雜色鮑與盤鮑雜交F1的早期生物學表現(xiàn)

蔡明夷,柯才煥,郭 峰,王桂忠,王志勇,王藝磊

(1.廈門大學 海洋技術與工程系,近海海洋環(huán)境科學國家重點實驗室,福建廈門 361005;2.集美大學 水產生物技術研究所,福建廈門 361021)

雜色鮑(Haliotis diversicolor)和盤鮑(H.discus discus)是中國最重要兩種養(yǎng)殖鮑,原產地分別為中國臺灣和日本。雖然它們的親緣關系較遠,但是這兩種鮑雜交可以產生后代,并存活至性成熟[1],但存活后代為含有少量父本基因的雌核發(fā)育二倍體[2]。遠緣雜交具有廣泛的應用價值和潛力。親和程度較高的雜交組合,可以直接利用雜交 F1的雜種優(yōu)勢;而親和程度低的雜交組合,也可能在存活后代中篩選出寶貴的育種中間材料和遺傳學研究材料。在胚胎和幼體階段,雜交 F1就可能表現(xiàn)出雜種優(yōu)勢[3-4]或遠交不親和[5-6]。另外,胚胎發(fā)育速度和早期成活率也是分析雜交親和程度和后代遺傳本質的輔助依據(jù)。因此,本文比較研究雜色鮑與盤鮑正反交 F1及其親本自繁后代的早期生物學表現(xiàn),主要包括正反交 F1和親本自繁后代的卵裂速度和孵化速度,以及雜色鮑與盤鮑雜交 F1和雜色鮑自繁幼體的成活率,以期為雜交 F1的后續(xù)應用開發(fā)提供依據(jù),也為進一步研究雜交產生雌核發(fā)育二倍體的機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 親鮑與催產

雜交親本雜色鮑和盤鮑分別由中國臺灣和日本引種, 在福建省東山養(yǎng)殖傳代。親鮑催產采用陰干、紫外線照射過的海水刺激和流水刺激的方法。配子開始排放時,將正在排放的親鮑轉移到單獨的容器中產卵、排精。操作全過程,同種的雌雄個體間保持5 m以上的距離,同時所有的表面及器皿在每一步操作前先用淡水浸洗過,以防止同種精子污染發(fā)生?；旌蟿偱欧诺穆炎雍托迈r精液,授精方法參見蔡明夷等的描述[7]。試驗包括正反交和父母本自繁4個組合：雜色鮑♀×雜色鮑♂、雜色鮑♀×盤鮑♂、盤鮑♀×雜色鮑♂和盤鮑♀×盤鮑♂,下文簡為SS、SJ、JS和JJ。

1.2 胚胎發(fā)育速度的觀察及統(tǒng)計

授精后,胚胎在22～23 ℃下孵育,每隔5 min取樣,每個樣本中卵數(shù)不少于 200個,用 2%福爾馬林固定。取樣結束后,在解剖鏡下檢查記錄樣品中處于各細胞期的卵數(shù)和總卵數(shù),計算出各細胞期胚胎的百分比。以授精時間為橫坐標、各細胞期胚胎的百分比為縱坐標作圖,并用Gussian模型擬合(Origin 7.0),計算出胚胎發(fā)育至各細胞期的時間,其中,μ為平均值,σ為標準偏差(SD)。

參照 Park[8]描述的方法,以胚胎卵裂次數(shù)為橫坐標,授精時間為縱坐標,用胚胎處各細胞期的時間數(shù)據(jù)作圖,并作線形擬合(Y=A+BX,OriginPro7.0),計算出不同交配組合的卵裂周期間隔時間(το＝B)。

每組挑出 200個發(fā)育卵,轉移到結晶皿中用膜濾海水培養(yǎng),用于觀察孵化時間。每20 min,在體視鏡下觀察,計未孵化卵數(shù)(n),并依此計算出各觀察時間的孵化率(H),計算公式為Hi= (200-ni)/200。以授精時間為橫坐標、孵化率為縱坐標作圖,用Sigmoidal擬合工具擬合后,查找出孵化率為 50%的時間作為孵化時間。

1.3 成活率觀察和統(tǒng)計

將2日齡SJ幼體及JJ幼體按每孔30只左右加入預接了矮小卵型藻的6孔培養(yǎng)板中,每組3板,共18孔。培養(yǎng)海水中含20 mg/ L青霉素和鏈霉素。將培養(yǎng)板放置在25 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔24 h觀察記錄1次,并清理死亡個體。成活率＝存活幼體數(shù)/總投放幼體數(shù)×100%。

