電針對(duì)嗎啡耐受大鼠辣椒素受體磷酸化水平變化的影響*

黃美娜 鄭宇欣 于泳浩 王國(guó)林

慢性疼痛是臨床常見(jiàn)合并癥，阿片類(lèi)藥物是用于治療急慢性疼痛的重要藥物，除已知的不良反應(yīng)外，長(zhǎng)期應(yīng)用還會(huì)導(dǎo)致阿片耐受和耐受相關(guān)痛覺(jué)過(guò)敏，限制了阿片類(lèi)藥物的臨床應(yīng)用。因此，阿片耐受的細(xì)胞核分子機(jī)制及臨床干預(yù)手段成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。有研究表明辣椒素受體成員-瞬時(shí)受體電位辣椒素亞家族成員1（transient receptor potential vanilloid subfamily member 1，TRPV1）在嗎啡耐受和耐受相關(guān)熱痛覺(jué)過(guò)敏的形成中起著重要作用[1]。針刺鎮(zhèn)痛是傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的瑰寶，臨床實(shí)踐證實(shí)電針是一種有效的鎮(zhèn)痛手段。而對(duì)電針鎮(zhèn)痛機(jī)制的研究已有很多，腦干下行抑制系統(tǒng)、阿片系統(tǒng)、交感神經(jīng)系統(tǒng)均可能參與了電針鎮(zhèn)痛過(guò)程[2-3]，但辣椒素受體的磷酸化過(guò)程是否參與了電針鎮(zhèn)痛過(guò)程尚未明確。本文研究電針對(duì)慢性嗎啡耐受大鼠行為學(xué)的影響及背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)磷酸化TRPV1在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 清潔級(jí)健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠24只，10～12周齡，體質(zhì)量250～280 g，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，安靜環(huán)境中飼養(yǎng)，自由攝食飲水，保持晝夜節(jié)律。熱板、足底觸覺(jué)測(cè)試器（意大利UGO BASILE公司），電針刺激儀LH202N（北京韓氏電針儀器廠）；兔抗大鼠P-TRPV1單克隆抗體（日本COSMO BIO公司）；HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體IgG（美國(guó)Cell Signaling公司）；RIPA裂解緩沖液I（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品）；電化學(xué)發(fā)光溶液（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 動(dòng)物模型建立 參照Yaksh等[4]的方法進(jìn)行鞘內(nèi)置管，置管24 h后，對(duì)未出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的大鼠經(jīng)導(dǎo)管注入2%利多卡因20 μL，如出現(xiàn)雙側(cè)后肢麻痹，則證明導(dǎo)管位于蛛網(wǎng)膜下腔。將大鼠隨機(jī)分為3組，每組8只，于大鼠右后肢踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入完全氟式佐劑（CFA）50 μL，建立CFA模型。模型建立后第4天，開(kāi)始鞘內(nèi)給藥。N組鞘內(nèi)給予生理鹽水10 μL；M組鞘內(nèi)給予嗎啡10 μg（10 μL）；H組除每天鞘內(nèi)給予10 μg嗎啡外，于每天首次給藥后電針刺激大鼠足三里和陽(yáng)陵泉兩穴，電流強(qiáng)度≤2 mA，頻率2 Hz，時(shí)間30 min；給藥時(shí)間為每天早8：00和晚8：00各1次。給藥7 d，第8天將大鼠處死，取致炎側(cè)L4～5背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）進(jìn)行分析。

1.3 機(jī)械痛閾值測(cè)定 每天9：00在室溫（20±2）℃的安靜環(huán)境中測(cè)定，用Von Frey絲參照up-and-down方法測(cè)定大鼠患足50%機(jī)械縮爪閾值（mechanical withdrawal threshold，MWT）[5]。

1.4 熱痛閾值的測(cè)定 用熱板儀（50℃）測(cè)定大鼠致炎后肢縮腳潛伏期（paw withdrawal latency，PWL）。進(jìn)行測(cè)試前所有大鼠進(jìn)行把持訓(xùn)練，開(kāi)始試驗(yàn)后在室溫（20±2）℃的安靜環(huán)境中測(cè)試，每10 min測(cè)定1次，取3次測(cè)定數(shù)值的平均值作為測(cè)定結(jié)果。為防止大鼠燙傷，將PWL上限值定為30 s。

