雷帕霉素對糖尿病腎病大鼠的保護作用

馮 欣 李 垚 王雪鷹

糖尿病腎?。―N）是糖尿?。―M）最常見的嚴重微血管并發(fā)癥，一旦腎臟受累出現(xiàn)持續(xù)性蛋白尿，往往不可逆轉(zhuǎn)，并在較短時間內(nèi)進入終末期腎功能衰竭。因此，如何更有效地延緩或阻止DN的進展，具有重要的臨床意義。雷帕霉素（RAPA）是一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，也是安全、有效、低毒的新型免疫抑制劑。近年來動物實驗發(fā)現(xiàn)RAPA不僅有免疫抑制作用，而且能抑制血管平滑肌增生和移行，減輕纖維化反應(yīng)[1]，但是對DN的作用機制及療效觀察尚少見報道。本實驗探討了RAPA對糖尿病大鼠腎臟早期病變的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 成年清潔級SD大鼠36只，體質(zhì)量250～300 g，購自遼寧醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。將36只大鼠用隨機數(shù)字表法分為對照組、糖尿病模型組（糖尿病組）、糖尿病雷帕霉素治療組（雷帕霉素組），每組12只。在造模成功后，雷帕霉素組每天予雷帕霉素1 mg/kg灌胃，對照組和糖尿病組每天予等量生理鹽水灌胃，飼養(yǎng)至4周后處死。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病動物模型的建立 擬造模大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ），溶于0.1 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液中，pH 4.5，65 mg/kg，對照組只注射相當體積的枸櫞酸鹽緩沖液，48 h后尾尖取血，血糖儀測定血糖，尿糖試紙測定尿糖，血糖≥16.7 mmol/L，尿糖+++～++++者確定為糖尿病模型。實驗期間動物自由進食、飲水，不使用胰島素及其他降糖藥物。

1.2.2 實驗試劑 小鼠抗大鼠細胞增殖核抗原（PCNA）抗體（Santa Cruz公司）；小鼠抗大鼠Ⅳ型膠原（COL-Ⅳ）多克隆抗體（SantaCruz公司）；雷帕霉素口服液，1mg/mL（華北制藥集團）。

1.2.3 大鼠血、尿生化指標的測定 每個樣本取20 μL血清和20 μL尿液用日立7170A全自動生化分析儀測定血糖（Glu）、血肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）和尿蛋白（UPro）。

1.2.4 組織學(xué)檢查 腎組織常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋。4 μm石蠟切片用于蘇木素伊紅（HE）、過碘酸雪夫（PAS）染色，光鏡下觀察。

1.2.5 PCNA、COL-Ⅳ蛋白的表達 采用Western blotting法。處死各組大鼠，冰上分離腎皮質(zhì)，剪碎組織，放入80目不銹鋼篩網(wǎng)研磨，不斷用生理鹽水沖洗，然后經(jīng)140目不銹鋼篩網(wǎng)過濾，再經(jīng)200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾，最后收集篩網(wǎng)上物質(zhì)，冷鹽水清洗，4℃、2 000 r/min離心5 min，所得沉淀物經(jīng)光鏡觀察確定95%以上為腎小球。RIPA裂解液裂解細胞，冰浴靜置1 h，然后4℃、14 000 r/min離心25 min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度后，制成蛋白濃度相等的樣品。8%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上垂直電泳（80 V，1 h）。電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上（電壓60 V，3 h）。5%的脫脂奶粉封閉2 h，分別加入PCNA、COL-Ⅳ抗體，孵育過夜，二抗室溫孵育2 h。用顯色液行堿性磷酸酶法顯色。Scinn Corporation分析軟件進行灰度值半定量分析。實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，各組間進行組間單因素方差分析，組間兩兩比較行LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠的一般情況 與對照組相比，糖尿病組大鼠腹腔注射STZ 48 h后，表現(xiàn)為多食、多飲、多尿，毛色晦暗，逐漸出現(xiàn)消瘦及體質(zhì)量減輕。尿糖+++～++++，血糖持續(xù)≥16.7 mmol/L，DM模型成立。給藥4周后，雷帕霉素組大鼠與糖尿病組相比，血糖無明顯減低，而腎質(zhì)量/體質(zhì)量顯著降低，見表1。

2.2 生化指標的變化 各組大鼠給藥4周后，糖尿病組大鼠與對照組相比BUN、Cr及UPro明顯增高（P＜0.05或P＜0.01），而雷帕霉素組上述指標較糖尿病組明顯減輕（均P＜0.05），見表1。

2.3 大鼠腎組織標本病理改變 光鏡下觀察，與對照組相比糖尿病組大鼠腎小球體積增大，系膜基質(zhì)輕度增多，腎小管上皮細胞出現(xiàn)空泡變性，小灶狀萎縮，小動脈管壁輕度增厚，而雷帕霉素組上述改變明顯減輕，見圖1～3。

表1 各組大鼠生化指標和腎質(zhì)量/體質(zhì)量比較（n=12，±s）

表1 各組大鼠生化指標和腎質(zhì)量/體質(zhì)量比較（n=12，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別對照組（1）糖尿病組（2）雷帕霉素組（3）F P（1）∶（2）（1）∶（3）（2）∶（3）Glu（mmol/L）4.12±1.43 28.71±2.38 25.82±2.15 34.77＊＊＜0.001＜0.001 0.413腎質(zhì)量/體質(zhì)量（×10-3）4.22±0.31 9.11±0.52 6.19±0.24 28.43＊0.035 0.046 0.023 BUN（mmol/L）5.24±0.74 14.34±1.85 8.26±0.82 62.56＊0.004 0.056 0.036 Cr（μmol/L）33.32±9.25 103.16±6.28 78.34±5.62 123.12＊＜0.001 0.035 0.019 UPro（g/24 h）6.33±1.84 15.63±2.32 7.31±1.54 50.65＊0.019 0.289 0.028

