大黃魚(yú)野生群體與養(yǎng)殖群體遺傳多樣性研究

陳淑吟,徐士霞,張志勇,郭忠仁,孫中響,3,朱立靜,3

(1.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所,江蘇 南通226007; 2.南京師范大學(xué) 生命科學(xué)院 動(dòng)物遺傳資源研究所,江蘇 南京,210097; 3.蘇州大學(xué) 醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院,江蘇 蘇州 215123)

大黃魚(yú)(Pseudosciaena croceaRichardson 1846)隸屬鱸形目(Perciformes)、石首魚(yú)科(Sciaenidae)、黃魚(yú)屬(Pseudosciaena),主要分布于中國(guó)黃海南部、東海和南海,為暖溫性近海集群洄游魚(yú)類,一般體長(zhǎng)20～40 cm,最大可達(dá)75 cm,曾是中國(guó)傳統(tǒng)的“四大海魚(yú)”之一。20世紀(jì) 70年代以前,大黃魚(yú)具有明顯的漁場(chǎng)和漁汛期[1]。由于酷漁濫捕和環(huán)境污染,大黃魚(yú)自然資源幾近枯竭,到80年代以后形不成漁汛。漁業(yè)部門(mén)雖然制訂了許多資源保護(hù)措施,但至今大黃魚(yú)仍屬東海區(qū)資源嚴(yán)重衰退的種類[2]。20世紀(jì)80年代末劉家富等[3]研究成功人工繁育大黃魚(yú),現(xiàn)在大黃魚(yú)人工養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)化規(guī)模在福建、浙江等地不斷壯大,但伴隨著產(chǎn)業(yè)發(fā)展又面臨著大黃魚(yú)品質(zhì)下降、病害頻發(fā)的局面,進(jìn)行科學(xué)管理對(duì)保護(hù)和恢復(fù)大黃魚(yú)資源相當(dāng)必要[4]。近幾年來(lái),開(kāi)展的人工放流大黃魚(yú)對(duì)恢復(fù)幾近枯竭的自然資源具有積極意義,而對(duì)現(xiàn)有遺傳資源的了解有助于進(jìn)一步保護(hù)該資源的遺傳多樣性。

中國(guó)黃海南部的呂泗漁場(chǎng)為大黃魚(yú)主要自然分布區(qū)之一,目前大黃魚(yú)自然資源也十分稀少,有關(guān)該海區(qū)大黃魚(yú)的種質(zhì)狀況及其與其他群體的遺傳差異未有報(bào)道; 而且,該海區(qū)是目前尚未開(kāi)發(fā)人工養(yǎng)殖的大黃魚(yú)主要分布海域。線粒體COI基因序列作為功能穩(wěn)定又具較多變異的序列,作為分子標(biāo)記已被應(yīng)用于許多水生生物種群遺傳學(xué)研究中,但目前尚未見(jiàn)用于大黃魚(yú)的群體遺傳學(xué)研究。作者利用線粒體COI基因序列片段與ISSR標(biāo)記方法研究大黃魚(yú)江蘇呂泗漁場(chǎng)自然群體的遺傳多樣性,并比較其與浙江、福建主產(chǎn)區(qū)兩個(gè)養(yǎng)殖群體間遺傳差異,為大黃魚(yú)資源保護(hù)與利用提供更多依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源與總基因組DNA提取

大黃魚(yú) 3個(gè)群體樣本取樣時(shí)間在 2009年 9～10月。江蘇野生群體樣本(JS,30個(gè))于呂泗漁場(chǎng)海區(qū)為3次捕撈得到,體長(zhǎng)22.2～24.8 cm; 兩個(gè)養(yǎng)殖群體樣本分別來(lái)自浙江象山港(ZJ,30個(gè))和福建寧德(FJ,30個(gè))養(yǎng)殖海區(qū),體長(zhǎng)分別為 8.2～9.2 cm、20.3～21.6 cm。

基因組總 DNA提取采用 DNA提取試劑盒(Takara,DV811A),按試劑盒說(shuō)明書(shū)要求操作,最后洗脫定溶于TE(100 mg/L)溶液中,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 COI引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增