1.5 背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)磷酸化TRPV1（P-TRPV1）表達(dá)的West?ern blotting測(cè)定及分析 于給藥第8天將大鼠用水合氯醛麻醉，小心剪開(kāi)胸腔，暴露心臟。剪開(kāi)右心室，同時(shí)經(jīng)左心室灌注生理鹽水，以減少標(biāo)本上紅細(xì)胞的殘留及測(cè)定蛋白濃度時(shí)的誤差。大鼠處死后，立即暴露脊髓，取出致炎側(cè)L4～5DRG，冰上操作（并保持無(wú)菌），迅速放入液氮保存。將背根神經(jīng)節(jié)放入液氮預(yù)冷的研缽中研碎，加入按比例配好的（含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）RIPA裂解緩沖液。在裂解液中充分勻漿（始終在冰浴中進(jìn)行）。取勻漿4℃靜置30 min，低溫高速離心，12 000×g，10 min重復(fù)2次，取上清液測(cè)定蛋白濃度。蛋白用100℃變性10 min，每個(gè)電泳道中放入30 μg總蛋白（約20 μL），采用8%SDS-PAGE凝膠分離蛋白，轉(zhuǎn)膜。濾膜在室溫下于含有5%脫脂奶粉的TBST溶液中封閉2 h后，一抗4℃孵育過(guò)夜。所得的印跡再在室溫下與辣根過(guò)氧化物酶（HRP）結(jié)合的二抗孵育1 h，在電化學(xué)發(fā)光溶液中顯影30 s～1 min，暴露于X線片上。采用UMAX PowerLook 2100XL掃描圖像，并用Quantity One（美國(guó)Bio-Rad公司）軟件對(duì)Western blotting條帶進(jìn)行灰度分析，記錄其灰度值。蛋白質(zhì)相對(duì)含量的表述方式：TRPV1總蛋白與β-actin條帶光密度的比值表示總蛋白的表達(dá)情況，P-TRPV1與TRPV1總蛋白條帶光密度的比值表示P-TRPV1的表達(dá)情況，按計(jì)量資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0軟件分析數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組內(nèi)比較采用重復(fù)測(cè)量資料方差分析，各組間實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較采用單因素方差分析（one way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)或q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)測(cè)定 與置管后相比，致炎后N組、M組、H組大鼠痛閾均明顯降低（MWT、PWL均P＜0.01）。N組在給予生理鹽水的7 d中痛閾變化不明顯（MWT③∶④、③∶⑤、③∶⑥、④∶⑤、④∶⑥、⑤∶⑥P分別為0.546、0.530、0.536、0.247、0.167、0.263；PWL③∶④、③∶⑤、③∶⑥、④∶⑤、④∶⑥、⑤∶⑥P分別為0.323、0.061、0.058、0.057、0.222、0.601），M、H組大鼠在給予嗎啡后第1天MWT和PWL與N組相比均升高（P＜0.01）；H組在給藥第7天MWT和PWL與M組相比升高（P＜0.01）；M組于給藥后第5天MWT和PWL開(kāi)始較給藥第3天減低（P＜0.01），以后繼續(xù)減低，給藥第7天MWT和PWL仍處于較低水平，見(jiàn)表1～3。

2.2 TRPV1總蛋白及磷酸化蛋白的表達(dá) TRPV1總蛋白：3組間比較F=31.454，P＜0.05，M組表達(dá)明顯高于N組和H組，N組與H組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖1、2。P-TRPV1 3組間比較F=190.877，P＜0.05，M組P-TRPV1表達(dá)明顯多于N組和H組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但N組與H組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖1、3。

3 討論

以往的研究多用單純嗎啡耐受動(dòng)物模型研究慢性嗎啡耐受機(jī)制，這種模型缺少疼痛損傷，與臨床狀況不完全一致。因此筆者以CFA誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠模型為基礎(chǔ)，通過(guò)持續(xù)鞘內(nèi)給予嗎啡，在嗎啡治療炎性痛的背景下形成嗎啡耐受模型，并以此為基礎(chǔ)研究電針在嗎啡耐受形成過(guò)程中的作用。本研究行為學(xué)結(jié)果顯示，關(guān)節(jié)炎大鼠鞘內(nèi)反復(fù)注射嗎啡（M組），在給藥第5天，大鼠熱痛閾和機(jī)械痛閾均明顯降低，第7天仍處于較低水平，提示形成了熱痛覺(jué)過(guò)敏，標(biāo)志炎性痛慢性嗎啡耐受模型建立成功。