2 結果

2.1 胚胎發(fā)育速度

圖1示授精后不同取樣時間,自繁和雜交組合SS、JJ、SJ和JS中,2細胞期、4細胞期、8細胞期和16細胞胚胎的百分比,及其高斯擬合圖。利用高斯擬合,計算出SS、JJ、SJ和JS交配組合中,胚胎處2細胞期、4細胞期、8細胞期和16細胞期的時間,結果如圖2所示。自繁組合SS和JJ處2細胞期的時間分別為授精后 45.3 min±8.9 min和 59.3 min±8.9 min,雜交組合SJ和JS的處2細胞期的時間分別為授精后 69.3 min±17.5 min和 71.7 min±5.8 min。可見,SJ和JS兩雜交組合第一次卵裂均慢于雙親自繁組合。

圖1 細胞期雜交和自繁組合胚胎速度比較和高斯模型擬合Fig.1 Comparison of development speed of embryos from hybrid and pure crosses at cell stage and Gaussian fitting

以胚胎卵裂次數(shù)為橫坐標、授精時間為縱坐標,將各細胞期的時間數(shù)據(jù)作點狀圖,直線擬合(Y=A+BX),其中系數(shù)B為每次有絲分裂所需時間(τ0)。自繁組合 SS 和 JJ的τ0分別為 21.7 min±2.9 min和 27.0 min±2.6 min,雜交組合 SJ和JS的τ0分別為22.2 min±4.7 min 和 31.3 min±6.1min(圖2,表1)。各交配組合按τ0從小到大排列為 SS、SJ、JJ、JS?？梢?雜交組合有絲分裂速度均接近于母本,但略慢于母本。

雜交組合的孵化速度慢于母本,按孵化速度排列交配組合為SS、SJ、JJ、JS,孵化時間分別為563.4 min±33.8 min、632.7 min±89.5 min、711.8 min±40.0 min和 874.3 min±94.6 min(圖3,表1)。從 2細胞開始到卵裂,SS、SJ、JJ和 JS組的胚胎歷時相當于23.9τ0、25.4τ0、24.1τ0和 24.8τ0(表1)。

圖2 線性擬合估測雜交和自繁組合的卵裂間隔Fig.2 Liner fitting to estimate the mitotic interval of the offspring from the hybrid and the pure crosses

圖3 雜色鮑與盤鮑雜交及自繁后代的孵化速度Fig.3 The hatching-out speed of offspring from the hybrid and the pure crosses

表1 雜色鮑與盤鮑正反交F1及其親本自繁2細胞期時間、孵化時間和卵裂間隔時間(水溫：22～23 ℃)Tab.1 The time of two-cell stage and hatching-out of hybrid between Haliotis diversicolor and H.disucs discus and their parents

2.2 成活率

與母本自繁組合SS相比,SJ雜交幼體成活率很低(圖4)。在擔輪幼體期和早期面盤期,SJ幼體與SS幼體在形態(tài)上沒有明顯區(qū)別。在授精后第4天,幼體開始附著,這些附著幼體畸形率很高,主要表現(xiàn)為頭部歪向一側,足部不定形(圖5)。授精后第5天(匍匐幼體),SJ幼體開始大量死亡,D4、D5、D6成活率分別相當于對照組的93.3 %、25.6 %、3.05 %、0.8 %。在授精后第9日幼體開始變態(tài),變態(tài)后,SJ的成活率為0.4%±0.03 %,SS的成活率為33.7%±5.9 %。SJ的成活率僅為SS的1.2 %。

圖4 雜色鮑♀×盤鮑♂(SJ)雜交幼體及其雜色鮑自繁幼體(SS)成活率Fig.4 Survival rates of the larvae from heterospecific cross between Haliotis diversicolor and H.discus discus(SJ),and the larvae from the pure cross of H.diversicolor(SS)

3 討論

3.1 發(fā)育速度

圖5 正常的雜色鮑自繁晚期面盤幼體(A)與畸形的雜色鮑×盤鮑雜交晚期面盤幼體(B)的形態(tài)Fig.5 The morphology of normal later veliger from the pure cross of Haliotis diversicolor (A) and the malformed later veliger from the heterospecific cross between Haliotis diversicolor× H.discus discus (B)

