長牡蠣早期胚胎發(fā)育中脂肪酸和氨基酸組成變化的研究

劉鵬超,闕華勇,張國范

(1.中國科學(xué)院 海洋研究所,山東 青島 266071; 2.中國科學(xué)院研究生院,北京 100049)

貝類胚胎及幼蟲發(fā)育過程中化學(xué)物質(zhì)變化研究主要是研究貝類從受精卵到變態(tài)期間各個主要時期胚胎及幼蟲體內(nèi)主要生化組成(脂類、脂肪酸、蛋白質(zhì)、氨基酸、碳水化合物、核酸)及變化情況,國外已經(jīng)開展了大量的研究[1-5],國內(nèi)關(guān)于水產(chǎn)動物早期發(fā)育中生化組成及變化的研究主要集中在魚類和甲殼類[6-10],貝類方面尚未見到詳細報道。

長牡蠣(Crassostrea gigas)隸屬于軟體動物門、雙殼綱、珍珠貝目、牡蠣科,是一種廣溫廣鹽性內(nèi)灣貝類,其肉味鮮美,營養(yǎng)豐富,具有很高的經(jīng)濟價值,是我國主要的牡蠣養(yǎng)殖種類之一,也是世界各國海水養(yǎng)殖業(yè)重要的養(yǎng)殖對象。本文通過對長牡蠣早期胚胎發(fā)育中脂肪酸、氨基酸組成及變化的研究,深化對長牡蠣發(fā)育過程的了解,為長牡蠣早期發(fā)育中營養(yǎng)需求的研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料方法

1.1 實驗材料

本實驗所用性成熟長牡蠣購于福建省漳州市漳浦縣霞美鎮(zhèn),置于實驗室 1立方水槽中自然海水暫養(yǎng),每天換水兩次,換水量為50%,定時投喂小新月菱形藻、金藻等單細胞藻類,輔以螺旋藻粉,每天投喂3次。實驗時,隨機選擇牡蠣解剖,鏡檢,選擇發(fā)育良好的卵子和活力好的精子實施人工授精,受精卵中一部分作為受精后0 h樣品取樣,其余受精卵置于50L水桶中培育,水溫控制在25℃左右,每0.5 h攪拌 1次,微量充氣。分別在受精后 6 h(囊胚),12 h(擔(dān)輪幼蟲),24 h(D形幼蟲)用400目篩絹網(wǎng)取樣。使用細胞計數(shù)板統(tǒng)計每毫升水樣中胚胎或幼蟲的數(shù)量以計算樣品中總數(shù)量,所取樣品經(jīng) 6000 r/min離心后,小心吸去上層海水,置于-20℃下冷凍保存。

1.2 測定方法

1.2.1 脂肪酸測定方法

受精后各發(fā)育時期樣品經(jīng)24 h冷凍干燥處理后,參照GB/T 22223-2008的方法測定脂肪酸組成。所用儀器為Agilent 7890A氣相色譜儀,每個時期樣品設(shè)兩個重復(fù)。

1.2.2 氨基酸測定

經(jīng)24 h冷凍干燥處理的樣品采用PITC(異硫氰酸苯酯)柱前衍生法測定氨基酸含量,所用儀器為alliance 2695高效液相色譜(HPLC),每個樣品設(shè)兩個重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用單因素方差分析(ONE-WAY ANOVA)和Tukey’s Post Hoc Tests方法處理和比較相應(yīng)的數(shù)據(jù)。所用軟件為SPSS(16.0版),文中描述性統(tǒng)計值用平均值±標準誤差表示,顯著性水平設(shè)置為a=0.05。

2 結(jié)果

2.1 長牡蠣早期胚胎發(fā)育脂肪酸組成變化

長牡蠣受精后0、6、12、24 h等4個發(fā)育節(jié)點脂肪酸組成及變化情況見表1。從脂肪酸組成看,受精卵共檢測到 27種脂肪酸,其中飽和脂肪酸 8種,單不飽和脂肪酸8種,多不飽和脂肪酸 11種。在8種飽和脂肪酸中,碳原子數(shù)目較少的豆蔻酸(14：0)、軟脂酸(16：0)、硬脂酸(18：0)占主導(dǎo)地位,而奇數(shù)碳原子脂肪酸(15：0、17：0)和高碳原子數(shù)目的脂肪酸(20：0、22：0、24：0)含量較少; 在單不飽和脂肪酸中含量最高的是棕櫚油酸(16：1ω7),其他的含量均較低; 11種多不飽和脂肪酸包括5種ω6系列脂肪酸和6種ω3系列 脂 肪 酸,含 量 最 高 的 是 EPA(20：5ω3)和DHA(22：6ω3),亞 油 酸 (18：2ω6)和 花 生 四 烯 酸(20：4ω6)是 ω6 中含量最高的。

飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸占總脂肪酸的比例隨著發(fā)育進行不斷增大,而多不飽和脂肪酸比例逐漸下降。飽和脂肪酸占總脂肪酸比例在24 h發(fā)育中上升了 18%左右; 24 h時單不飽和脂肪比例相對0 h時也有顯著上升(P＜0.05),但是上升比例較小,在2%左右; 多不飽和脂肪酸比例顯著下降(P＜0.05),ω3系列和 ω6系列脂肪酸比例都有不同程度的下降(表 1)。

受精后 0、6、12、24 h 4個節(jié)點∑ω3/∑ω6比值無明顯變化(P＞0.05),但隨著胚胎發(fā)育的進行,∑ω3與∑ω6比值呈減小的趨勢。在長牡蠣24 h早期發(fā)育中,除了 20：4ω3和 DHA,其他 4種 ω3系列脂肪酸含量都顯著降低(P＜0.05),而ω6系列中除20：2ω6在24 h未檢出外,其他4種含量都無明顯變化(P＞0.05,表1）。

DHA/EPA比值在受精后0、6、12 h三個節(jié)點無明顯變化,而在受精后24 h,DHA/EPA比值有所增大,但不顯著(P＞0.05)。在前三個時期DHA與EPA含量相對穩(wěn)定,而在后面的發(fā)育中DHA相對EPA的含量升高(表1)。

2.2 長牡蠣早期胚胎發(fā)育中氨基酸組成變化

在長牡蠣受精后0、6、12、24 h均能檢測到16種氨基酸,包括7中必需氨基酸,7種非必需氨基酸,2種半必需氨基酸,胱氨酸未檢測出(表2)。

總氨基酸含量(%)干質(zhì)量隨著胚胎發(fā)育進行不斷降低,前三個時期變化不明顯,24 h時明顯下降(P＜0.05)。必需氨基酸總和、非必需氨基酸總和、半必需氨基酸總和都隨著胚胎發(fā)育而降低,與總氨基酸含量變化有正相關(guān)性。在受精卵中,含量最高的是谷氨酸,其次是精氨酸、賴氨酸、亮氨酸。這4種氨基酸在4個時間點含量都保持較高水平。除苯丙氨酸、蘇氨酸及絲氨酸含量在發(fā)育過程個別階段有不顯著增高外,其他各種氨基酸含量都隨著發(fā)育時間進行而降低(表2)。

3 討論

3.1 脂肪酸組成及其變化

本研究中長牡蠣受精卵中飽和脂肪酸含量高于多不飽和脂肪酸,單不飽和脂肪酸含量最少。在菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)中研究發(fā)現(xiàn)含量最高的同樣為飽和脂肪酸,多不飽和脂肪酸最少[11]。而在加拿大兩種貝類蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensis)、巨扇貝(Crassadoma gigantea)的研究中發(fā)現(xiàn),兩種貝類卵子中含量最高的均為 EPA,對應(yīng)的多不飽和脂肪酸含量要高于飽和脂肪酸,單不飽和脂肪酸含量最少[2,12]。不同貝類種類生殖腺或卵子中飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸比例相差很大[2,11-13],不同貝類性腺成熟過程中攝食餌料不同可能是造成這種現(xiàn)象的一個重要原因。此外我們發(fā)現(xiàn),多不飽和脂肪酸高于飽和脂肪酸的幾種貝類多為冷水性貝類或是產(chǎn)卵溫度較低的貝類,而產(chǎn)卵溫度較高的貝類其卵子中飽和脂肪酸含量一般較高。多不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸重要的區(qū)別是其熔點較低,可見產(chǎn)卵溫度較低對應(yīng)較低熔點的脂肪酸,而產(chǎn)卵溫度相對高的貝類卵子中脂肪酸熔點亦較高,這可能與脂肪酸在維持細胞膜的流動性與滲透性中起重要作用相關(guān)聯(lián); 另外,多不飽和脂肪酸含量高的貝類中 EPA含量較高,而無論是哪種貝類,早期發(fā)育中 EPA都大量消耗,這說明產(chǎn)卵溫度較低的貝類受精卵發(fā)育時可能消耗更多的 EPA,考慮 EPA在發(fā)育中的作用,這些貝類受精卵發(fā)育時可能需要更高的能量,這也與其發(fā)育時環(huán)境溫度較低相對應(yīng)。

