Wnt/β-Catenin信號通路與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制的研究*

王超華 張子博 朱 梅 劉 軍 任凱晶 盧 飚 李鳳翱 邱明才

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種退行性骨關(guān)節(jié)疾病，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為OA的發(fā)病與白細(xì)胞介素-1、腫瘤壞死因子等細(xì)胞因子及基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）等蛋白酶類產(chǎn)生過多有關(guān)，但在臨床上應(yīng)用抗炎藥物及蛋白酶抑制劑治療OA并沒有取得很好的療效。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)的Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在OA的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用[1]。本研究旨在探討OA與Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系，并進(jìn)一步明確OA的發(fā)病機(jī)制，為OA的早期診斷和病情判斷提供參考，也為進(jìn)一步治療和預(yù)防OA提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 研究組：按照2007年中華醫(yī)學(xué)會骨科分會公布的最新骨關(guān)節(jié)炎診治指南確定的膝關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)，選擇2009年10月—2010年7月于天津市天津醫(yī)院關(guān)節(jié)中心和天津市人民醫(yī)院關(guān)節(jié)外科行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的骨關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本，共42例，其中男6例，女36例，年齡50～77歲，平均（62.88±7.97）歲。研究組患者術(shù)前X線表現(xiàn)為關(guān)節(jié)間隙變窄、甚至消失，關(guān)節(jié)面硬化變形，關(guān)節(jié)邊緣骨贅形成，關(guān)節(jié)軟骨下囊性改變，關(guān)節(jié)失穩(wěn)。根據(jù)影像學(xué)資料，研究組中度病變5例，中度偏重病變20例，重度病變17例。術(shù)中大體病理可見關(guān)節(jié)軟骨組織磨損嚴(yán)重，甚至消失，以內(nèi)側(cè)為著，骨骼邊緣可見大量骨贅形成。對照組：取自天津醫(yī)科大學(xué)解剖學(xué)教研室無償提供的膝關(guān)節(jié)標(biāo)本，根據(jù)肉眼觀察及病理評分結(jié)果排除退行性變、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及腫瘤性病變，共8例。

1.2 主要試劑 兔抗人β-catenin多克隆抗體（美國Cell Sig?naling公司）。0.4%胃蛋白酶消化液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。兔抗人MMP-13多克隆抗體、5%正常山羊血清封閉液、生物素化山羊抗兔IgG、辣根酶標(biāo)記鏈親和素（SABC）、3，3-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。Trizol、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Oligo（DT）、Buffer（美國Invitro?gen公司）。SYBR?Green Master Mix（日本Toyobo公司）。

1.3 方法

1.3.1 病理學(xué)觀察 根據(jù)情況每例患者及對照組分別取3～6個不同病變部位的膝關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本，所取部位分別為脛骨內(nèi)側(cè)、脛骨外側(cè)、股骨內(nèi)側(cè)髁、股骨外側(cè)髁、股骨后髁、股骨前髁，軟骨已全部磨損的部位未取得標(biāo)本。所取標(biāo)本全部以10%中性福爾馬林溶液固定72 h，于30%甲酸混合液（30%甲酸+10%中性福爾馬林+60%雙蒸水）中脫鈣14 d，常規(guī)脫水，石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片。分別采用以下3種染色方法：HE染色、番紅O/固綠（SO/FG）染色和阿辛藍(lán)/橙黃G（AB/OG）染色，并根據(jù)改良的Mankin關(guān)節(jié)軟骨病理評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級評定。結(jié)構(gòu)：正常0分，表層破壞1分，血管翳及表層破壞2分，淺層裂隙形成達(dá)移行層3分，裂隙局限性深達(dá)骨質(zhì)輻射層4分，深達(dá)骨質(zhì)鈣化層缺損負(fù)重區(qū)5分，全層軟骨缺損6分。細(xì)胞：正常0分，細(xì)胞過多、紊亂1分，細(xì)胞成簇2分，細(xì)胞少3分。SO/FG染色：正常0分，輕度失染1分，中度失染2分，重度失染3分，完全失染4分。潮線的完整性：完整0分，不完整、有血管通過1分?？偡?～14分。正常（0～2分），輕度病變（3～7分），中度病變（8～11分），重度病變（12～14分）。

1.3.2 免疫組化 應(yīng)用免疫組織化學(xué)卵白素-生物素復(fù)合技術(shù)（Avidin-Biotin complex method，ABC）分別檢測軟骨細(xì)胞中β-catenin及MMP-13的表達(dá)情況。