根據(jù)魚(yú)類COI通用引物[5]以及從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載大黃魚(yú)的COI序列,設(shè)計(jì)擴(kuò)增COI基因序列引物,序列為：COI-F：5’ -TCT ACT AAT CAC AAA GAC ATC GGC AC-3’ /COI-R：5’-GAC CTC AGG ATG GCC GAA GAA TCA-3’。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

PCR反應(yīng)總體積為50 μL,含有：DNA模板約50 ng,濃度為10 pmol引物各1 μL,25 μLPremix ExTaq聚合酶混合液(Takara,Code：D332A)。PCR擴(kuò)增參數(shù)為：94℃預(yù)處理 5 min; 進(jìn)行 35 循環(huán)：94℃ 30 s,55℃30 s,72℃ 1 min; 最后72℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳,溴化乙錠(Ethidium bromide,EB)染色,凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)。產(chǎn)物經(jīng)試劑盒(BBI,Code：BS364)切膠純化后送上海Sangon用PCR反應(yīng)引物雙向測(cè)序。測(cè)序儀器為ABI PRISM 3730,測(cè)序試劑為BigDye terminator v3.1。

1.3 COI序列數(shù)據(jù)分析

所得DNA序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST同源檢測(cè)確認(rèn); 利用 ClustalX1.81[6]軟件進(jìn)行序列比對(duì)及波形圖譜校正。用MEGA4.0軟件[7]統(tǒng)計(jì)序列的核苷酸組成、多態(tài)性位點(diǎn)及構(gòu)建基于 Kimura’s 2-parameter模型 (Kimura,1980)的鄰接法(Neighborjoining,NJ)與非加權(quán)分組平均法(Unweighted pair-group method with arithmetic mean,UPGMA)系統(tǒng)樹(shù)(bootstrap重復(fù)1000 次)。用DNAsp 4.0軟件[8]計(jì)算單倍型數(shù)量(Number of haplotypes,Nh)、單倍型多態(tài)性(Haplotype diversity,簡(jiǎn)稱Hd)、平均核苷酸差異(Average number of differences,簡(jiǎn)稱K)、核苷酸多樣性(Nucleotide diversity,簡(jiǎn)稱Pi),應(yīng)用 Nei(1973)基因多樣度法計(jì)算遺傳分化系數(shù)(Gst)及基因流(Nm)等。

1.4 ISSR引物篩選與PCR擴(kuò)增

引物為加拿大哥倫比亞大學(xué)UBC公司公布的第9套 ISSR引物序列,由上海生工合成。每個(gè)群體各選取3個(gè)DNA模板在15 μL的反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增篩選,從初選的48個(gè)引物中進(jìn)一步篩選10個(gè)擴(kuò)增條帶清晰、重復(fù)性好的引物(表2)進(jìn)行分析。

PCR 反應(yīng)總體積為 25 μL,引物 0.5 mmol/L,DNA 模板約 20 ng,12.5 μLPremix ExTaq 聚合酶混合液(Takara)。PCR擴(kuò)增參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性5 min后進(jìn)入36個(gè)循環(huán)：94℃ 45 s,52℃ 45 s,72℃ 2 min;最后72℃延伸10 min。

1.5 ISSR擴(kuò)增的電泳檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在 minicell EC350 電泳儀上進(jìn)行檢測(cè),電泳緩沖液為 0.5×TBE,瓊脂糖凝膠濃度為 1.5%(含 0.5 μg/mL EB),電壓不超過(guò) 5 V/cm,電泳2～3 h后取出,于 BIO- RAD 紫外成像儀下拍照記錄。

按照電泳圖譜中同一位置上DNA帶的有無(wú)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),有帶記為“1”,無(wú)帶記為“0”,記錄清晰、穩(wěn)定且長(zhǎng)度在200～2000 bp范圍內(nèi)的擴(kuò)增帶,將圖譜轉(zhuǎn)化為 0/1矩陣。應(yīng)用 Popgene1.31[9]軟件在假定種群處于 Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)下,應(yīng)用 Nei (1987)分析群體遺傳參數(shù)方法,分別計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)百分率(PPL)、群體總基因多樣性(Ht)、群體內(nèi)基因多樣性(Hs)、群體間的遺傳分化系數(shù)(Gst),并根據(jù)Nei’s遺傳距離,對(duì)群體進(jìn)行UPGMA樹(shù)聚類分析。