表1 各組大鼠MWT比較 （n=8，±s）

表1 各組大鼠MWT比較 （n=8，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；F組間=192.202，F(xiàn)組內(nèi)=341.361，F(xiàn)交互=51.44，均P＜0.001

組別 致炎后3 d②置管后① 給藥N組M組H組F q N∶M N∶H M∶H 21.23±1.90 21.05±2.30 20.78±2.46 0.035 6.72±0.46 6.67±0.59 6.47±0.62 0.26 ------第1天③6.67±0.26 16.86±1.98 20.78±2.46 58.616＊＊15.21＊＊21.06＊＊5.85＊＊第3天④6.90±0.38 15.97±2.06 17.81±1.38 82.029＊＊19.01＊＊22.87＊＊3.85＊組別 給藥F N組M組H組F q N∶M N∶H M∶H第5天⑤6.55±0.37 8.57±0.75 15.49±1.99 28.967＊＊4.23＊20.84＊＊16.13＊＊第7天⑥6.95±0.37 6.38±0.64 13.10±0.97 33.054＊＊2.20 23.74＊＊25.94＊＊417.015＊＊150.69＊＊80.14＊＊----

表2 各組大鼠PWL比較 （n=8，±s）

表2 各組大鼠PWL比較 （n=8，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；F組間=81.196，F(xiàn)組內(nèi)=564.246，F(xiàn)交互= 69.446，均P＜0.001

給藥組別 置管后① 致炎后3 d②N組M組H組F q N∶M N∶H M∶H 17.10±0.67 17.31±0.77 16.82±0.89 0.38 10.58±0.61 11.33±0.88 10.73±0.82 0.46 ------第1天③9.40±0.81 14.56±0.88 15.43±0.75 50.09＊＊15.03＊＊17.58＊＊3.76＊第3天④8.75±0.86 13.83±0.75 14.14±0.91 62.09＊＊15.97＊＊17.84＊＊1.03組別 給藥F N組M組H組F q N∶M N∶H M∶H第5天⑤7.64±0.61 8.57±0.86 12.84±0.94 57.80＊＊2.28 23.74＊＊19.49＊＊第7天⑥7.85±0.53 7.11±0.80 11.56±0.87 35.23＊＊3.03 15.21＊＊18.24＊＊308.305＊＊213.689＊＊173.897＊＊----

表3 嗎啡耐受組（M組）各指標(biāo)組內(nèi)比較P值

圖1 各組DRG內(nèi)P-TRPV1和TRPV1總蛋白Western blotting結(jié)果

圖2 TRPV1總蛋白灰度值

圖3 P-TRPV1灰度值

TRPV1是一種非選擇性陽(yáng)離子通道，廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)，它在炎性痛、熱痛覺(jué)過(guò)敏、機(jī)械性痛覺(jué)異常、神經(jīng)病理痛的形成過(guò)程中起著重要作用。像許多離子通道一樣，TRPV1通道的功能能被磷酸化/去磷酸化過(guò)程所調(diào)節(jié)，TRPV1存在著以Ser502和Ser800為主的若干蛋白激酶C（PKC）磷酸化位點(diǎn)，PKC通過(guò)這些位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)對(duì)TRPV1的磷酸化過(guò)程[6]。Premkumar等[7]發(fā)現(xiàn)PKC能夠在缺乏其他激動(dòng)劑的條件下單獨(dú)誘導(dǎo)激活TRPV1，同時(shí)能增強(qiáng)TRPV1對(duì)辣椒素的反應(yīng)，提示PKC能促進(jìn)TRPV1活化并增強(qiáng)其功能。CFA所致炎癥情況下，感覺(jué)神經(jīng)纖維末梢釋放谷氨酸（Glu）、P物質(zhì)（SP）等興奮性氨基酸及神經(jīng)多肽，激活相應(yīng)興奮性氨基酸和神經(jīng)激肽受體，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞產(chǎn)生第二信使。離子型興奮性氨基酸受體（NMDA）活化后，刺激Ca2+內(nèi)流從而激活PKC，進(jìn)而磷酸化TRPV1參與炎性痛的形成，這也解釋了為什么實(shí)驗(yàn)中N組大鼠在單純炎癥情況下會(huì)存在磷酸化形式的TRPV1。