1.3.3 定量PCR 標(biāo)本離體后，快速于無菌條件下分別留取與病理取材部位相一致處的關(guān)節(jié)軟骨組織，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｃ坷颊叻謩e選取2個標(biāo)本，根據(jù)病理評分結(jié)果分為輕度病變組36例次和中度病變組48例次。分別提取其總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用Real Time RT-PCR的方法，選用β2微球蛋白（beta-2-microglobulin，β2m）作為內(nèi)參，檢測骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，bmp-2）、Ⅹ型膠原（typeⅩcollagen，col-10）及mmp-13基因的表達(dá)水平。β2m上游5-TGAGTATGCCTGCCGTGTG-3，下游5-AAAGCAAGC AAGCAGAATTTG-3；bmp-2上游5-GTGGACTTCAGTGACG TGG-3，下游5-ACCAACGTCTGAACAATGG-3；col-10上游5-TGCTAGTATCCTTGAACTTGG-3，下游5-ACCTTGCT CTCCTCTTACTG-3；mmp-13上游5-ATGCCATTACCAGTC TCCG-3，下游5-TGCAGCATCAATACGGTTG-3，以上引物均由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃30 s，52℃～56℃30 s，72℃30 s，進(jìn)行35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，β2m、bmp-2、col-10、mmp-13退火溫度分別為56℃、56℃、52℃、54℃。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測序也由上述公司完成。Real Time RT-PCR結(jié)果直接得到各個基因的Ct值，用同一標(biāo)本目的基因的Ct值減去β2m基因的Ct值得出△Ct。用輕度病變組的△Ct值減去中度病變組的△Ct值得出△△Ct，通過2-△△Ct法計(jì)算出各目的基因在輕度病變組與中度病變組表達(dá)的差異。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，計(jì)數(shù)資料以例表示。輕度病變組△Ct值與中度病變組△Ct值的比較行兩獨(dú)立樣本資料t檢驗(yàn)，免疫組化結(jié)果行χ2檢驗(yàn)或確切概率法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理結(jié)果 對照組鏡下可見軟骨組織表面完整，結(jié)構(gòu)清晰，潮線完整，軟骨細(xì)胞呈極性排列。研究組可見軟骨表面不同程度破壞；軟骨細(xì)胞肥大增生，排列紊亂，細(xì)胞成簇，以至減少消失；潮線斷裂，可見新生血管通過并連通骨髓腔等改變，見圖1。改良的Mankin關(guān)節(jié)軟骨病理評分為對照組8例均正常；研究組輕度病變15例，中度病變27例。

2.2 免疫組化結(jié)果 β-catenin和MMP-13免疫組化陽性結(jié)果均顯示細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)有棕色顆粒樣沉著，陰性結(jié)果則無，見圖2。β-catenin免疫組化結(jié)果顯示正常組與輕度病變組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），其余均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；MMP-13免疫組化結(jié)果示正常組與輕、中度病變組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），輕度病變組與中度病變組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.3 PCR結(jié)果 42例患者每例均取2個標(biāo)本，輕度病變組36例，中度病變組48例。輕度病變組bmp-2、col-10、mmp-13的表達(dá)水平分別為中度病變組的3.01、2.89和4.04倍。2組各目的基因△Ct值比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見表2。

圖2 β-catenin、MMP-13免疫組化結(jié)果

表1 3組β-catenin、MMP-13免疫組化結(jié)果（例）

表2 2病變組基因表達(dá)水平比較 （△Ct，±s）

表2 2病變組基因表達(dá)水平比較 （△Ct，±s）

＊＊P＜0.01

組別輕度病變組中度病變組t n 36 48 2-△△CT bmp-2 2.18±2.08 3.77±1.60 3.965＊＊3.01 col-10 2.61±1.71 4.14±1.69 4.088＊＊2.89 mmp-13 0.68±1.99 2.69±1.94 4.647＊＊4.04

3 討論

OA是中老年人常見疾病，國內(nèi)40歲以上人群中X線診斷的OA總患病率達(dá)27.8%[2]。OA的發(fā)病與性別、年齡、遺傳、肥胖、炎癥、創(chuàng)傷等因素均有關(guān)，其病理生理改變?yōu)殛P(guān)節(jié)軟骨組織的合成與分解代謝失衡，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞過度成熟、骨贅形成、關(guān)節(jié)軟骨破壞及關(guān)節(jié)間隙變窄。而這一失衡又是炎癥因子、細(xì)胞外基質(zhì)成分、基質(zhì)蛋白酶及多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路共同作用的結(jié)果。