以Gst估算基因流：Nm=0.5(1 -Gst)/Gst[10]

2 結(jié)果

2.1 不同群體 COI 基因片段擴(kuò)增結(jié)果與序列分析

大黃魚(yú)mt DNA基因COI片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果為單一條帶,長(zhǎng)度約 700bp,空白對(duì)照沒(méi)有出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物。序列經(jīng)比對(duì)后得到片段長(zhǎng)度為625 bp,經(jīng) NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)相似性檢測(cè)確認(rèn)為大黃魚(yú)COI基因序列。測(cè)序成功65個(gè)序列,分別為：JS群體28個(gè)、ZJ群體19及FJ群體18個(gè)。

序列共檢測(cè)到18個(gè)多態(tài)位點(diǎn),其中11個(gè)為簡(jiǎn)約信息位點(diǎn),無(wú)插入或缺失位點(diǎn),轉(zhuǎn)換與顛換比值為4.089,序列的堿基組成T、C、A及G的平均含量分別為27.7%、30.7%、22.4%及19.2%,A+T含量(50.1%)與G+C相當(dāng)。共有15個(gè)單倍型,單倍型多態(tài)性(Hd)為0.714,不同單倍型多態(tài)位點(diǎn)分布見(jiàn)圖1。JS野生群體28個(gè)樣本中有9個(gè)群體獨(dú)享單倍型,占群體14個(gè)單倍型的64.28%,這些單倍型沒(méi)有共同變異位點(diǎn);ZJ群體獨(dú)享單倍型1個(gè)(h5),占群體單倍型的9.09%;FJ群體沒(méi)有獨(dú)享單倍型; 3群體間共享 3個(gè)單倍型(h1、h4及h11),其中單倍型h1擁有最多個(gè)體數(shù),分別為來(lái)自JS群體8個(gè)、ZJ群體10個(gè)及FJ群體的16個(gè)樣本; 另外,有 2個(gè)單倍型(h2及 h13)為 ZJ與 JS兩群體共享。從表1幾項(xiàng)指標(biāo)中表明JS群體具有最高的遺傳多樣性,FJ群體的遺傳多樣性明顯偏低。序列單倍型GenBank的登錄號(hào)為：FJ851334- FJ851355和 GQ864238-GQ864250。

表1 基于COI部分序列的大黃魚(yú)3個(gè)群體的遺傳多樣性Tab.1 Genetic diversity of the three populations of P.crocea based on mtDNA COI sequences

圖1 基于 COI部分序列的不同單倍型的變異位點(diǎn)分布(“.”代表相同位點(diǎn))Fig.1 Different sites among 15 haplotypes of mtDNA COI sequences (The “.” reprents the same site)

群體間的遺傳分化估算值(Genetic differentiation estimates,P-value)為 0.9854(P＞0.05,nt significant),且群體間的遺傳分化指數(shù)(Fst)小于0(-0.00333),表明群體間沒(méi)有明顯遺傳分化; 另外,依據(jù)Nei(1973)計(jì)算得出群體間Gst=0.05318,基因流為NmCOI=4.45。從兩兩群體間Gst反映出3個(gè)群體間的親緣關(guān)系,JS與FJ、FJ與ZJ及ZJ與JS群體的Gst分別為 0.02115、-0.0125及-0.0196,即 JS與 FJ群體的親緣關(guān)系最遠(yuǎn),ZJ與JS群體的親緣關(guān)系最近。由15個(gè)單倍型構(gòu)建NJ與UPGMA系統(tǒng)樹(shù)中拓樸結(jié)構(gòu)相似,3個(gè)群體的多數(shù)單倍型并列在一起,見(jiàn)圖2。