2.4 Western印跡結(jié)果 與對照組相比，糖尿病組大鼠腎小球PCNA和COL-Ⅳ蛋白表達水平均增高（P＜0.01）。與糖尿病組相比，雷帕霉素治療組大鼠腎小球PCNA和COL-Ⅳ蛋白表達明顯下調(diào)（P＜0.01），而雷帕霉素組與對照組比較，PCNA和COL-IV蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖4、表2。

圖4 各組大鼠PCNA、COL-Ⅳ的蛋白表達

表2 各組大鼠PCNA、COL-Ⅳ的蛋白表達（n=3，±s）

表2 各組大鼠PCNA、COL-Ⅳ的蛋白表達（n=3，±s）

＊＊P＜0.01

組別對照組（1）糖尿病組（2）雷帕霉素組（3）F P（1）∶（2）（1）∶（3）（2）∶（3）PCNA 101.36±0.14 311.34±0.32 133.09±0.56 232.98＊＊＜0.001 0.067＜0.001 COL-Ⅳ223.67±0.17 381.21±0.34 260.68±0.32 487.45＊＊＜0.001 0.125＜0.001

3 討論

DN的發(fā)病機制復(fù)雜，遺傳背景、血流動力學(xué)改變、代謝紊亂、免疫因素均參與發(fā)病過程。越來越多的研究者認為磷脂酰肌醇3激酶（PI3-K）/蛋白激酶B（AKT）/哺乳動物雷帕霉素靶（mammalian target of rapamycin，mTOR）途徑可能是影響DN病程的重要因素[2]。RAPA是從吸水性鏈霉菌發(fā)酵液中提取出來的一種低毒性大環(huán)內(nèi)酯類抗生素[3]，具有抗自身免疫性疾病和抗細胞增殖、預(yù)防移植物血管病變的作用，臨床已用于血管支架涂層和器官移植術(shù)后，以減少排斥反應(yīng)。RAPA進入細胞漿后，首先與FK結(jié)合蛋白（FK binding proteins，F(xiàn)KBP-12）結(jié)合，形成RAPA-FKBP復(fù)合體，該復(fù)合體通過與mTOR氨基酸殘基結(jié)合導(dǎo)致mTOR失活，阻礙其下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[4]。mTOR穩(wěn)定狀態(tài)下主要存在于細胞胞質(zhì)內(nèi)，激活后進入胞核，調(diào)控下游靶分子真核細胞翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白l（4E-BP1）和核糖體40S小亞基S6蛋白激酶，調(diào)控蛋白質(zhì)的合成和細胞周期的演變，參與細胞因子和相應(yīng)受體之間的作用及轉(zhuǎn)導(dǎo)跨膜信號。

RAPA有強大的抗炎、抗增殖、抗纖維化效應(yīng)，在防治腎病中也發(fā)揮重要的作用。Lloberas等[5]研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠組織中磷酸化蛋白激酶B（P-AKT）和mTOR高表達，接受RAPA治療后，上述2個指標表達顯著降低，腎組織纖維連接蛋白水平和肌動蛋白表達也顯著下降，RAPA可以顯著抑制腎臟內(nèi)mTOR通路下游基因表達，延緩糖尿病腎病的進展。另外，動物實驗證實RAPA能緩解膜性腎病中小管間質(zhì)炎癥細胞浸潤和抑制纖維化進程；局灶節(jié)段性腎小球硬化病變早期給予RAPA治療能減弱腎小球硬化，緩解病情進展；RAPA可抑制腎切除后代償性的腎肥大及單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎間質(zhì)纖維化進程[6]。RAPA在體外可抑制生長因子誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞增生，干擾細胞因子介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)[7]。體外實驗證實低劑量RAPA可抑制系膜細胞增殖[8]。Pallet等[9]觀察到RAPA可以明顯抑制腎小管上皮細胞的增殖。

本研究結(jié)果顯示，光鏡下糖尿病組腎小球系膜基質(zhì)增多，基底膜增厚，而雷帕霉素治療組上述病變大大減輕，說明RAPA可以抑制早期糖尿病腎小球的病變。細胞外基質(zhì)的積聚是DN發(fā)生的主要原因，COL-Ⅳ是腎小管基底膜的主要成分，參與構(gòu)成細胞外基質(zhì)。本實驗也發(fā)現(xiàn)RAPA治療組腎臟COL-Ⅳ的表達較糖尿病組減少，說明RAPA可以減少糖尿病大鼠腎臟膠原的合成，進一步阻止細胞外基質(zhì)的積聚，減少間質(zhì)纖維化的發(fā)生。PCNA是一種細胞周期調(diào)節(jié)蛋白，其表達在G1期早期開始上升，S期達最高峰，G2期和M期持續(xù)下降，G0期維持在極低水平，因此可作為腎小管上皮細胞增殖的標志物。本研究顯示糖尿病組大鼠組織中高表達PC?NA，而經(jīng)RAPA治療后PCNA表達顯著降低，可見予RAPA治療后腎小管上皮細胞的增殖明顯被抑制。

RAPA是一種療效好、低毒、無腎毒性的新型免疫抑制劑，本研究提示RAPA可以抑制糖尿病腎病大鼠的細胞增殖，減輕腎硬化，為臨床應(yīng)用RAPA治療糖尿病腎病患者提供了實驗依據(jù)。

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