有研究表明，MMPs和細(xì)胞因子在關(guān)節(jié)軟骨的破壞中起著重要作用[3]，其確切的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚。而最新的研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控著MMPs和BMP家族基因的表達(dá)水平[4]。Zhu等[5]通過小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，β-catenin的過度表達(dá)會使小鼠膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)OA樣改變，并使軟骨細(xì)胞中mmp-9、mmp-13以及bmp-2基因的表達(dá)明顯增加。另有研究發(fā)現(xiàn)，對體外培養(yǎng)的兔關(guān)節(jié)軟骨應(yīng)用Wnt-3A激活Wnt/β-catenin信號，能引起強(qiáng)烈的明膠酶的活性，并增加mmp-3和mmp-13基因的表達(dá)[6]。以上研究說明Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在OA的發(fā)病機(jī)制中起著非常重要的作用。本研究中bmp-2、col-10和mmp-13均為軟骨細(xì)胞成熟的標(biāo)志性基因，同時(shí)為Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)通路的下游基因。

BMP參與調(diào)控軟骨細(xì)胞的譜系分化、增殖、成熟、凋亡和礦化，可以增加下游效應(yīng)因子run域因子（run domain factor-2，Runx 2）的表達(dá)，而后者能夠誘導(dǎo)增殖型軟骨細(xì)胞進(jìn)一步分化為肥大型軟骨細(xì)胞。木瓜蛋白酶誘發(fā)的OA小鼠模型發(fā)現(xiàn)，滑膜與軟骨組織中BMP的含量明顯增加，BMP抑制劑可以逆轉(zhuǎn)OA骨贅的形成[7]。軟骨內(nèi)成骨過程終結(jié)后，bmp的過度表達(dá)則會誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞肥大、分化、軟骨內(nèi)成骨、礦化以及骨贅形成。Blaney等[8]研究發(fā)現(xiàn)，給小鼠注射腺病毒Ad-BMP-2，使bmp-2 mRNA的表達(dá)增高，能促進(jìn)小鼠膝關(guān)節(jié)形成骨贅，同時(shí)發(fā)現(xiàn)BMP-2的抑制劑能夠抑制其骨贅的形成。在機(jī)械性損傷所致的膝關(guān)節(jié)OA的軟骨細(xì)胞中，亦發(fā)現(xiàn)bmp-2的mRNA表達(dá)上調(diào)[9]。這些研究表明BMP-2在關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)成骨，骨贅形成中起著重要的作用。最新的研究發(fā)現(xiàn)，OA患者外周血中BMPs和轉(zhuǎn)錄因子Runx 2的表達(dá)明顯增加，BMPs和轉(zhuǎn)錄因子Runx 2可以作為判斷疾病的活動性及其對治療反應(yīng)的指標(biāo)[10]。

COL-10以液態(tài)均相的形式分布于細(xì)胞外基質(zhì)中，通常存在于生長發(fā)育期的軟骨內(nèi)，由肥大的軟骨細(xì)胞合成，因此通常把COL-10作為軟骨細(xì)胞肥大的標(biāo)志。骨生長停止后，COL-10也隨之消失。然而在病理狀態(tài)下，本應(yīng)該終生維持未分化狀態(tài)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞肥大，并表達(dá)COL-10，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞過度成熟、軟骨內(nèi)成骨、膠原降解、骨贅形成。與正常成人關(guān)節(jié)軟骨相比，COL-10可以在大部分OA的關(guān)節(jié)軟骨中檢測到，多分布于軟骨細(xì)胞團(tuán)周圍，也可見于骨贅中[11]。Zhu等[5]發(fā)現(xiàn)β-catenin過度表達(dá)的小鼠，col-10的mRNA的表達(dá)量是對照組的3倍。這提示W(wǎng)nt/β-catenin信號通路對col-10的表達(dá)有調(diào)控作用。

MMP-13是目前已知的MMPs中最有效的Ⅱ型膠原降解酶。mmp-13基因的過度表達(dá)會造成關(guān)節(jié)軟骨的破壞。研究發(fā)現(xiàn)mmp-13基因高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠，可出現(xiàn)類似OA樣的病理改變[12]。新近的研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號通路在其中起著關(guān)鍵的作用[5,13]，β-catenin的過度表達(dá)能夠增加mmp-13基因的表達(dá)，導(dǎo)致軟骨基質(zhì)降解，關(guān)節(jié)軟骨破壞。低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5（low-density lipoprotein receptor-related protein 5，LRP5）是Wnt/β-catenin通路的關(guān)鍵蛋白，其抑制劑能夠使OA軟骨細(xì)胞mmp-13 mRNA的表達(dá)量明顯下降[14]。