2.2 ISSR標(biāo)記的引物篩選與擴(kuò)增結(jié)果

從100個(gè)引物中最終篩選出10個(gè)擴(kuò)增效果較好的引物,見(jiàn)表 2,其中有 4個(gè)引物為雙堿基重復(fù)類型。這些引物擴(kuò)增所得條帶數(shù)多在 8～18,分子量在200～2000 bp范圍內(nèi)。3個(gè)群體大部分引物擴(kuò)增的多態(tài)性差別較大。有 2個(gè)引物擴(kuò)增得出電泳圖譜在不同群體的條帶分布明顯不同,如引物 873擴(kuò)增出 FJ群體在200～300 bp處及400～500 bp處各有3條及1條不同于其他兩群體的特異性條帶(圖3); 在圖4中,引物895擴(kuò)增圖譜在500～600 bp處有2條帶的可以確定樣品來(lái)自ZJ群體。利用引物擴(kuò)增上存在的這些差異條帶,可以進(jìn)行不同種群樣本的鑒定。

圖2 大黃魚(yú)3個(gè)群體COI單倍型的NJ與UPGMA法聚類樹(shù)(節(jié)點(diǎn)上數(shù)字為大于50%置信度)Fig.2 NJ and UPGMA phylogenetic tree based on mt COI gene sequences across 15 haplogypes of P.crocea.(Numbers represent bootstrap percentages that above 50%)

通過(guò) Nei’s(1987)分子進(jìn)化分析,群體內(nèi)的基因多樣性(Hs)為 0.2494,群體總的基因多樣性(Ht)為0.3131,群體內(nèi)的基因多樣性所占比率(Hs/Ht)為0.7965,即群體的變異大部分來(lái)自群內(nèi),群間遺傳差異不大。對(duì)3個(gè)群體進(jìn)行UPGMA聚類分析表明JS群體與ZJ群體系統(tǒng)親緣關(guān)系較近(表3,圖5)。

3 討論

3.1 大黃魚(yú)群體遺傳多樣性與種質(zhì)保護(hù)

DNA序列的單倍型多樣性(Hd)是衡量一個(gè)群體遺傳變異程度的重要指標(biāo),Hd高表明群體具有較高的遺傳多樣性。本研究表明,江蘇野生群體具有豐富得多的遺傳多樣性(Hd=0.9150),而浙江養(yǎng)殖群體又比福建養(yǎng)殖群體具有較高的遺傳多樣性水平,HdZJ=0.6830＞HdFJ=0.3235; 人工養(yǎng)殖群體由于親本個(gè)體數(shù)少及近親雜交等因素,不可避免地喪失某些特定的等位基因,造成其遺傳變異度及遺傳多樣性水平均低于野生種群的狀況[11-13]。養(yǎng)殖群體原有親本的進(jìn)化潛力也對(duì)其后代遺傳多樣性高低有直接影響,本研究得出浙江象山養(yǎng)殖群體表現(xiàn)有較高于福建寧德養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性,這可能與福建人工養(yǎng)殖親本更早人工馴化繁育、遺傳進(jìn)化潛力水平偏低相關(guān)。陳錦等[14]利用同工酶技術(shù)分析得出湄洲的野生群體遺傳多樣性較寧德的野生群體高,而寧德野生和養(yǎng)殖群體及連江養(yǎng)殖群體遺傳多樣性水平幾乎一致; 這可能由于人工放流和養(yǎng)殖逃逸的影響,致使野生群體和養(yǎng)殖群體間存在很大的基因交流,而當(dāng)?shù)睾^(qū)野生數(shù)量稀少也加劇了這種影響。由于自然資源的稀少,除了加強(qiáng)對(duì)捕撈的管理,開(kāi)展大黃魚(yú)人工放流是增加、恢復(fù)其資源量的有效方法。

表2 大黃魚(yú)ISSR引物及群體多態(tài)性Tab.2 ISSR primers sequences and the diversity of P.crocea

圖3 引物873對(duì)3個(gè)群體的擴(kuò)增電泳Fig.3 PCR resulte of primer 873 in three populations

圖4 引物895對(duì)3個(gè)群體的擴(kuò)增電泳Fig.4 PCR resulte of primer 895 in three populations

表3 大黃魚(yú)不同群體的遺傳一致度(上)及遺傳距離(下)Tab.3 Nei's genetic identity (upper diagonal) and genetic distance (lower diagonal) among populations of P.crocea

圖5 基于ISSR的大黃魚(yú)3個(gè)群體UPGMA聚類Fig.5 UPGMA dendrogram for three populations of P.crocea based on ISSR analysis

