)已有不少學者開展了中藥干預(yù)基因表達的調(diào)控研究，初步證明中藥作用原理與其生物活性成分調(diào)控基因表達有關(guān)，從而為中藥新藥研制提供了新思路。靶基因是中藥作用最本質(zhì)的指標，研究中藥能提高那些基因的表達。許多天然植物提取物中有效成分具有抗癌作用，從中篩選出對DHFR有抑制作用的物質(zhì)，可以降低對人體健康細胞的副作用和耐藥性[37]。HPCE技術(shù)優(yōu)勢在于對DNA、RNA等生物大分子的快速分析。依據(jù)用藥后相關(guān)組織DNA、RNA所出峰的數(shù)目、相對含量及區(qū)間內(nèi)指紋圖譜，探討中藥對特異性調(diào)節(jié)基因的影響及對肌體自身DNA修復機能的作用，從中篩選出療效確切、針對性強、有應(yīng)用前景的中藥。這對于提高我國中藥藥理及新藥研制水平將有積極的意義。

應(yīng)用HPCE的一個很有前景的方向是：高通量藥物篩選法篩選組合化學庫或者是傳統(tǒng)中藥中的前體藥物，一些常用藥物篩選技術(shù)僅能提供Ic值，在HPCE的幫助下，能獲得結(jié)合常數(shù)以及化學計量數(shù)。一個更明顯的優(yōu)點在于HPCE分離不要求進行樣品純化。因此，單次運行HPCE就可以篩選多個樣品的生物學活性。隨著微型設(shè)備的迅速發(fā)展，可以在芯片平臺上進行超高通量的藥物篩選[38]。

7 中藥藥代動力學方面

利用毛細管電泳法測定制劑中主要有效成分在體內(nèi)的藥時曲線，測算其體內(nèi)藥代動力學參數(shù)，檢測其效果[39]。

8 小結(jié)

高效毛細管電泳以其高效、快速、簡便且柱不易受污染的特點而優(yōu)于HPLC法，在中藥有效成分的分離、定性定量、中藥材鑒別等方面應(yīng)用越來越廣泛。此外，HPCE法可與其他進樣技術(shù)如流動注射聯(lián)用，不但可提高測定精度，而且能完成連續(xù)自動進樣及在線分析，方便大批量樣品的測定，或采用CE-MS、CE-NMR及CE-MS-MS的聯(lián)用技術(shù)，充分利用HPCE的高分離效率和MS或NMR的高靈敏度與定性鑒定能力，快速完成眾多復雜成分的分離與結(jié)構(gòu)鑒定，大大提高和拓寬CE的性能和應(yīng)用范圍，更適用于中藥復雜化學成分的分離與測定。因此，HPCE在中藥制劑質(zhì)量控制及中藥現(xiàn)代化進程中必將發(fā)揮巨大作用。

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