本研究結(jié)果顯示OA患者軟骨細(xì)胞中MMP-13蛋白的表達(dá)明顯增加，作為其上游信號通路β-catenin的表達(dá)也有所增加，但陽性率較低，可能與所取標(biāo)本輕度病變例數(shù)較少及β-catenin增加是OA早期的標(biāo)志有關(guān)。另外，通過Real Time RT-PCR的方法表明OA患者輕度病變組bmp-2、col-10和mmp-13基因的表達(dá)水平較中度病變組增加，提示W(wǎng)nt/β-catenin信號傳導(dǎo)通路與OA早期的發(fā)生有著密切關(guān)系，β-catenin可以作為信號傳導(dǎo)通路上游表達(dá)的針對性治療靶點(diǎn)，但β-catenin對它們的具體作用機(jī)制和軟骨細(xì)胞特征性基因在整個疾病過程中的表達(dá)變化尚有待進(jìn)一步的研究。

[1]Corr M.Wnt-beta-catenin signaling in the pathogenesis of osteoar?thritis[J].Nat Clin Pract Rheumatol,2008,4(10):550-556.

[2]王偉，王坤正，黨小謙，等.中老年人人群骨關(guān)節(jié)炎的流行病學(xué)研究[J].中國老年學(xué)雜志,2007,27(6):566-568.

[3]Burrage PS,Mix KS,Brinckerhoff CE.Matrix metalloproteinases:role in arthritis[J].Front Biosci,2006,11(6):529-543.

[4]Kawaguchi H.Regulation of osteoarthritis development by Wnt-be?ta-catenin signaling through the endochondral ossification process [J].J Bone Miner Res,2009,24(1):8-11.

[5]Zhu M,Tang D,Wu Q,et al.Activation of beta-catenin signaling in ar?ticular chondrocytes leads to osteoarthritis-like phenotype in adult beta-catenin conditional activation mice[J].J Bone Miner Res, 2009,24(1):12-21.

[6]Yuasa T,Otani T,Koike T,et al.Wnt/beta-catenin signaling stimu?lates matrix catabolic genes and activity in articular chondrocytes: its possible role in joint degeneration[J].Lab Invest,2008,88(3): 264-274.

[7]Scharstuhl A,Vitters EL,Van der Kraan PM,et al.Reduction of os?teophyte formation and synovial thickening by adenoviral overex?pression of transforming growth factor beta/bone morphogenetic pro?tein inhibitors during experimental osteoarthritis[J].Arthritis Rheum, 2003,48(12):3442-3451.

[8]Blaney Davidson EN,Vitters EL,van Beuningen HM,et al.Resem?blance of osteophytes in experimental osteoarthritis to transforming growth factor beta-induced osteophytes:limited role of bone mor?phogenetic protein in early osteoarthritic osteophyte formation[J]. Arthritis Rheum,2007,56(12):4065-4073.

[9]Dell'Accio F,De Bari C,El Tawil NM，et al.Activation of WNT and BMP signaling in adult human articular cartilage following mechani?cal injury[J].Arthritis Res Ther,2006,8(5):R139.

[10]Grcevic D,Jajic Z,Kovacic N,et al.Peripheral blood expression profiles of bone morphogenetic proteins,tumor necrosis factor-su?perfamily molecules,and transcription factor Runx2 could be used as markers of the form of arthritis,disease activity,and therapeutic responsiveness[J].J Rheumatol,2010,37(2):246-256.

[11]Goldring MB,Goldring SR.Articular cartilage and subchondral bone in the pathogenesis of osteoarthritis[J].Ann N Y Acad Sci,2010, 1192(3):230-237.

[12]Neuhold LA,Killar L,Zhao W,et al.Postnatal expression in hyaline cartilage of constitutively active human collagenase-3(MMP-13)in?duces osteoarthritis in mice[J].J Clin Invest,2001,107(1):35-44.

[13]Nakashima A,Tamura M.Regulation of matrix metalloproteinase-13 and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1 gene expression by WNT3A and bone morphogenetic protein-2 in osteoblastic dif?ferentiation[J].Front Biosci,2006,11(5):1667-1678.

[14]Papathanasiou I,Malizos KN,Tsezou A.Low-density lipoprotein re?ceptor-related protein 5(LRP5)expression in human osteoarthritic chondrocytes[J].J Orthop Res,2010,28(3):348-353.