大黃魚(yú)的集群洄游生活習(xí)性使其具有較廣的擴(kuò)散和分布范圍。田明誠(chéng)等[15]曾依據(jù)形態(tài)特征和地理分布把中國(guó)沿海的大黃魚(yú)分為主要 3個(gè)地理群體：岱衢群(分布于黃海南部至東海中部)、閩-粵東群(分布于東海南部、臺(tái)灣海峽和南海北部)及粵西群(分布于珠江口以西至瓊州海峽的南海區(qū))。目前這些海區(qū)的大黃魚(yú)自然資源已非常罕見(jiàn),瓶頸效應(yīng)和基因漸滲使得該物種的群體遺傳多樣性越來(lái)越低。雖然,人工養(yǎng)殖后代會(huì)丟失一些親本遺傳信息,本研究中野生群體與養(yǎng)殖群體具有很高的遺傳一致度,該結(jié)果與田明誠(chéng)等[15]有關(guān)不同海區(qū)大黃魚(yú)地理群體區(qū)分相一致。依據(jù)mtCOI基因序列的得出3個(gè)群體間的親緣關(guān)系由遠(yuǎn)及近為：FJ與JS＞FJ與ZJ＞ZJ與JS群體。由ISSR的系統(tǒng)聚類樹(shù)也得到與群體分布的地理距離相一致的結(jié)果。兩種標(biāo)記研究結(jié)果均表明群體間基因流均大于 1(NmCOI為 7.02,NmISSR為1.9563),Wright[16]認(rèn)為群體間Nm＞1能發(fā)揮均質(zhì)化作用,從而有效抑制由遺傳漂變引起的遺傳分化。

3.2 不同標(biāo)記方法的大黃魚(yú)群體遺傳學(xué)研究

分子遺傳標(biāo)記在魚(yú)類種質(zhì)資源保護(hù)與應(yīng)用研究領(lǐng)域正發(fā)揮著越來(lái)越重要作用。RAPD、AFLP及SSR標(biāo)記均被用于分析、揭示大黃魚(yú)群體遺傳多樣性[12,17-18]。作者利用mtCOI基因序列揭示的大黃魚(yú)這 3個(gè)群體的遺傳特性,與利用電泳圖譜分析的ISSR技術(shù)得到的結(jié)果基本一致。mtCOI基因序列與ISSR這兩種標(biāo)記在本文研究結(jié)果中的相同點(diǎn)主要為：(1)群體間的Nm皆大于 1,表明群體間存在明顯的基因交流,群體間的地理距離對(duì)基因交流有一定影響;(2)JS群體具最豐富遺傳多樣性,且與ZJ群體親緣關(guān)系更近,系統(tǒng)關(guān)系皆與地理分布距離相一致。兩標(biāo)記方法又有各自的不同點(diǎn)：(1)ISSR是以條帶的擴(kuò)增情況來(lái)反映結(jié)果,不但DNA模板質(zhì)量及條帶統(tǒng)計(jì)對(duì)結(jié)果估算有一定影響,而且需要較多的引物擴(kuò)增、得出較多的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)才能更為真實(shí)的反映群體間的差異狀況; 但方法簡(jiǎn)單,用于種群鑒定上有其優(yōu)勢(shì),作者利用2個(gè)ISSR引物便可以簡(jiǎn)單把不同群體樣品區(qū)分出來(lái); (2)COI基因序列標(biāo)記直接反映種群的DNA遺傳信息,可以準(zhǔn)確得出各群體的遺傳多樣性水平、群體間的系統(tǒng)分化、遺傳差異程度,并已作為動(dòng)物DNA條形碼應(yīng)用于物種鑒定[19],結(jié)果比 ISSR的更清晰; 但9個(gè)JS群體單倍型沒(méi)有具有可以作為區(qū)分群體的特異位點(diǎn)。利用COI基因序列及ISSR兩種標(biāo)記比用單一方法反映出更為確切的群體之間的遺傳進(jìn)化關(guān)系。作者的這些研究結(jié)果為大黃魚(yú)的種質(zhì)保護(hù)與利用研究提供了進(jìn)一步的依據(jù)。

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