在長牡蠣早期胚胎發(fā)育中飽和脂肪酸占總脂肪酸和單不飽和脂肪酸比例不斷上升,而多不飽和脂肪酸比例下降,這種現(xiàn)象在前面提到的菲律賓蛤仔、蝦夷扇貝、巨扇貝中也出現(xiàn)[3,12-13]。無論起始受精卵中飽和脂肪酸含量是否高于多不飽和脂肪酸,三類脂肪酸總和在這幾種貝類中增高或降低趨勢是相同的,只是增高或下降的程度有所不同。這可能與不同脂肪酸在胚胎發(fā)育中的功能有關(guān),多不飽和脂肪酸比例下降主要是EPA含量下降,而EPA在胚胎發(fā)育中作為能源消耗,這可能是導(dǎo)致三類脂肪酸比例變化的一個重要原因。

表1 長牡蠣受精后不同時間脂肪酸組成(% 總脂肪酸)變化Tab.1 Variations of fatty acids (% Total fatty acids) of Pacific oyster (Crassostrea gigas) at different times postfertilization

長牡蠣從受精卵發(fā)育到 D形幼蟲,∑ω3與∑ω6比值呈減小的趨勢,ω3系列中部分脂肪酸相對于ω6系列脂肪酸更快的消耗。Pernet等[14]研究發(fā)現(xiàn)在深海扇貝(Placopecten magellanicus)隨著幼蟲發(fā)育其∑ω6與∑ω3比值會增大,認為貝類幼蟲會選擇性地整合或保持 ω6系列脂肪酸,而 ω3系列脂肪酸會被選擇性地消耗利用。而在珍珠貝(Pinctada margaritifera)產(chǎn)出的卵子中∑ω3與∑ω6比值顯著小于生殖腺中卵子各發(fā)育時期[15],∑ω3與∑ω6比值的這種變化可能從卵母細胞發(fā)育就開始,具有一定的連續(xù)性。

表2 長牡蠣受精后不同時間氨基酸組成(% 干質(zhì)量)Tab.2 Amino acid composition of Pacific oyster (Crassostrea gigas)at different times post-fertilization.

長牡蠣早期胚胎發(fā)育中 DHA/EPA比值不斷變化,總體上呈上升趨勢。雖然DHA和EPA含量都在下降,但是EPA消耗更迅速一些。在以前的研究中,很多學(xué)者就發(fā)現(xiàn) EPA和DHA在雙殼貝類發(fā)育中有非常重要的作用,大多數(shù)雙殼貝類自身不能合成EPA和DHA。在早期發(fā)育中EPA更多的作為能源消耗,而 DHA主要作為一種結(jié)構(gòu)物質(zhì),起構(gòu)建作用。在 Whyte等[3]對巨扇貝的研究中,在 72 h發(fā)育中DHA含量基本無變化,這與本實驗結(jié)果有一定差別,但是兩項實驗結(jié)果中 EPA含量都明顯降低,都表明DHA相對EPA含量升高。

3.2 氨基酸的含量變化

氨基酸總含量(%干質(zhì)量)呈下降趨勢,到受精后24 h的D形幼蟲時期顯著降低,但是仍然保持較高水平(占干質(zhì)量的22%左右)。在所檢測的必需氨基酸中,賴氨酸Lys與亮氨酸Leu含量最高,并且在受精后四個時間都保持較高的含量。生物體的代謝中,Leu可分解成乙酰COA和乙酰乙酸,而兩者均是溝通糖類與脂類代謝的重要中間物質(zhì)。在非必需氨基酸中谷氨酸Glu含量最高,可能有兩方面的原因,一是海水貝類為排氨動物,早期胚胎或幼蟲代謝產(chǎn)生的氨需與 Glu結(jié)合形成相應(yīng)的谷氨酰胺,經(jīng)酶分解成游離的氨排出體外; 另外谷氨酸在酶的催化下,可生成相應(yīng)的α—酮戊二酸,而α—酮戊二酸又是三梭酸循環(huán)中關(guān)鍵的中間代謝產(chǎn)物,在胚胎發(fā)育時期谷氨酸對糖、脂、蛋白質(zhì)的代謝及相互轉(zhuǎn)化有重要意義。

致謝：特別感謝福建省水產(chǎn)研究所曾志南、寧岳老師在長牡蠣親貝材料方面的支持,感謝實驗室杜潤山老師、劉磊同學(xué)在幼蟲培育中對我的指導(dǎo)和幫助。

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