本實(shí)驗(yàn)中TRPV1總蛋白水平M組＞H組＞N組，與Chen等[1]的研究結(jié)果不一致。在Chen等的研究中，嗎啡耐受組大鼠DRG中TRPV1表達(dá)量用Western blotting方法檢測(cè)與非嗎啡耐受組無(wú)明顯差別，而免疫組化結(jié)果示嗎啡組TRPV1表達(dá)增高，其原因在于Western blotting為半定量檢測(cè)手段，敏感性低，不能顯示細(xì)微差別。但其研究基于單純嗎啡耐受模型，沒(méi)有慢性炎癥的基礎(chǔ)，因此筆者認(rèn)為，本研究中嗎啡組TRPV1總蛋白增高的原因，在于模型具有慢性炎癥和嗎啡耐受共同參與的復(fù)雜性。然而從磷酸化TRPV1占TRPV1的百分比來(lái)看，嗎啡組TRPV1磷酸化水平仍然高于其他2組，說(shuō)明嗎啡耐受情況下，TRPV1磷酸化水平增高。

嗎啡是臨床常用的鎮(zhèn)痛藥物，但長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)導(dǎo)致耐受和耐受相關(guān)熱痛覺(jué)過(guò)敏。嗎啡耐受的機(jī)制尚未完全清楚，但研究發(fā)現(xiàn)蛋白激酶途徑在嗎啡耐受過(guò)程中同樣起著重要作用[8-9]。研究表明，通過(guò)RNA干擾技術(shù)干擾PKCγ基因表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)慢性嗎啡耐受的形成[10]。本研究結(jié)果顯示，M組背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)TRPV1磷酸化水平明顯增高，進(jìn)一步證明，長(zhǎng)期嗎啡給藥導(dǎo)致了激酶活性增加，從而增加了TRPV1的磷酸化水平，同時(shí)此結(jié)果也可解釋行為學(xué)結(jié)果中M組在給藥第5天至第7天熱痛閾值較前明顯降低的原因，即熱痛覺(jué)過(guò)敏形成的原因在于DRG內(nèi)TRPV1的磷酸化水平增加，說(shuō)明TRPV1磷酸化過(guò)程在嗎啡耐受的形成中起了重要作用。

針刺鎮(zhèn)痛是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的瑰寶，療效已得到國(guó)內(nèi)外研究者的肯定。在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的電針療法，在臨床治療中也取得了顯著的成果。有研究表明，電針鎮(zhèn)痛有著穴位特異性，雙側(cè)足三里電針刺激可明顯延長(zhǎng)縮爪時(shí)間，而手三里和內(nèi)關(guān)穴則無(wú)此效果[11]。因此本研究選擇大鼠雙側(cè)足三里和陽(yáng)陵泉作為電針鎮(zhèn)痛的穴位。與形成嗎啡耐受的M組大鼠相比，給藥第7天H組大鼠MWT和PWL升高，提示H組大鼠尚未形成嗎啡耐受，說(shuō)明電針對(duì)嗎啡耐受的形成具有緩解作用。H組DRG內(nèi)磷酸化TRPV1表達(dá)少于M組，筆者可認(rèn)為電針刺激通過(guò)抑制TRPV1的磷酸化而緩解嗎啡耐受的形成。

綜上所述，本研究以CFA誘導(dǎo)的炎癥大鼠模型為基礎(chǔ)，通過(guò)持續(xù)鞘內(nèi)給藥建立慢性嗎啡耐受模型，并證明嗎啡耐受情況下大鼠背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)TRPV1磷酸化水平增加，而電針能抑制TRPV1的磷酸化，從而緩解嗎啡耐受的形成，但電針是通過(guò)怎樣的機(jī)制抑制TRPV1的磷酸化，仍有待進(jìn)一步研究。

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