在計算卵裂時間、孵化時間時,通常采用 50%個體發(fā)育到觀測指標的時間。本研究中,由于雜交組合發(fā)育率較低,僅在 5%左右,故實際操作中,很難確定50%個體發(fā)育到觀測指標的時間。另一方面,雜色鮑和盤鮑自繁與雜交胚胎卵裂速度較快,很難同時比較觀測卵裂時間。因此,在細胞期階段,本研究采用連續(xù)間隔取樣的方法,測定授精后不同時間點發(fā)育到特定階段的胚胎數(shù)目,以高斯模型擬合來測定處于不同細胞期時間的平均值和標準差。雖然這里的平均值和標準差不是 50%個體發(fā)育到觀測指標的時間,但能夠反映出不同交配組合胚胎發(fā)育至 2細胞、4細胞、8細胞和 16細胞等時期的速度和同步性。觀察孵化速度時,操作時間比較充裕,可以事先將發(fā)育卵篩選出來進行觀察。用Sigmoidal擬合工具擬合后,可以估算出50%胚胎孵化的時間。

在相同條件下,雜交親本雜色鮑和盤鮑的卵裂周期耗時不同,雜色鮑的一個卵裂周期比盤鮑耗時短約5.3 min。雜交F1胚胎發(fā)育同時含有雜色鮑與盤鮑的基因組[9],本研究結果表明,雜交 F1的卵裂周期表現(xiàn)出較強的母本效應。早期發(fā)育速度的母本效應也見于其他貝類雜交組合,例如大平洋牡蠣Crassostrea gigas與大連灣牡蠣Ostrea talienwhamensis雜交幼體生長速度居于雙親之間與母本接近[10],太平洋牡蠣與葡萄牙牡蠣C.angulata雜交F1生長速度與母本自繁對照組接近[11]。雜交F1發(fā)育早期細胞周期表現(xiàn)出母本效應可能是由于早期胚胎發(fā)育父本基因處于關閉狀態(tài),細胞分裂所需的 RNA和蛋白質是由卵子中貯存物提供。另一方面,SJ和JS雜交F1的有絲分裂周期雖然表現(xiàn)出較強的母本效應,但略慢于母本,導致最終孵化速度明顯慢于母本。這可能是由于雜交 F1中含有兩個細胞周期不一致的基因組,來源于父本的基因組對細胞周期調控產生了影響。異源基因組對細胞周期調控的影響機制有待進一步研究。另外,正反交 F1第一次卵裂速度比雙親都慢。Que等[12]在研究太平洋牡蠣與近江牡蠣C.ariakensis雜交時,也觀察到雜交胚胎第一次卵裂滯后的現(xiàn)象,并用細胞學研究結果進一步證明雜交F1減數(shù)分裂耗時約為親本自繁的 3倍。這些結果揭示,在發(fā)育早期雜色鮑和盤鮑雜交 F1特殊的基因組結構影響減數(shù)分裂進程和細胞周期調控,雜交 F1具有作為減數(shù)分裂和細胞周期調控機制研究模型的潛在價值。

3.2 成活率

雜色鮑×盤鮑雜交 F1在幼體期出現(xiàn)高死亡率,變態(tài)后成活率僅為母本自繁的1.2 %。早期發(fā)育階段成活率低的現(xiàn)象同樣見于其他貝類和魚類遠緣雜交。魏貽堯等[6]研究合浦珠母貝Pinctada martensii、長耳珠母貝P.chemnitzi和大珠母貝P.chemnitzi之間的雜交時,12次雜交試驗中僅有5次獲得極少量貝苗,收苗率只為0.01%～0.04%。草魚Ctenopharyngodon idellus與鯉Cyprinus carpio雜交F1出苗率僅為十萬分之一[13]。也有些雜交后代甚至無法活過幼體階段,如美洲牡蠣C.virginica×近江牡蠣和美洲牡蠣×太平洋牡蠣雜交 F1后代成活率低是雜交不親和的體現(xiàn)。雜交不親和在細胞和分子水平的表現(xiàn)包括：核質不相容、染色體數(shù)目配對和分離紊亂、酶的基因位點或表達的時空順序不同等[14]。雜交不親和的程度大體上與親本的遺傳差異正相關[15]。雖然成活率低下,仍然有少量的雜交鮑苗存活至性成熟。作者[2]已應用AFLP對存活的SJ 雜交F1進行遺傳分析,結果表明存活的雜交 F1不是真正的雜種,而是含有少量父母基因的雌核發(fā)育二倍體。遠緣雜交可能培育異源多倍體、異附加系、易位系等寶貴的遺傳學材料。早期成活率的觀察記錄可以指導進一步研究雜種中異源染色體組的相互作用,例如在快速死亡期可以加密取樣點,便于在DNA水平、RNA水平和細胞水平研究雜交胚胎的變化,以研究染色體行為、異源基因組互作和核質互作。

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